专利名称：一种高效溶磷促生菌、由其制备的微生物菌剂及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物菌剂领域，具体地说，涉及一种高效溶磷促生菌、由其制备的微生物菌剂及应用。
背景技术：
(一 )溶磷微生物菌剂发展现状我国90%以上的耕地缺磷，使用磷肥是解决作物增产的主要措施，磷肥日益成为限制我国农业可持续发展的瓶颈。我国是世界化肥消费第一大国，也是磷肥第一消费大国， 每年磷肥消费量1100万吨左右。众所周知，我国磷矿资源缺乏，保有储量151. 98亿吨，再过20年中高品位磷矿开采殆尽(李志宁，2003a，李志宁，200 )，不得不依靠购买国外高价磷矿石保障粮食生产。一些研究显示，我国磷肥当季利用率仅为3. 22 18% (周晓芬，马民强，1994 ；张李康，1997 ；崔正忠等，2001 ；周广业等，1991 ；李云等，2002)。磷肥施入土壤后80 90%很快被土壤固定(范丙全等，1998,200 )，石灰性土壤中有效磷转变成溶解度极低的磷灰石(lschmidt & Nixon，1944 ;Murrmann & Peech，1968)，而在酸性土壤中形成磷酸铁和磷酸铝(Ford，1933)。我国自20世纪70年代使用磷肥以来，土壤磷积累显著 (林葆，2009)。土壤磷绝大部分以难溶无机磷形态存在，释放缓慢，作物有效性低。随着辚肥用量增加，磷肥转化为极难利用的闭蓄态磷(来路等，200 与高稳定性有机磷(黄庆海等，200 。解决土壤磷的活化与释放是提高土壤磷和磷肥利用效率的关键。因此，增强土壤磷有效性，提高磷肥增产效益，是我国农业可持续发展的必然之路。溶磷微生物是一类具有活化土壤难溶无机磷能力的有益微生物。应用溶磷微生物活化土壤难溶磷是世界公认的安全、经济和有效的生物措施(Kucey，1988 ；Kamble & Mohite, 1996 ；Morales等，2007 ；El-Gawad等，2009)，倍受各国科学家和政府高度重视。开展高效溶磷微生物研究与利用，对于挖掘土壤磷资源的利用潜力、提高磷肥利用率、节约磷月巴、发挥我国有限磷矿资源的增产作用和农业持续发展意义重大。溶磷真菌(Salih等，1989 ；王延秋等，1993 ；Vassileva, 1998 ；Asea 等，1988 ； Abd-Alla & Omar，2001 ；程淑琴等，2003 ；Wakelin 等，2007 ；Morales 等，2007)和溶磷细菌 (Rasal，等，2004 ；Raychaudhuri，等，2003 ；Orhan，等，2006 ；)都具有显著增加土壤有效磷、 提高作物产量能力，以及节约磷肥的效果(El-Lateef，1998 ；Suri，等，2006)。同时，溶磷微生物提高磷肥利用率(Tomar等，1994 ；Tomar等，1996 ；Kamble &Mohite, 1996 ；范丙全等， 2004a)，具有改善作物品质的能力(Hamed，2003 ；El-Gawad, 2009)，溶磷微生物对于提高土壤难溶磷和磷肥的生物有效性具有巨大应用潜力。以往研究涉及面非常广，为溶磷微生物应用提供了技术支撑。然而，长期以来没有重视溶磷微生物在大范围、大区域与多种土壤、多种作物的广泛适应性进行研究，使得大量溶磷菌种很大程度上无法找到更适合的应用土壤与作物，难以发挥溶解土壤磷和增强磷肥有效性的最大潜力。严重限制了溶磷菌的使用范围和应用潜力发挥。对整体溶磷微生物资源而言，可能造成了巨大浪费，由此导致各国溶磷微生物菌剂研究和生产进入更大误区。一些国家仍然以单株溶磷菌株生产溶磷微生物菌剂，而在全国范围所有土壤和各种上使用。世界上大型溶磷微生物菌剂公司，如加拿大Wiilom Bios公司使用单株溶磷拜莱青霉菌(Penicillium bilaii) (Kucey，1988，1989)生产微生物菌剂 JumpMart。印度 Ruchi Biochemicals公司使用并生产一种溶磷微生物，推荐在全国使用。比利时生产一株溶磷细菌生产菌剂Wiosphorene (Ahmed等，1999)。我国主要以巨大芽孢杆菌(Bacillus megatarium)生产溶磷微生物菌剂(葛诚，吴薇，1995 ；范丙全，2007)。其他国家情形大致相似。没有考虑溶磷微生物与地域、土壤类型、作物种类的最佳适配性，溶磷微生物菌剂的使用效果受到严重影响。因此，针对我国土壤磷有效性低、难溶磷积累，磷肥利用率持续下降的现状，并且针对我国缺乏高效广谱溶磷微生物菌种资源、微生物菌剂产业仍然使用适应范围窄、溶磷能力低的老菌种的现状，筛选和培育广泛适用我国各类主要土壤、多种作物的新的溶磷微生物菌株，是开发高效溶磷微生物菌剂的重要前提。( 二)土传病害防治菌剂发展现状我国土传病害、连作障碍日趋严重，造成大面积减产，土传病害防治是保障粮食安全的必然途径。土传病害、连作障碍发生严重已经成为我国粮食持续增产的威胁因素。尽管我国对土传病害进行了长期研究，但是土传病害、连作障碍防治技术没有得到有效的解决， 尤其是防治土传病害、连作障碍的微生物防治技术依然缺乏。发展多功能微生物菌剂，是解决土传病害、连作障碍防治，确保粮食安全的重大需求。由于人口急剧增长和耕地数量的限制，以及人类对高产出、高收入的追求，连作栽培成为我国农业生产中的常用措施。连作种植出现作物生长发育不良、土传病害频繁加重、 产量和品质下降等问题，给我国农业生产造成巨大的经济损失，是农业可持续发展急需解决的重大课题。农业生产正在朝着无公害、有机农业方向发展，微生物制剂及其应用技术对于发展绿色农业、建立有机食品安全工程体系具有重要作用。我国蔬菜、果树、花卉已经发展到 4亿亩，其中，蔬菜播种面积2. 82亿亩，总产量6. 37万吨。保护地蔬菜超过5000多万亩， 总产量1. 68亿吨，而且有机蔬菜出口基地面积急剧增加；西瓜种植约500-1000万亩，西瓜连作障碍是世界上长期存在的难题，产量和品质下降。研究表明，黄瓜、番茄、西葫芦、甜椒等作物连作3年以上，每年产量降低10% -20%，连作4-5年的作物减产40%甚至一半以上。土传病害、连作障碍对粮食作物发展造成了严重危害，我国大豆种植面积大约有1.45 亿亩，由于连年种植、病害频繁且发生面积大，引发作物减产甚至绝收。连作障碍已经成为农业生产发展的瓶颈，研究开发高效防治土传病害、消除连作障碍的微生物菌剂迫在眉睫。 利用微生物菌剂可提高作物产量、改善作物品质、防治线虫病害、节约化肥，在提高土壤的持续增产潜力中发挥着重要作用。各国非常重视防治土传病害的微生物菌剂的产品研发，已经商品化的产品如澳大利亚的K84，放射形农杆菌菌株K84(Agrobacteriumra diobacterstrain k84)在 1973年就被大规模生产，用来防治由根癌病土壤(Agrobacterium tumefaciens)引起的感染(Kerr， A, 1980) ； 1988年Gustafson公司在美国注册生产A13的PGPR产品Kodiak，成为作物促生菌商业化生产的拓疆者，商业化最成功的产品是Agrobacterium radiobacterK840美国研制的"Topshield (哈茨木霉T2》和以色列研制的"Trichodex (哈茨木霉T39)均是用于防治真菌病害如灰霉病以及以色列Mycontrol公司开发的商品制剂Trichoderma 2000主要用于防治立枯丝核菌、齐整小核菌、疫霉等；盾壳霉也是研究较多的一种生防菌，盾壳霉对核盘菌属及葱白腐小菌核菌引起的多种植物病害均有很强的抑制作用。现在国外已有商品化产品出现，如前苏联开发的商品制剂Coniothyrin可以用于防治向日葵的菌核病，德国开发的商品制剂ContansWG可以用于防治莴苣的核盘菌菌核病等。此外还有针对粘帚霉的， 由美国研制成功的SoilGard，用于防治猝倒病和根腐等，意大利研制的BiofoxC专用于防治镰刀菌属病害等。我国商品化的木霉菌杀菌剂(生菌消，又名灭菌灵)，主要用于防治各种作物的霜霉病(沈寅初，2000)，我国开发的M06抗生菌为链霉菌属，定名为泾阳链霉菌， 对黄萎病菌、枯萎病菌、立枯病菌、猝倒病菌等多种植物病害具有抗性，并且可促进植物生长(包建中，1998)。江苏省农科院植保所防治水稻病害的拮抗细菌(Bacillus subtilis), 大面积示范推广试验证明，拮抗菌在水稻植株上定植能力较强，繁殖较快，纹枯病防效达 75% 85%，稻曲病防效63. 8% 85. 7% (陈志谊，2001)。沈阳农业大学生物农药工程中心利用拮抗木霉和拮抗细菌混合发酵制成粉剂，成功防治了保护地蔬菜和甜瓜的苗期病害，其它报道的细菌杀菌剂还有用来防治黄瓜及烟草炭疽病菌的地衣芽孢杆菌，防治甘蔗黑腐病的枯草芽孢杆菌、荧光假单孢杆菌O^eudomonas radiobacter)防治小麦全蚀病等。微生物菌剂防治土传病害、连作障碍是当前主要发展方向。大棚蔬菜土壤、大豆连作农田、棉花产区农田、西瓜生产基地农田等是我国土传病害、连作障碍最为严重的地区， 研制、开发和生产防治主要作物土传病害以及连作障碍，对于我国粮食增产、减少农药使用量、保障农产品品安全作用巨大。广适应性(土壤、作物)的溶磷微生物菌种资源为世界范围内稀缺，且未见有关广适应性的溶磷微生物菌剂的报道。
发明内容
本发明主要针对我国缺磷和磷肥利用率低、土传病害严重、增产潜力下降的农田现状，提供一种新的高效溶磷促生菌以及由其制备的微生物菌剂。本发明还通过上述微生物菌剂在防治作物病害及提高产量中的应用。为了实现本发明目的，本发明提供一种高效溶磷促生菌一成团泛菌(Pantoea agglomerans) P36，其分离自我国江苏锦屏磷矿区植物根际土壤中，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2012年2月9日，保藏号CGMCC N0. 5750。成团泛菌P36的微生物学特性为能利用丙二酸、柠檬酸，吲哚、甲基红、硝酸盐还原、苯丙氨酸脱氨酶试验为阳性，明胶液化、脲酶、H2S产生、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶试验为阴性，发酵葡萄糖产酸。本发明还提供含有成团泛菌P36的微生物菌剂。本发明还提供成团泛菌P36及其微生物菌剂在防治作物病害中的应用。本发明还提供一种复合微生物菌剂，其有效成分为成团泛菌P36和哈兹木霉菌 (Trichoderma harzianum)。优选地，其有效成分为成团泛菌P36和哈兹木霉(Trichoderma harzianum) T-315，哈兹木霉T-315保藏于美国标准微生物保藏中心(ATCC)，保藏号ATCC 20671。
前述复合微生物菌剂中还含有添加剂、粘结剂和保护剂；其中，所述的添加剂为二氧化硅、高岭土、稻壳粉、麦壳粉、秸秆粉等中的一种或多种；所述粘结剂为膨润土或水溶性微生物多糖等；所述保护剂为甘油、脱脂奶、植物油、海藻酸钠、壳聚糖等中的一种或多种。前述溶磷防病复合微生物菌剂由如下重量份的组分组成成团泛菌P36菌剂 1份；哈兹木霉菌剂 1份；添加剂6-12份；粘结剂0. 05-0. 1 份；保护剂0. 01-0. 1 份。优选地，前述复合微生物菌剂由如下重量份的组分组成成团泛菌P36菌剂1份；哈兹木霉菌剂1份；添加剂8-10份；粘结剂0. 05-0. 1 份；保护剂0. 01-0. 1 份。其中，成团泛菌P36菌剂中活菌数为2X 108-3X 108cfu/g，哈兹木霉菌剂中活菌数为 lX107-lX108cfu/go本发明还提供前述溶磷防病复合菌剂在防治作物病害中的应用，所述作物病害包括腐霉病、枯萎病、猝倒病、菌核菌病和/或白绢病等。本发明还提供前述溶磷防病复合菌剂在提高作物产量中的应用，其是将所述溶磷防病复合微生物菌剂与氮肥、磷肥、钾肥或复合肥混合施用。所述作物优选为水稻、大豆、玉米、小麦、棉花、油菜及其它蔬菜或作物。本发明还提供前述复合微生物菌剂在活化土壤难溶磷以及降低化肥用量中的应用。适宜的土壤为黑土、黑钙土、沙姜黑土、白浆土、褐土、潮土、盐潮土、红壤、水稻土、灰钙土、灰漠土等。此外，本发明还提供了上述复合微生物菌剂的不同造粒类型，以满足菌剂与不同作物种子播种的应用，包括与大豆、玉米、棉花、小麦等机械化播种匹配的颗粒菌剂。本发明还提供上述复合微生物菌剂与尿素、二铵、红色钾肥、复合肥料等颗粒肥料在机械化施肥中应用。本发明的成团泛菌(Pantoea agglomerans) P36，是一株高效溶磷促生菌，在使用化肥的土壤条件下，它对我国主要土壤和主要作物都表现显著增产的作用，一般增产10 20%，甚至达到50%以上。以黑土增产最为显著。适用于大豆、玉米、小麦、棉花、油菜、水稻、蔬菜等主要作物。本发明的溶磷抗病复合微生物菌剂中的哈兹木霉菌(Trichoderma harzianum) T-315，防治作物土传病害效果显著。本发明以我国主要土壤为研究对象，进行了广谱高效溶磷微生物菌种的筛选，获得了大量溶磷菌株，经过研究比较这些溶磷菌株与我国主要土壤、主要作物的适应性、溶磷能力、增产效果，获得了一株广泛适用于我国主要土壤类型、主要作物的高效溶磷的成团泛菌P36，特别适合我国南方、北方、西北、东北、西南等区域的典型土壤，为溶磷微生物在土壤磷转化、磷肥高效利用和节约磷肥资源等方面提供了菌种资源和技术支撑。本发明将广泛适应性的高效溶磷增产细菌成团泛菌P36与高效抗作物病害的哈兹木霉真菌有机地结合起来，通过施用本发明的复合菌剂，在高效利用土壤磷素、提高磷肥利用率的同时，充分发挥微生物防治土传病害的作用，达到了溶磷增产、抗病增产的效果， 具有巨大农业应用价值。本发明的复合微生物菌剂具有高效溶解难溶磷、防治多种病害和促进作物增产的作用，是一种可有效降低化肥用量、节约化肥资源、防治土传病害、提高作物产量的复合微生物菌剂，其有益效果为(一 )溶解难溶磷、促进作物生长效果显著；( 二)防治多种作物病害，包括腐霉病、枯萎病、疫病、猝倒病、纹枯病、齐整小核菌 (白绢病)等；(三)该菌剂溶磷效果不受化学肥料影响，使用化肥条件下作物持续增产；(四)使用地域范围广，适用于我国黑土、黑钙土、沙姜黑土、白浆土、褐土、潮土、 盐潮土、红壤、水稻土、灰钙土、灰漠土等；(五)适合提高玉米、大豆、小麦、水稻、棉花、油菜和蔬菜等主要作物的产量；(六)使用简便，颗粒菌剂可以与大豆、玉米、棉花、小麦播种机一起使用，也可以与多元复合肥、尿素、磷酸二铵、红色钾肥等颗粒肥一起机械施用。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1成团泛菌P36的分离及培养1.溶磷促生成团泛菌P36的培养及溶磷菌P36菌剂的制备(1)成团泛菌P36培养基发酵液配方(kg/t发酵液)磷酸氢二钾0. 1，磷酸二氢钾0. 1，氯化钠4. 3，硫酸镁 0. 1，淀粉8. 6，牛肉膏4. 3，蛋白胨4. 3，酵母粉4. 3，蔗糖8. 6，硫酸铵2. 6，碳酸钙10，硫酸亚铁0. 001，豆油6. 8，以水配制。(2)成团泛菌P36培养过程将成团泛菌(Pantoea aggl0meranS)P36菌株接种于牛肉汁蛋白胨培养基上， 28 30°C培养48h，然后接入IOOOmL三角瓶，在30°C，220r/min下，培养36h。按5%接种量接入到50L种子罐中，在220r/min，pH7. 5，通气量0. 5vvm下，培养2d后，再按1(^八％接种量转到500L的发酵罐中，在200r/min，pH7. 5，通气量0. 7 1. Ovvm下，培养3d。发酵完成后，以！ 13 6倍的高岭土吸附，即得溶磷菌P36菌剂。2.成团泛菌P36的微生物学特性将菌株P36接种在牛肉膏蛋白胨培养基上，30°C培养，菌落为圆形，表面光滑，颜色为黄色。革兰氏染色为阴性，周生鞭毛，运动性。菌株P36能利用丙二酸、柠檬酸盐、硝酸盐，发酵葡萄糖不产气；利用阿拉伯糖、木糖、海藻糖、鼠李糖、甘露醇产酸，不能利用卫矛醇产酸；明胶不液化、吲哚、V-P, 、苯丙氨酸脱氨酶、脲酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶试验为阴性反应。
实施例2高效溶磷抗病增产复合微生物菌剂的制备1.哈兹木霉的培养哈兹木霉(Trichoderma harzianum)T-315，保藏于美国标准微生物保藏中心 (ATCC)，保藏号 ATCC 20671。(1)培养基的组成(kg/t发酵液)可溶性淀粉10kg，黄豆饼粉10kg，玉米粉^g，葡萄糖1kg，蔗糖10kg，酵母粉 5kg, (NH4)2SO4 3kg, K2HPO4 0. 2kg, NaCl 2. 5kg, MgSO4 · 7H20 0. lkg, CaCO3 0. 5kg, FeSO4 0.001kg，硼酸(1% )1L, pH 7.0，以水配制。(2)发酵培养过程将哈兹木霉T-315接种于土豆蔗糖(PDA)培养基上，25 培养3d。将哈兹木霉菌孢子转接入IOOOmL三角瓶，26-280C，220r/min下液体发酵培养36h。然后按1 %接种量接入50L种子罐，在200r/min、pH7. 0、通气量0. 7vvm条件下，培养36h后，再按10v/v% 接种量转入500L发酵罐，在220r/min，pH7. 0，通气量0. 7 1. Ovvm下，培养3d。加入保护剂海藻酸钠，以1 3 6倍的二氧化硅吸附。2.高效溶磷抗病增产复合微生物菌剂的制备分别对溶磷成团泛菌P36、哈兹木霉菌T-315进行发酵，发酵后分别加入保护剂海藻酸钠。成团泛菌P36以高岭土吸附，活菌数2X 108-3X 108cfu/g。哈兹木霉(Trichoderma harzianum)T-315以二氧化硅吸附，活菌数为1 X IO7-I X 108cfu/g。然后，按照成团泛菌 P36、哈兹木霉菌T-315菌的体积比1 1混合均勻。3.高效溶磷促生抗病复合微生物菌剂造粒向以上吸附、混合好的菌体中加入适量稻壳粉、秸秆粉和膨润土粘结造粒，根据生产需要形成不同的颗粒粒径菌剂，用于与玉米、大豆、棉花种子一起机械播种施入土壤，或者与尿素、磷酸二铵、钾肥、复合肥等颗粒肥料一起机械施入土壤。实验例1成团泛菌P36培养皿条件下溶磷效果1.从我国江苏锦屏磷矿区采集植物根际土壤样品中，分离筛选出成团泛菌P36， 同时，从其他地区土壤样品分离筛选了溶磷菌株P36、P31、P29-5、P40和P40-2。在室内固体培养皿培养、液体培养基培养条件下，测定了它们的溶磷能力。溶磷菌株P36溶磷圈与菌落直径比值达到了 2. 83，溶磷圈内溶解的水溶性溶 (P2O5)为2. 2Img ；P31溶磷圈与菌落直径比值达到了 2. 50，溶磷圈内溶解的水溶性溶(P2O5) 为1. 96mg ；P29-5溶磷圈与菌落直径比值达到了 2. 81，溶磷圈内溶解的水溶性溶(I32O5)为 2. 20mg ；菌株P40和P40-2的溶磷圈与与菌落直径比值分别为2. 25和1. 56，溶磷圈内的溶磷量(P2O5)分别为1. 76和1. 22mg,都低于菌株P36 (表1)。表1溶磷菌株在含Ca3(PO4)2培养基上的溶磷圈与菌落的直径比值(d/D)
权利要求
1.成团泛菌(Pantoeaagglomerans) P36，保藏号 CGMCC NO. 5750。
2.含有权利要求1所述成团泛菌(Pantoeaagglomerans) P36的微生物菌剂。
3.权利要求1所述成团泛菌P36及权利要求2所述微生物菌剂在防治作物病害中的应用。
4.一种复合微生物菌剂，其有效成分为成团泛菌P36和哈兹木霉(Trichoderma harzianum) 0
5.根据权利要求4所述的溶磷防病复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂中还含有添加剂、粘结剂和保护剂；其中，所述的添加剂为二氧化硅、高岭土、稻壳粉、麦壳粉、秸秆粉中的一种或多种； 所述的粘结剂为膨润土或水溶性微生物多糖；所述的保护剂为甘油、脱脂奶、植物油、海藻酸钠、壳聚糖中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的复合微生物菌剂，其特征在于，由如下重量份的组分组成 成团泛菌P36菌剂 1份；哈兹木霉菌剂 1份； 添加剂6-12份；粘结剂0. 05-0. 1份；保护剂0. 01-0. 1份；其中，成团泛菌P36菌剂中活菌数为2X 108-3X 108cfu/g，哈兹木霉菌剂中活菌数为 lX107-lX108cfu/go
7.根据权利要求6所述的复合微生物菌剂，其特征在于，由如下重量份的组分组成 成团泛菌P36菌剂1份；哈兹木霉菌剂1份；添加剂8-10份；粘结剂0. 05-0. 1份；保护剂0. 01-0. 1份。
8.权利要求4-7任一项所述的复合微生物菌剂在防治作物病害中的应用，所述作物病害包括腐霉病、枯萎病、猝倒病、菌核菌病和/或白绢病等。
9.权利要求4-7任一项所述的复合微生物菌剂在提高作物产量中的应用，其是将所述复合微生物菌剂与氮肥、磷肥、钾肥或复合肥混合施用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述作物为水稻、大豆、玉米、小麦、棉花、油菜。
全文摘要
本发明提供了一种高效溶磷促生菌及由其制备的微生物菌剂，该微生物菌剂的有效成分为成团泛菌(Pantoea agglomerans)P36和哈兹木霉(Trichoderma harzianum)。本发明将广泛适应性的高效溶磷增产细菌成团泛菌P36与高效抗作物病害的哈兹木霉真菌有机地结合起来，通过施用本发明的复合菌剂，在高效利用土壤磷素、提高磷肥利用率的同时，充分发挥微生物防治土传病害的作用，达到了溶磷增产、抗病增产的效果，具有巨大农业应用价值。
文档编号A01P3/00GK102533611SQ201210030659
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月10日 优先权日2012年2月10日
发明者范丙全 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所