专利名称：一种多噬伯克霍尔德氏菌及其在促进松树生长中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种松树根际高效解磷细菌多噬伯克霍尔德氏菌及其在促进松树生长中的应用。
背景技术：
磷素是植物营养三大要素之一，是植物体内核酸及多种酶、辅酶等的重要组成成分，同时又以多种方式参与植物体内的各种生理生化过程，对促进植物的生长发育和新陈代谢起着重要作用，缺磷会导致植物生长发育停滞，根系发育不良，植物矮小，生物量严重下降。因此，磷元素是植物必不可缺的营养元素。土壤中含有大量储备磷，可分为无机态磷和有机态磷，但主要以非溶态存在。土壤中的磷主要通过吸附、沉淀、生物固持三种方式固定，土壤中95%以上的磷素与土壤中 Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+等金属离子结合而丧失其有效性。施入土壤中的磷肥大部分会发生专性吸附和化学沉淀被固定，以植物难以吸收利用的难溶性的磷酸盐形式在土壤中积累起来， 利用率很低；而且大量施用磷肥既耗竭有限的磷矿资源又加剧环境的富营养化。因此，通过生物技术途径来解决这一问题越来越受到人们的重视。解磷细菌(Phosphobacteria)是土壤磷循环中的主要微生物类群,其对改善植物磷素吸收和生长具有重要作用。解磷细菌能够促进植物对各种营养元素的吸收，促进植株根系的生长，提高植物对磷的利用率，改善植物的营养条件，提高植株的产量，增加植株抗病能力，另外还可以改善土壤结构，提高有机质含量，改良盐碱地对培育和充分发挥土壤生态肥力、保持农林业生态环境的平衡等均具有极其重要的作用。松树分布很广，是我国山地、荒漠造林、沟壑治理，庭园绿化的主要造林树种之一， 具有巨大的生态和经济价值。但松树一般种植在贫瘠的土壤中，人工育苗成活率不高，生长缓慢，生物量低。其中，磷素供应不足是突出而具普遍性的问题，造成了我国大部分地区的松树生长不良，抗逆性下降。松树根际高效解磷细菌能够提高土壤中难溶性磷的植物有效性和磷肥利用率，改善松树人工林生产中的磷素供应不足的矛盾、促进松树的生长发育。目前，有关松树根际高效解磷细菌的筛选及应用研究鲜见报道。
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种用于松树根际高效溶解难溶性无机磷及有机磷的多噬伯克霍尔德氏菌。本发明的另一目的是提供上述多噬伯克霍尔德氏菌在促进松树生长中用途。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为一种多噬伯克霍尔德氏菌，其分类命名为多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans) WS-FJ9，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCCN0 M2011435，保藏日期2011年12月I日。上述多噬伯克霍尔德氏菌WS-FJ9的基因型为基因型II。
多噬伯克霍尔德氏菌WS-FJ9，从福建省沙县官庄林场28年生湿地松纯林根际土壤中筛选获得，主要生物学特征包括在牛肉膏蛋白胨培养基平板上，菌落较小，颜色黄白， 圆形、边缘整齐；菌体短杆状，革兰氏染色阴性，无芽孢，好氧，氧化酶反应阴性，接触酶试验阳性，淀粉水解试验阴性，M.R.试验阴性，V. P.试验阳性，明胶水解试验阴性，硝酸还原试验阳性，产氨试验阳性，硫化氢试验阴性，柠檬酸盐生长试验阳性。采用接种洋葱、烟草(用于判断菌株对植物的致病性)以及接种苜蓿(用于判断菌株对动物的致病性)等方法对属于Bcc基因型II的多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans) WS-FJ9菌株进行安全性测定，结果表明该菌株对洋葱和苜蓿没有致病性，对烟草有微弱毒性，但无致病性。WS-FJ9菌株的16SrDNA基因序列，见氨基酸或核苷酸序列表I。将所测16SrDNA 序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对。结果表明，WS-FJ9菌株与伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)同源性都很高,其中与Burkholderia multivorans的相似度为98%。 通过利用Biolog系统自动分析鉴定，与Burkholderia multivorans的Biolog相似性PROB 99%，相似值SMO. 551，结合形态、生理生化特征及16SrDNA序列分析，鉴定为多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)。上述多噬伯克霍尔德氏菌WS-FJ9在促进松树生长中的应用。上述的多噬伯克霍尔德氏菌WS-FJ9在解磷中的应用。一种解磷菌剂，含有多噬伯克霍尔德氏菌WS-FJ9菌株，菌体浓度为7 8X108cfu/mL。上述的多卩遼伯克霍尔德氏菌在抑制松枯梢病原菌(Sphaeropsis sapinea)中的应用。有益效果本发明的多噬伯克霍尔德氏菌WS-FJ9菌株在液体摇培的情况下，对磷酸三钙，磷酸铝和卵磷脂具有较强的溶解效果，与对照相比，差异显著；将WS-FJ9制成菌剂接种湿地松苗，结果表明，该菌剂能明显促进湿地松苗木的生长发育，因此，本发明为开发松树专用解磷细菌肥料提供了优良的菌株资源。
图I是WS-FJ9菌株的解磷能力结果图，其中，磷素为Ca3(PO4)i 图2是WS-FJ9菌株的解磷能力结果图，其中，磷素为AlPO4 ；
图3是接种WS-FJ9菌剂湿地松实生苗生长情况结果图4是WS-FJ9与松枯稍病原菌平板对峙结果图5是W-S-FJ9接种洋葱鳞茎结果图；图6是WS-FJ9菌株接种烟草结果图
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释。实施例1WS-FJ9菌株的解磷能力试验解磷培养基A :葡萄糖 10g, Ca3 (PO4)2 5g，MgCl2 5g，KCl O. 2g，MgSO4. 7Η200· 25g， (NH4)2SO4 O. lg，蒸馏水 IOOOmL, pH 7. O0
解磷培养基B :用AlPO4代替解磷培养基A中的Ca3 (PO4) 2，其它成分和含量相同。蒙金娜有机磷培养基，用于解有机磷细菌的液体培养解磷能力测定葡萄糖10g， (NH4)2SO4 O. 5g, NaCl O. 3g, KCl O. 3g, CaCO3 5g, MgSO4 · 7H20 0. 3g, FeSO4 · 7H20 0. 03g, MnSO4 · 4H20 0. 03g,卵磷脂 0. 2g,蒸馏水 IOOOmL, pH7. 0 7. 5。将活化的WS-FJ9菌株接种NB培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水 IOOOmL, pH 7. 2 7. 4)中，30°C振荡培养18 24h制成种子液，取0. 5mL种子液分别接种于含50mL解磷培养基A和50mL解磷培养基B的IOOmL三角瓶中，以接相同体积空白种子液的解磷培养基为对照(CK)，每个处理3个重复，300C，180r/min振荡培养72h后，发酵液 4°C, 10000r/min离心IOmin,钥铺抗比色法测定发酵液有效磷含量。将配制好的蒙金娜有机磷液体培养基按50mL每瓶的装量加入IOOmL的三角瓶中， 灭菌，冷却后每瓶加入0. 5mL的卵磷脂和0. 5mL细菌悬液，对照接等量的灭活菌悬液，所有处理都做3次重复。接种后30°C，180r/min振荡培养3d。结果如图I所示，从图I可以看出，以Ca3(PO4)2为唯一磷源时，发酵液有效磷含量达711. 29mg · ΙΛ是对照(CK)的18. 61倍；如图2所示，以AlPO4为唯一磷源时，发酵液有效磷含量达274. 4mg · L—1，是对照(CK)的3. 5倍。以卵磷脂为唯一碳源，发酵液有效磷含量达到3. 22mg吨―1，综上表明，WS-FJ9菌株对磷酸三钙，磷酸铝和卵磷脂具有较强的溶解能力。实施例2WS-FJ9菌株最适解磷条件试验将WS-FJ9活化后，接种NB培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水 IOOOmL, pH 7. 2 7. 4)中，30°C振荡培养18 24h制成种子液，取0. 5mL种子液分别接种于装有50mL以NBRIP (国际植物研究所磷酸盐生长培养基，配方同解磷培养基A)为基本培养基的IOOmL三角瓶中，将NBRIP培养基碳源分别设为蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖和甘露醇； 氮源分别设为蛋白胨、牛肉膏、硝酸钾、硝酸铵、硝酸钙，以接相同体积空白种子液的解磷培养基为对照(CK)，每个处理3个重复，300C，180r/min振荡培养72h后，发酵液4°C，IOOOOr/ min离心IOmin,钥铺抗比色法测定发酵液有效磷含量。结果表明，最适解磷条件为，IOOmL 三角瓶中，以葡萄糖为碳源、硫酸铵为氮源，装液量30 50mL、初始pH值7. O 7. 2、接种量4% 5%、温度28°C 30°C。实施例3WS-FJ9菌株温室盆栽试验将WS-FJ9活化后，用接种环挑取少量菌体接种于装有50mLNB培养基(配方同实施例I)的IOOmL三角瓶中，29°C，180r/min振荡培养72h。发酵液(4°C, 6000r/min)离心 5min，用无菌生理盐水润洗菌体2 3次后，用无菌生理盐水调节菌悬液(7 8X IO8Cfu/ mL)制成WS-FJ9菌剂。接种湿地松实生苗(苗龄120d)，以等量无菌生理盐水为对照(CK)， 接种量为15mL/株。每处理20个重复，置于温室统一管理，光照为12h/d，适时浇水。湿地松实生苗接种180d生长情况，结果如表I和图3所示，接种WS-FJ9菌剂对湿地松实生苗具有明显的促生作用。接种处理使湿地松实生苗的苗高、茎粗比对照有不同程度的增加。其中，苗高和茎粗比对照分别增加了 20. 52%和8. 4%。表1WS-FJ9对湿地松实生苗的生长及生物量处理苗高(cm) 增长率(％) 茎粗(mm) 增长率(％)WS-FJ9 16.15±1.33b 20.522.7±0.240b8.4
CK 13.4±1.76a—2.49±0.33a—注P < 0. 05，同列不同行小写字母不相同代表差异显著。实施例4WS-FJ9菌株对松枯梢病原真菌具有较强的拈抗活性将已培养好的松枯梢病原菌在超净工作台用灭菌的打孔器(直径5_)均匀地打成圆形的小孔。采用平板对峙的法，将病原菌菌饼移接到每个培养皿的中心，将WS-FJ9菌株活化后划线接在平板边缘。距中心30mm处，以只接病原菌为空白对照，每个处理3个重复，28°C培养3 7d后观察，结果如图4所示，WS-FJ9菌株对松枯稍病原菌具有明显抑菌效果。实施例5WS-FJ9菌株的安全性试验本发明采用接种洋葱和烟草来判断菌株对植物的致病性，采用接种苜蓿来判断菌株对动物的致病性。供试材料包括洋葱(Allium cepa)、未开花的烟草(Nicotiana benthniciana)和紫花苜猜(Medicago sativa)种子。洋葱致病性测定用注射器取洋葱伯克霍尔德氏菌WS-FJ9菌悬液 (lX 107-108cfu/mL)在洋葱鳞茎上两点对衬注射(深度l-2cm)，每点注射量为lmL。以含毒力基因(BCESM和cblA)的LMG1222菌株(CKl)和灭菌水(CK2)为双重对照。所有处理均重复3次，置于26°C培养，4-5d后检查结果。其中，LMG1222菌株来源于BCCM(比利时微生物保藏中心)/Ghent University。洋葱接种试验结果如图5所示，接种WS-FJ9菌株的洋葱仅在接种点产生较小的过敏斑点，继续培养，斑点并不继续扩展，将洋葱切开后，内部颜色没有发生变化，也没有臭味，与灭菌水对照相比没有明显的差异。据此推断该菌株不是洋葱的致病菌，产生的小斑点仅是洋葱的过敏反应。而接种含毒力基因的LMG1222菌株的洋葱不仅在接种点产生过敏斑点，而且随着培养时间的延长，斑点不断扩大，切开洋葱后，内部发黄，组织呈软腐状且有浓重的臭味，据此推断，LMG1222菌株为洋葱致病菌。以上说明隶属于Bcc基因型II的多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)WS-FJ9菌株对洋葱没有致病性，不是洋葱病原菌，对洋葱具有安全性。烟草致病性测定用灭菌注射器取O. 5 μ L的含菌量为107-108Cfu/mL的菌悬液，对烟叶进行穿刺，将菌液注入伤口处。以含毒力基因的LMG1222菌株(CKl)和灭菌水(CK2) 为双重对照。所有处理均重复3次，置于25°C、相对湿度85%、日照16h的人工气候箱中培养。在24-48h表现枯斑或水溃斑为阳性反应，3d左右出现黄斑为阴性反应。烟草接种试验结果如图6所示，接种WS-FJ9菌株的烟叶产生了较轻微的过敏反应，产生了较小的水溃斑，但不引起枯斑，与灭菌水对照差异不明显，这说明WS-FJ9对烟草虽有较轻微的弱毒性，但并无致病性。含毒力基因的LMG1222菌株使烟草较大的水溃斑， 24h后即产生枯斑，说明该菌为烟草的致病菌。苜蓿致病性测定将测试细菌接种到NA液体培养基中，30°C震荡(180r/min)培养24h，用灭菌水调节菌悬液到107-108cfu/mL用于接种。将苜蓿种子用98%浓硫酸浸泡20min (约IOmL浸300粒种子)，用500mL灭菌水清洗4次，然后泡在60mL灭菌水中，32 °C 震荡(150r/min)浸种6_8h，再清洗2次，换水后同样条件培养过夜。次日再用灭菌水清洗 2次后(每次60mL水)，用无菌镊子摆放到I %的水琼脂平板上，每皿摆放30粒种子，发芽后去掉不发芽和发芽不正常的种子，对发芽正常的种子进行计数，等待接种。将水琼脂平板上的苜蓿种子用接种针在子叶上刺一个小孔，取20 μ L准备好的菌悬液点在伤口处，每菌株接种重复3次，设2种CK处理，其中I个接种含毒力基因的LMG1222菌株(CKl)，另I个接种无菌水(CK2)。接种后的种子在37°C、70%相对湿度、定时光照(12h光照、12h黑暗) 条件下的人工气候箱中培养，7d后检查发病率。苜蓿接种试验，接种LMG1222菌株发病率(50. 6% )极显著地高于接种WS_FJ9菌株(8. 7%)和接种灭菌水(7.8%)的苜蓿(见表2)。苜蓿是代替老鼠作为测定Bcc菌株对哺乳动物毒性的模式植物，用苜蓿模型可简单快捷地检测出Bcc菌株对哺乳动物是否具有致病性。上述试验结果说明属于洋葱伯克霍尔德氏菌基因型II的(Burkholderia multivorans)WS-FJ9菌株对哺乳动物没有毒害性。本发明采用接种洋葱、烟草(用于判断菌株对植物的致病性)以及接种苜蓿(用于判断菌株对动物的致病性)等方法对从松树根际土壤中分离出来的属于Bcc基因型II 的多卩遼伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans) WS-FJ9菌株进行安全性测定,结果表明该菌株对洋葱和苜蓿没有致病性，对烟草有微弱毒性，但并无致病性。可见，属于Bcc基因型II的多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)WS-FJ9菌株对松树是一株很有潜力的安全生防和促生的菌株。表2接种WS-FJ9和LMG1222后苜蓿幼苗发病率的差异显著性分析
权利要求
1.一种多噬伯克霍尔德氏菌，其分类命名为多噬伯克霍尔德氏菌iBurkholderia multivorans ) WS-FJ9,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC NO M2011435，保藏日期2011年12月I日。
2.权利要求I所述的多噬伯克霍尔德氏菌在解磷中的应用。
3.权利要求I所述的多噬伯克霍尔德氏菌在促进松树生长中的应用。
4.权利要求I所述的多噬伯克霍尔德氏菌在抑制松枯梢病原菌中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种分离自松树根际土壤、高效溶解难溶性无机磷和有机磷的多噬伯克霍尔德氏菌及其应用。其分类命名为多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderiamultivorans)WS-FJ9，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC NOM2011435，保藏日期2011年12月1日。本发明的多噬伯克霍尔德氏菌WS-FJ9菌株在液体摇培的情况下，对磷酸三钙、磷酸铝和卵磷脂具有较强的溶解效果，与对照相比差异显著；WS-FJ9菌株对松枯梢病原菌(Sphaeropsissapinea)具有较强的拮抗活性；将WS-FJ9制成菌剂接种湿地松能明显促进苗木的生长。本发明为开发松树生物菌肥提供了优良的菌株资源。
文档编号C05F11/08GK102604860SQ20121002671
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月7日 优先权日2012年2月7日
发明者侯亮, 叶建仁, 吴小芹, 李冠喜 申请人:南京林业大学