专利名称：一种水稻萜烯合成酶，编码其的基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物分子生物学领域，特别涉及一种水稻萜烯合成酶，编码其的基因及其应用。
背景技术：
植物的间接防御反应首次是在玉米上被发现的(Turlings et al.，1990)，这种防御反应的特点是被植食性昆虫取食之后，植物依靠特异性挥发物的释放来吸引昆虫的天敌，从而达到防御植食性昆虫的目的。许多植物在被植食性昆虫取食之后可以提高特异性挥发物释放的量，一些植食性昆虫诱导的挥发物可以吸引植食性昆虫的天敌(捕食性或寄生性)，这些挥发物就成为植物间接防御的媒介(信号)物质，所以植物间接防御研究的核心是植物特异性的挥发性信号物质及其调控机制(Takabayashi and Dicke, 1996 ； Pichersky and Gershenzon, 2002 ；Dudareva et al.，2006)。相对于已经有一定研究基石出的生态方面的研究，植物间接防御反应在分子生物学方面的研究还是刚刚起步的。利用分子生物学技术以及转基因技术研究植物特异性的挥发物可以最大程度的去除背景干扰，容易地找到植食性昆虫诱导后表达量特异性上升的挥发物。目前植物间接防御反应在分子生物学方面的研究主要进行以下两方面一方面是有多少基因直接参与植食性昆虫诱导后， 植物特异性挥发物的生物合成；另一方面是这些基因怎样调控挥发物的合成，产物是什么以及这些产物具有什么样的作用等等(Yuanet al.，2008)。植物萜烯(单萜烯、倍半萜烯、双萜烯)类化合物是植物在被植食性昆虫诱导后最常见，最多样的植物挥发物类群(Pare and Tumlinson，1999)。一些特定种类的萜烯化合物在植物间接防御方面的功能，已经通过人工合成标准化合物，从生态学方面进行了研究 (Kessler and Baldwin，2001)。在基因水平上，从调控植物萜烯合成酶基因的表达出发， 也验证了部分萜烯化合物在植物间接防御方面的功能(Kappers et al. ,2005 ；Schnee et al.，2006)。所有的萜烯化合物都是由萜烯合成酶调控合成的，萜烯合成酶是合成植物萜烯类挥发物末端合成酶。因此，研究萜烯合成酶以及萜烯合成酶基因对于确定植食性昆虫诱导的植物特异性挥发物具有重要意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种水稻萜烯合成酶，编码其的基因及其应用。为实现上述目的，本发明首先提供一种水稻萜烯合成酶Ostps，其为由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。因此，本发明水稻萜烯合成酶还包括由SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由SEQ ID N0. 2所示的蛋白质衍生的蛋白质。优选的，衍生蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列的同源性可为
370%以上，优选80%以上，更优选90%以上。本发明还提供编码上述蛋白的基因。优选的，本发明提供的编码水稻萜烯合成酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。本发明还提供的含有水稻萜烯合成酶基因的载体、宿主细胞及宿主菌均属于本发明的保护范围。其中，优选的宿主细胞为植物宿主细胞。当1-2龄二化螟幼虫取食水稻时，水稻会上调基因Ostps的表达量，此基因及其产物可以帮助水稻更加吸引二化螟绒茧蜂雌虫，从而水稻依靠自身的间接防御机制抵抗二化螟的取食。
图1为构建消减文库的水稻总RNA电泳图，(A) 二化螟诱导水稻不同时间段的总 RNA电泳图，(B)没有经过二化螟诱导的水稻不同时间段的总RNA电泳图。图2为构建消减文库的水稻mRNA电泳图。1 :Takara 2000bpmarker ；2 对照水稻总RNA纯化后的mRNA ；3 二化螟诱导水稻后总RNA纯化后的mRNA。图3为反向Northern斑点杂交图谱。A由经过水稻抑制性消减文库正向文库合成的探针杂交后的图谱；B由经过水稻抑制性消减文库反向文库合成的探针杂交后的图谱；C 由二化螟诱导的水稻总RNA未经过消减杂交合成探针杂交后的图谱；D没有经过二化螟诱导的水稻总RNA未经过消减杂交合成探针杂交后的图谱。图4为目的片段构建过程图。图5为RNA干扰载体pTCK303-RNAi-0stps连接成功后的酶切电泳图谱。1 =Takara 2000bp Marker ；2 基因 Ostps干扰片段的PCR产物；3 :pMD-18T-simple_0stps BamH I/Kpn I 双酶切产物；4 :pTCK303-RNAi-0stps-Sac I/Spe I 双酶切；5 :pTCK303-RNAi_0stpsSac I/Spe I 双酶切；6 :pTCK303-RNAi-0stps BamH Ι/Κρη I 双酶切；7 :pTCK303-RNAi_0stps Sac I 单酶切产物；8 :pTCK303-RNAi-0stpsSpe I 单酶切产物；9 :pTCK303-RNAi_0stps Sac Ι/Κρη I 双酶切产物；10 :pTCK303-RNAi-0stps Kpn I 单酶切产物。图6为分蘖期Tl代转基因水稻的Southern blot分子检测图，(A)为转空载体对照阳性植株Southern blot杂交图谱。杂交探针为RNA干扰载体pTCK303上的Hyg-B片段。图7为Tl代转基因水稻抗性植株的⑶S活性检测图。A为转基因水稻幼苗的⑶S 活性检测；B为转基因水稻叶片的GUS活性检测；C为转基因水稻叶鞘的GUS活性检测；D为转基因水稻茎杆的GUS活性检测；E为转基因水稻根部的GUS活性检测；F为转基因水稻刚发芽种子的GUS活性检测。图8为分蘖期Tl代转基因水稻植株的Northern blot检测图。A为七种水稻品系叶片组织Northern blot杂交图；B为七种水稻品系叶鞘组织Northern blot杂交图；WT 为野生型对照植株，VC为转空载体对照植株，Ril 5为RNA干扰基因Ostps的转基因水稻植株。图9为分蘖期Tl代转基因水稻植株的荧光定量PCR检测图。A为七种水稻品系叶片组织荧光定量PCR检测图；B为七种水稻品系叶鞘组织荧光定量PCR检测图；WT为野生型对照植株，VC为转空载体对照植株，Ril 5为RNA干扰基因Ostps的转基因水稻植株。图10为二化螟绒茧蜂雌虫的行为选择实验(对于转空载体对照植株与沉默水稻基因Ostps的阳性水稻植株)，N为成功作出选择的二化螟绒茧蜂雌虫的数量；NR为不选择的二化螟绒茧蜂雌虫的数量；VC为转空载体对照的水稻株系；RNAi3 5为沉默基因Ostps 的单拷贝转基因阳性水稻株系。图11为二化螟绒茧蜂雌虫的行为选择实验(对于转空载体对照植株与野生型对照植株)。N为成功作出先择的二化螟绒茧蜂雌虫的数量，NR为不选择的二化螟绒茧蜂雌虫的数量；WT为野生型对照株系；VC，为转空载体对照的水稻株系。图12为二化螟绒茧蜂雄虫的行为选择实验(对于转空载体对照植株与沉默水稻基因Ostps的阳性水稻植株)。N为成功作出先择的二化螟绒茧蜂雄虫的数量；VC为转空载体对照的水稻株系；RNAi3 5为沉默基因Ostps系的单拷贝转基因阳性水稻株。图13为二化螟绒茧蜂雄虫的行为选择实验(对于转空载体对照植株与野生型对照植株)。N为成功选择的二化螟绒茧蜂雄虫的数量；VC为转空载体对照的水稻株系；WT为野生型对照株系。图14为分蘖期转空载体水稻对照植株的挥发物气质联用图谱。图15为分蘖期沉默基因Ostps的水稻阳性植株的挥发物气质联用图谱。图16为柠檬烯(limonene)标准样品气质联用图谱。图17为(E) - β -法尼烯((E) - β -farnesene)标准样品气质联用图谱。图18为分蘖后期沉默基因Ostps的水稻阳性植株的挥发物气质联用图谱。图19为分蘖后期野生型对照水稻植株的挥发物气质联用图谱。图20为分蘖后期转空载体对照植株的挥发物气质联用图谱。图21为水稻种植的花盆及土样的挥发物气质联用图谱。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1构建水稻抑制性消减cDNA文库将水稻日本晴进行二化螟取食危害处理当日上午10时，将1-2龄二化螟幼虫接到长势相同的水稻叶鞘，计12株，每株接10头，设置12株长势相同的不接虫水稻作为对照。分别在接虫lh、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、12h、Mh、36h、72h收集植株的叶鞘组织，同时收集对应时间对照叶鞘组织。将处理的水稻叶片在液氮中研磨，利用Trizol提取RNA，电泳检测RNA的质量(见图1)，分光光度计测定RNA的浓度，分离纯化出mRNA(见图2、。根据 Clontech公司的PCRIelect cDNA Subtraction kit的方法进行抑制差减杂交，电击转化感受态细胞(Electro MAXTMDH5 α -ETM Cells)，菌液检测文库重组率及插入片段的大小。 进行反向Northern斑点杂交(见图3)，选取差异表达克隆，并对差异性表达的cDNA克隆测序，得到水稻萜烯合成酶基因Ostps的cDNA片段。实施例2获得Ostps cDNA全长利用Trizol提取野生型水稻日本晴的RNA，电泳检测RNA的质量，分光光度计测定RNA的浓度，分离纯化mRNA。根据消减文库得到的水稻基因Ostps的cDNA片段设计合成特异性引物Gspl :5，-TTCAAAGAGCTGTTCAAGATA-3，(SEQ ID No. 5), Gsp2 5‘-TCTTTCCACCATCGTGTGATA-3‘ (SEQ ID No. 6)，用于 RACE-PCR 反应，利用 RACE 试剂盒(购自Initrogen公司)获得基因全长，序列如SEQ ID No. 1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。实施例3鉴定水稻萜烯合成酶基因在水稻防御害虫取食过程中的功能根据消减文库得到的水稻基因Ostps cDNA片段设计引物tRi，正向引物tRiF 5，-tcaggtaccactagttCTACACGAAACGAATCCATA-3' (SEQ ID No. 3)，含 KpnI 和 SpeI 酶切位点；反向引物 tRiR :5，-catggatccgagctcAGTTCCAGGTGTTCCTCTAT-3，(SEQ ID No. 4)，含 BamHI和McI酶切位点。以水稻日本晴cDNA为模板扩增Ostps基因片段。利用胶回收试剂盒(Axygen公司)回收目的片段并连入pMD_18T simple克隆载体(Takara公司)构建成 pMD-18T-simple-0stps (图 4)，并测序。采用AxyPerp质粒DNA小量提取试剂盒提取pMD-18T-simple-0stps，分别用BamHI和Kpnl、SpeI和McI双酶切，双酶切后，将酶切产物电泳检测，并凝胶回收目的片段。用SpeI和McI双酶切pTCK303载体，回收载体片段后与前述用相同酶酶切pMD-lST-simple-Ostps回收的目的片段进行连接，构建成TPS反向连接的 pTCK303-RNAi-0stps-。将构建的 pTCK303-RNAi_0stps-用 BamHI 和 Kpn I 双酶切，回收载体片段，与前述用相同酶酶切pMD-lST-simple-Ostps回收的目的片段相连，构建成 pTCK303-RNAi-0stpso经农杆菌EHA105介导，将水稻基因Ostps的RNA干扰载体pTCK303-RNAi_0stps 和pTCK303空载体分别导入水稻愈伤组织中。每个品系获得30株以上的TO代转基因植株，即转空载体对照品系，RNA干扰水稻基因Ostps的pTCK303-RNAi-0stps品系，并收获了大量的TO代转基因种子。种植得到Tl代转基因植株，进行Southern blot检测(图6)，并进行⑶S活性检测(图7)，Northern blot (图8)以及荧光定量PCR检测(图9)，确定单拷贝插入载体pTCK303-RNAi-0stps的Tl代转基因阳性植株。对其分蘖期挥发物收集鉴定 (见图14-21)，并采用Y形管嗅觉仪测定二化螟绒茧蜂(雄虫、雌虫)，1-2龄和3-4龄二化螟幼虫对分蘖期不同处理水稻植株(沉默基因阳性植株、转空载体对照植株和野生型对照植株)的趋性选择行为(见图10-13)。结果表明，水稻同一种萜烯合成酶基因，在水稻不同的生长发育时期所调控的挥发物是不同的；二化螟幼虫(1-2龄，3-4龄)对三种品系的水稻(野生型对照，转空载体对照，沉默基因Ostps的水稻)选择没有差异，表明，水稻基因Ostps对于二化螟幼虫寻找寄主水稻可能没有明显的引诱作用(图10)，但当1-2龄二化螟幼虫取食水稻时，水稻会上调水稻基因Ostps的表达量，可以帮助水稻更加吸引二化螟绒茧蜂雌虫(图11)，从而水稻依靠自身的间接防御机制抵抗二化螟的取食，但对二化螟绒茧蜂雄虫没有引诱作用(图12， 图13)。一旦该基因的表达被抑制，水稻对二化螟绒茧蜂雌虫的引诱作用随即急剧降低。这些结果表明，水稻萜烯合成酶的催化产物具有引诱二化螟绒茧蜂雌虫的作用，从而提高抗二化螟的取食。经过挥发物的收集以及气质联用(GC-MS)鉴定(图14、15、16、17)，发现，水稻植株沉默基因Ostps后相比于对照植株(转空载体对照，野生型对照)，在分蘖期和分蘖后期会缺失多种挥发物(图18、19、20、21)，其中柠檬烯与(Ε)-β-法尼烯的缺失已经经过标准样品的气质联用试验的进一步验证。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种水稻萜烯合成酶蛋白，其为1)由SEQID No. 2所示的氨基酸组成的蛋白质，或2)在SEQID NO. 2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，其为植物宿主细胞。
7.权利要求2或3所述的基因或权利要求4所述的载体在制备转基因植物中的应用。
8.权利要求2或3所述的基因在合成萜烯化合物中的应用。
9.权利要求2或3所述的基因在增加植物间接防御中的应用。
全文摘要
本发明提供一种水稻萜烯合成酶蛋白，其为1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质，或2)在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。本发明还提供编码该蛋白质的基因。当1-2龄二化螟幼虫取食水稻时，水稻会上调水稻基因Ostps的表达量，本发明的基因及其产物可以帮助水稻更加吸引二化螟绒茧蜂雌虫，从而水稻依靠自身的间接防御机制抵抗二化螟的取食。
文档编号A01H5/00GK102533706SQ20111044482
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者吴孔明, 孙洋, 张永军, 徐绮霞, 郭予元 申请人:中国农业科学院植物保护研究所