专利名称：一种三角帆蚌人工催产及授精的方法
技术领域：
本发明属于贝类人工繁殖技术领域，本发明具体公开了一种三角帆蛘人工催产及授精的方法。
背景技术：
三角帆蛘Qfyriopsis cumuingii )隶属于软体动物门，双壳纲，真瓣鳃目，蛘科，为我国特有种，是我国淡水育珠的优质品种之一。自二十世纪80年代起，三角帆蛘取代褶纹
(Cristaria plicata )^ W^l{Anodonta woodiana woodiana )等品禾中在我国淡水育珠产业上广泛使用，这使得我国淡水珍珠产量一举超越了日本，成为世界淡水珍珠第一生产大国和出口大国，并一直持续至今。中国珠宝协会的统计数据表明我国淡水珍珠年产量约占世界珍珠产量的90%。目前，世界70%以上的淡水珍珠由三角帆蛘培育而成。三角帆蛘在我国淡水珍珠养殖业中，乃至世界珍珠养殖业中的地位举足轻重。二十世纪70年代末，我国就突破了三角帆蛘人工繁殖技术。在生产上，通常采用大型池塘培育三角帆蛘亲本，让其自然受精，再从中挑选外鳃丝怀有成熟钩介幼虫的雌蛘进行人工采苗。但由于亲本性腺发育不同步，需要从大量的亲本中、多次挑选成熟雌蛘用于人工繁育，不仅工作量大，而且效率低。国内外对三角帆蛘的受精方式和过程尚不十分清楚，传统亲本培育方式无法实现三角帆蛘的人工受精，这限制了一些基础应用研究，如多倍体育种、家系选育等研究的开展。贝类的多倍体育种研究为海洋贝类养殖业的繁荣和发展作出了巨大贡献，尤其是三倍体贝类养殖取得了显著的经济效益。美国通过人工多倍体诱导成功获得了三倍体牡蛎，并在生产上有广泛的应用，目前50%以上的养殖牡蛎是三倍体，养殖效益显著增加。理论上由于三倍体贝类性腺不发育或发育不良，其能量大部分用于生长，生长速度、个体规格显著高于二倍体贝类。众所周知，培育珍珠的大小很大程度上依赖于有大规格的育珠蛘作为载体。如果在淡水珍珠养殖生产上能使用三倍体三角帆蛘，我国的淡水珍珠养殖业将再次出现质的飞跃。而开展多倍体育种研究的首要条件是实现物种的人工授精，进而在受精卵的不同发育时期使用诱导剂，如6-DMAP、细胞松弛素等进行人工倍性诱导。由于海水贝类行体外受精，通常采用物理的(如温度、阴干、流水刺激)、化学的方法(如氨水)诱导或解剖分别获得成熟的精子和卵子，混合后获得受精卵，开展多倍体育种研究比较容易实现，但对实验动物造成严重的伤害甚至死亡。此外，家系选育是遗传育种研究中重要而有效的技术方法之一，由于三角帆蛘亲本个体发育不同步、不能同时受精的问题，建立同一批的家系难度较大。与海水贝类不同，三角帆蛘具有蛘科物种典型的繁殖特性雄蛘的精子和雌蛘的卵子需要在雌蛘的外鳃丝上受精发育，其受精过程更为复杂。由于基础繁殖生物学研究薄弱，目前尚无法人工控制其受精过程。实现人工授精是三角帆蛘全人工繁殖的关键技术瓶颈之一，也是开展三角帆蛘多倍体育种、家系选育研究的基本条件。因此，研究三角帆蛘人工授精的方法具有重要理论价值和一定的应用前景。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种避免了对实验动物的伤害，突破了三角帆蛘的全人工繁育中关键技术瓶颈，为开展三角帆蛘多倍体育种、家系选育研究提供基本条件的一种三角帆蛘人工催产及授精的方法。按照本发明提供的技术方案，所述三角帆蛘人工催产及授精的方法包括以下步骤
a、选取贝壳完整无损、喷水有力、健康的三角帆蛘4飞龄亲本并鉴别其性别；具体通过比较内外鳃丝的间隔宽度鉴别雌雄外鳃丝宽度致密，且显著小于内鳃丝宽度者为雌蛘， 内外鳃丝间隔宽度一致者为雄蛘；
b、在鉴别完雌雄性别的亲本的贝壳表面进行标记，并记录标记后亲本个体相关信息； C、将标记后的亲本按照雌雄性别隔离进行培育池放养培育，放养密度均为5 10只/平
方米，培育池水位控制在1(Γ15厘米，利用高位池自流水作为水源保持培育池内为流动水， 培育池内流动水的流速控制在0. 5^3米/分钟；
d、亲本隔离培育至5月中旬，当近5日平均水温达1纩25°C，检查雌蛘外鳃丝状态；当外鳃丝完全膨胀并充满两侧外套腔时，选出作为待孕雌蛘；
e、将选出的待孕雌蛘随机分成两组隔离培育，一组为自然受精组，另一组为人工授精组；自然受精组按雌雄性比为广4 1加入隔离培育后的雄蛘，每天定时检查自然受精组的待孕雌蛘外鳃丝，当累计有80%的雌蛘受精，提示开始进行人工授精组雄蛘的催产；
f、取出隔离培育的雄蛘，斧足肌肉注射5-羟色胺，注射剂量为4、微克/克雄蛘湿重； 注射后雄蛘离水，室温平放1(Γ30分钟，观察雄蛘出水口的分泌物，取每个雄蛘的分泌物， 显微镜下检查每个雄蛘的分泌物内是否有精子，当该雄蛘的分泌物内的精子有50%以上数量精子成熟并做快速运动时，该雄蛘及分泌物用于人工授精；
g、将用于人工授精的雄蛘及分泌物立即移入人工授精组的待孕雌蛘培育池中，用于人工授精的雄蛘数量与待孕雌蛘雌数量的比为广4 :1，培育池内暂停流动水，采用气泵增氧， 使得培育池中溶氧达到5、毫克/升，雄蛘移入人工授精组的待孕雌蛘培育池1(Γ30分钟， 人工授精完成。本发明的方法与已有技术相比具有以下优点
1、采用微流水培育技术，使雌蛘、雄蛘性腺快速完全发育；通过雌雄亲本隔离培育，防止自然受精的发生，并使雌雄亲本性腺发育同步，为提高人工授精的成功率奠定了基础；
2、以自然受精组作为对照，通过检查待孕雌蛘累计受精比例，精确确定雄蛘的人工催产时间，提高了雄蛘催产效率及成熟精子比例；
3、通过斧足肌肉注射5-羟色胺，促进雄蛘排精；注射后采用离水排精方式，避免精子大量排到水中后对雌蛘排卵诱导效率下降，提高了成熟精子的利用率；人工注射催产也避免了直接解剖取精对实验动物的伤害，同时缩短了人工授精的持续时间，实现了三角帆蛘受精过程的人工调控。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
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实施例1
1、2010年3月10日，从江苏太湖贡湖段采集三角帆蛘亲本1200只，从中挑选出4飞龄亲本，且贝壳完整无损、喷水有力、体质健康的个体290只，通过观察鳃丝间隔区分雌雄，选出雌蛘157只，雄蛘133只。2、用刻字机在选出的雌雄亲本贝壳表面以阿拉伯数字及字母标记后，分别放入小型培育池中强化培育，每个培育池的面积为2. 5平方米，雌蛘、雄蛘的放养密度均为8只/ 平方米，每个培育池的高度25厘米，培育池水位控制在1(Γ15厘米，利用高位池自流水作为水源保持培育池内为流动水，培育池内流动水的流速控制在0. 5米/分钟。3、隔离流水培育至2010年5月10日，近5日平均水温19. 5°C，检查雌蛘外鳃丝， 发现78只雌蛘外鳃丝达到完全膨胀饱满状态，选出作为待孕雌蛘。4、2010年5月10日，将78只待孕雌蛘随机平均分成2大组。一组为自然受精组，另一组为人工授精组；自然受精组按雌雄性比3 :1比例加入隔离培育的雄蛘；每天上午 10:00检查自然受精组的待孕雌蛘外鳃丝，至5月16日累计有32只(共计84. 6%)的雌蛘受精，提示可以开始人工授精组雄蛘的催产。5、2010年5月16日，10 :40取隔离培育的雄蛘30只，斧足肌肉注射5_羟色胺，剂量为5微克/克雄蛘湿重；注射后离水，室温平放30分钟后；观察出水口的分泌物，取分泌物镜检，其中有21只出现排精现象，14只雄蛘的分泌物中精子质量较好，达到50%以上快速运动标准，取13只雄蛘及分泌物准备用于人工授精。6、将准备用于人工授精的13排精雄蛘及分泌物立即移入人工授精组待孕雌蛘培育池中，雌雄性比3 :1 ；暂停培育池内的流动水，采用气泵增氧，使得培育池中溶氧达到5毫克/升；10分钟后检查待孕雌蛘外鳃丝，观只排卵受精，人工受精比例达71. 8%。实施例2
1、2010年3月10日，从江苏太湖贡湖段采集三角帆蛘亲本1200只，从中挑选出4 6 龄亲本，且贝壳完整无损、喷水有力、体质健康的个体290只，通过观察鳃丝间隔区分雌雄， 选出雌蛘157只，雄蛘133只。2、用刻字机在选出的雌雄亲本贝壳表面以阿拉伯数字及字母标记后，分别放入小型培育池中强化培育，雌蛘、雄蛘的放养密度均为10只/平方米，每个培育池的高度25厘米，每个培育池的水位为10厘米，每个培育池的面积为2. 5平方米，利用高位池自流水作为水源保持培育池内为流动水，培育池内流动水的流速控制在1. 5米/分钟。3、隔离流水培育至2010年5月25日，近5日平均水温20. 8°C，检查雌蛘外鳃丝， 发现80只雌蛘外鳃丝达到完全膨胀饱满，选出作为待孕雌蛘。4、2010年5月25日，将80只待孕雌蛘随机平均分成2大组，一组为自然受精组， 另一组为人工授精组；自然受精组按雌雄性比4 1比例加入隔离培育的雄蛘，用于自然受精的雄蛘共有10只；每天上午10 00检查自然受精组的待孕雌蛘外鳃丝，至5月27日累计有37只(共计92. 5%)雌蛘已受精，提示可以开始人工授精雄蛘的催产。5、2010年5月27日，11 :00取隔离培育的雄蛘40只，斧足肌肉注射5_羟色胺，剂量为9微克/克雄蛘湿重；注射后离水，室温平放30分钟后，取出水口分泌物镜检，其中有 35只催产雄蛘出现排精，20只精子活力好，达到50%以上快速运动标准，取10只雄蛘及分泌物准备用于人工授精。
6、将用于人工授精的10只排精雄蛘及分泌物立即移入待孕雌蛘培育池中，雌雄性比为4 :1 ；暂停培育池内的流动水，采用气泵增氧，使得培育池中溶氧达到6毫克/升；20 分钟后检查待孕雌蛘外鳃丝，35只排卵受精，人工受精比例达87. 5%。实施例3
1、2011年3月15日，从中国水产科学研究院淡水渔业研究中心江阴实验基地太湖三角帆蛘亲本池塘，挑选出贝壳完整无损、喷水有力、体质健康的个体255只，根据2010年的贝壳表面标记，其中雌蛘138只，雄蛘117只。2、将选出的雌雄亲本分别放入小型培育池中强化培育，雌蛘、雄蛘的放养密度均为5只/平方米，每个培育池的高度25厘米，每个培育池的水位15厘米，每个培育池的面积为2. 5平方米，利用高位池自流水作为水源保持培育池内为流动水，培育池内流动水的3 米/分钟。3、隔离流水培育至2010年5月26日，近5日平均水温21. 5°C，检查雌蛘外鳃丝， 发现102只雌蛘外鳃丝完全膨胀饱满，选出作为待孕雌蛘。4,2009年5月沈日，将102只待孕雌蛘随机平均分成2大组，一组为自然受精组， 另一组为人工授精组；自然受精组按雌雄性比1:1增加隔离培育的雄蛘，用于自然受精的雄蛘共有51只；在同等条件下流水培育。每天上午10 00检查自然受精组的待孕雌蛘外鳃丝，至5月观日累计有45只(共计88. 2%)雌蛘已受精，提示可以开始人工授精组雄蛘的催产。5、5月观日，11 :00取隔离培育的雄蛘70只，斧足肌肉注射5-羟色胺，剂量为4 微克/克雄蛘湿重；注射后离水，室温平放30分钟后，观察出水口的分泌物，取分泌物镜检， 有60只雄蛘出现排精现象，51只雄蛘的精子质量较好，达到50%以上快速运动标准，该51 只雄蛘及分泌物准备全部用于人工授精。6、将用于人工授精的51只雄蛘及分泌物立即移入待孕雌蛘培育池中，雌雄性比 1 1 ；暂停培育池内的流动水，采用气泵增氧，使得培育池中溶氧达到8毫克/升；30分钟后检查待孕雌蛘外鳃丝，42只排卵受精，人工授精比例达82. 4%。本发明的方法实现了三角帆蛘受精过程的人工调控，在1(Γ30分钟，三角帆蛘人工授精率可达709Γ90%，为开展三角帆蛘多倍体育种、家系选育等研究创造了基本条件。
权利要求
1. 一种三角帆蛘人工催产及授精的方法，其特征是该方法包括以下步骤a、选取贝壳完整无损、喷水有力、健康的三角帆蛘4飞龄亲本并鉴别其性别；b、在鉴别完雌雄性别的亲本的贝壳表面进行标记，并记录标记后亲本个体相关信息； C、将标记后的亲本按照雌雄性别隔离进行培育池放养培育，放养密度均为5 10只/平方米，培育池水位控制在1(Γ15厘米，利用高位池自流水作为水源保持培育池内为流动水， 培育池内流动水的流速控制在0. 5^3米/分钟；d、亲本隔离培育至5月中旬，当近5日平均水温达1纩25°C，检查雌蛘外鳃丝状态；当外鳃丝完全膨胀并充满两侧外套腔时，选出作为待孕雌蛘；e、将选出的待孕雌蛘随机分成两组隔离培育，一组为自然受精组，另一组为人工授精组；自然受精组按雌雄性比为广4 1加入隔离培育后的雄蛘，每天定时检查自然受精组的待孕雌蛘外鳃丝，当累计有80%的雌蛘受精，提示开始进行人工授精组雄蛘的催产；f、取出隔离培育的雄蛘，斧足肌肉注射5-羟色胺，注射剂量为4、微克/克雄蛘湿重； 注射后雄蛘离水，室温平放1(Γ30分钟，观察雄蛘出水口的分泌物，取每个雄蛘的分泌物， 显微镜下检查每个雄蛘的分泌物内是否有精子，当该雄蛘的分泌物内的精子有50%以上数量精子成熟并做快速运动时，该雄蛘及分泌物用于人工授精；g、将用于人工授精的雄蛘及分泌物立即移入人工授精组的待孕雌蛘培育池中，用于人工授精的雄蛘数量与待孕雌蛘雌数量的比为广4 :1，培育池内暂停流动水，采用气泵增氧， 使得培育池中溶氧达到5、毫克/升，用于人工授精的雄蛘的分泌物移入人工授精组的待孕雌蛘培育池1(Γ30分钟，人工授精完成。
全文摘要
本发明公开了一种三角帆蚌人工催产及授精的方法，该方法包括选择4~6龄亲本并鉴别性别、雌雄隔离培育池微流水同步培育、选出待孕雌蚌、待孕雌蚌分成自然授精组和人工授精组、雄蚌注射催产剂与人工授精各步骤。本发明的方法实现了三角帆蚌受精过程的人工调控，在10~30分钟，三角帆蚌人工授精率可达70%~90%，为开展三角帆蚌多倍体育种、家系选育等研究创造了基本条件。
文档编号A01K61/00GK102524134SQ20121003357
公开日2012年7月4日 申请日期2012年2月15日 优先权日2012年2月15日
发明者华丹, 周鑫, 徐钢春, 聂志娟, 闻海波, 顾若波 申请人:中国水产科学研究院淡水渔业研究中心