专利名称：一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域。
背景技术：
杨属Populus L.在全世界约有100多种,广泛分布于欧亚和北美洲。我国约有62种，是世界杨树种质资源最多的国家。杨属植物因其生长快、适应性强、用途广泛，不仅在水土保持和维护生态平衡方面发挥重要作用，而且还具有广泛的工业用途，是制浆造纸、胶合板、包装材料等的重要原料。长期以来，杨树的改良主要通过杂交育种的方式进行，但因其生长发育受光照、水分、温度很多因素影响，与其它农作物和园艺植物比较，有许多特有的生物学特性，如较长的生长周期、复杂的生殖方式、高度杂合性等，使得传统的杨树育种方法已远远不能满足现代育种的要求，所以，利用组织培养技术和基因工程方法来满足实践中对杨树育种的要求具有重要的意义。进入二十世纪八十年代后，随着分子生物学理论和技术的快速发展，以1983年首株转基因烟草问世为标志，功能基因的克隆和转基因技术已广泛应用到植物抗性的研究领域。尽管以木本植物为实验材料的林木基因工程因研究难度较大，进展相对滞后，但是由于杨树生长速度快，易繁殖，核基因组(约420Mb)及染色体数目相对较小，易于通过农杆菌转化，使得杨树成为研究树木分子生物学、林业生物技术及树木基因组的模式植物。目前，在植物上应用的遗传转化方法主要有DNA直接转移法和根癌农杆菌(Agrobactenium tumefaciens)介导法。其中后者最为常用，是目前应用最广泛且结果较为理想、技术较为成熟的一种基因转化方法。它具有操作简便，外源基因插入一般为单拷贝或低拷贝，整合位点稳定，转移DNA片段明确，整合后外源基因结构变异小，可转移大片段DNA，可直接用不同的植物组织进行基因转移等优点。已被应用于双子叶植物的遗传转化研究，现有的转基因植物如烟草拟南芥西红柿玉米等，80%以上是通过这种方法获得的。虽然目前对杨属的遗传转化已逐步趋于深入，但是这些研究多应用于胡杨、欧洲黑杨、毛果杨、小叶杨等树种，对白杨派及其杂种无性系的研究相对较少；而且目前所用的农杆菌介导法对白杨派并不适用。鉴于白杨派树种具有适应生境广、抗逆性强、乡土树种多、种间杂交能力强、能在大陆半干旱带和大陆湿润带等广泛生境范围内栽培并可发挥较大的生产作用等独特优势，本研究以白杨杂种无性系717_1B4(P. tremulaXP. alba)为实验对象，建立了一种农杆菌介导的基因转化方法。
发明内容
本发明目的是提供一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法。本发明的技术方案概述如下一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法，包括下述步骤(I)预培养
将717杨树( P. tremulaXP. alba)腋芽或顶芽置于基本培养基上继代繁殖，培养4-6周获得组培苗；切取所述组培苗0. 8-1. 5cm不带腋芽的茎段，用刀片沿着茎段纵轴方向划2-3次造成伤口或切取所述组培苗的带有0. 1-0. 5cm2叶片的叶柄置于Ml'培养基中，于24-26°C黑暗条件下预培养2-3天；(2)菌种活化与培养用移液枪枪头挑取_80°C保存的农杆菌至含有抗生素的YEB固体培养基上，27-29°C倒置暗培养20-28h ;挑取培养后的农杆菌在另一含有抗生素的YEB固体培养基上划线，27-29°C倒置暗培养36-48h ；挑取单菌落至含有抗生素的2-4mLYEB液体培养基的无菌试管中，150_200rpm27-29°C暗培养12-16h ;吸取0. 1-1. OmL菌液至含有抗生素的50_75mLYEB液体培养基的锥形瓶中，150-200rpm 27-29°C暗培养至 OD600 = 0. 6-0. 8 ；(3)侵染将步骤(2)获得的菌液在室温、3500-4000rpm离心10_15min，弃去上清液，将沉淀用 50-75mL M 液重悬，24_26°C，80-100rpm 活化 0. 5_lh 得到侵染液；按 30-50 个25mL的比例将经步骤(I)预培养的茎段或带有叶片的叶柄放入所述侵染液中，24-26°C条件下80-100rpm 侵染 30_60min ；(4)共培养从侵染液中取出茎段或带有叶片的叶柄，置于无菌滤纸上吸干表面残留的侵染液，放在Ml固体培养基上，24-26 0C，暗条件下共培养2-3天；(5)延迟选择取出步骤(4)共培养的茎段或带有叶片的叶柄，先用去离子水在180-220rpm下洗涤4-5min，洗涤2_3次，接着用浓度为350-500mg/L的头孢霉素-去离子水溶液洗涤
4-5min,洗涤2_3次，用无菌滤纸上吸干表面水分并转移至CM延迟选择培养基中，24-26°C暗培养10-11天，取出更换至新的CM延迟选择培养基上继续24-26°C暗培养10-11天，得到带有愈伤组织的茎段或叶柄；(6)诱导不定芽将所述带有愈伤组织的茎段或叶柄转移至SIMa筛选培养基中，光照条件下进行培养，每15-20天更换一次培养基；待长出绿色愈伤组织0. 2-0. 5cm2，取出绿色愈伤组织至新鲜SIMa筛选培养基中培养，待绿色愈伤组织表面开始长出不定芽；将带有不定芽的绿色愈伤组织转移到含有SIMb筛选培养基的组培瓶中，直到不定芽生长至l-2cm ；(7)伸长培养切割留有少量愈伤组织的呈玻璃化状态的不定芽，转移至含有SEM筛选培养基的组培瓶中进行伸长培养，培养2-4周，获得表型趋于正常的芽；(8)诱导生根及检测取步骤(7)获得的芽，切去底部膨大部位，转入RM培养基中，诱导生根，从已生根的再生杨树上剪取叶片提取基因组DNA，并进行全基因组PCR检测，验证农杆菌基因转化了的杂交杨树。步骤(I)中所述Ml'培养基的组成为MS盐4. 4g，蔗糖20_30g，生长素NAAI. 86mg,细胞分裂素 2ip I. 02mg, pH = 5. 6-5. 8，琼脂 7-7. 2g，加水至 1L。
步骤(2)中所述农杆菌为C58/pMP90/pH7GWIWG2 (I)时，所述抗生素为利福平(Rifampicin)、庆大霉素(Gentamicin)和壮观霉素(spectinomycin),在YEB固体培养基或YEB液体培养基中利福平的浓度为25-50mg/L、庆大霉素的浓度为20_30mg/L、壮观霉素的浓度为30-50mg/L。步骤⑶中所述M液的组成为MS盐4. 4g，蔗糖20_30g，生长素NAA I. 86mg,细胞分裂素 2ip I. 02mg, pH = 5. 6-5. 8，乙酰丁香酮 19. 86mg，加水至 IL0步骤(4)中所述Ml固体培养基的组成为MS盐4.4g，蔗糖20_30g，生长素NAAI. 86mg，细胞分裂素 2ip I. 02mg,pH = 5. 6-5. 8，乙酰丁香酮 19. 86mg，琼脂 7-7. 2g，加水至IL0步骤(5)中所述CM延迟选择培养基的组成为MS盐4. 4g，蔗糖20_30g，生长素NAA1. 86mg, pH = 5. 6-5. 8，细胞分裂素 2ip I. 02mg,头孢霉素 350_500mg，琼脂 7-7. 2g，加水至1L。步骤(6)中所述SMa筛选培养基的组成为MS盐4. 4g，蔗糖20_30g，细胞分裂素TDZO. 05mg, pH = 5. 6-5. 8，头孢霉素 350_500mg,潮霉素 B IOmg,琼脂 7-7. 2g，加水至 1L，所述光照条件下进行培养的培养条件为培养温度22-26°C，光照1500-20001UX，光照周期光照/黑暗为16h/8h。步骤(6)中所述SMb筛选培养基的组成为MS盐4. 4g，蔗糖20_30g，细胞分裂素TDZO. 0022mg,头孢霉素 350_500mg,潮霉素 B IOmg, pH = 5. 6-5. 8，琼脂 7-7. 2g，加水至 1L。步骤(7)中所述SEM筛选培养基的组成为MS盐4. 4g，蔗糖20_30g，细胞分裂素BAPO. 05mg,头孢霉素 350-500mg,潮霉素 B IOmg, pH = 5. 6-5. 8，琼脂 7-7. 2g，加水至 1L。步骤⑶中所述RM培养基的组成为MS盐2. 2g，蔗糖20_30g，头孢霉素350-500mg,潮霉素 B IOmg, pH = 5. 6-5. 8，琼脂 7-7. 2g，加水至 IL0本发明提供了一种高效的用于杂交杨树转化的方法，NAA和2ip联合作用诱导经农杆菌介导的茎段或叶柄产生愈伤组织，在细胞分裂素TDZ作用下，促使愈伤再分化形成不定芽，呈玻璃化状态的幼芽在BAP诱导下伸长，形态逐渐趋于正常，具有抗性的再生杨树在含有抗生素潮霉素的1/2MS培养基中生根。本方法获得的抗性转基因杨树，周期短，转化效率高，为转基因杨树在实践中的育种提供了坚实的基础和理论支持。本发明可在短时间内选育出新杂交杨抗逆、抗虫等新品种，为林木的遗传改良提供了一个新途径。
图I侵染时间对717杨树转化效率的影响图2乙酰丁香酮的浓度对717杨树转化效率的影响图3延迟选择时间对717杨树转化效率的影响图4全基因组PCR检测结果
具体实施方式
本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，并不能对本发明作任何限制。下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例I一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法，包括下述步骤(I)预培养 将717杨树(P. tremulaXP. alba)腋芽置于基本培养基上继代繁殖，培养4周获得组培苗；切取组培苗0. 8-1. 5cm不带腋芽的茎段，用刀片沿着茎段纵轴方向划2次造成伤口置于Ml'培养基中，于24°C黑暗条件下预培养2天；(2)菌种活化与培养用移液枪枪头挑取_80°C保存的农杆菌C58/pMP90/pH7GWIWG2 (I)至含有利福平、庆大霉素和壮观霉素的YEB固体培养基上，27°C倒置暗培养20h ;挑取培养后的农杆菌在另一含有与前面同样的抗生素的YEB固体培养基上划线，27°C倒置暗培养48h ；挑取单菌落至含有与前面同样的抗生素2mLYEB液体培养基的无菌试管中，150rpm 27°C暗培养16h ;吸取0. ImL菌液至含有与前面同样的抗生素的60mLYEB液体培养基的锥形瓶中，150rpm 27°C暗培养至OD600 = 0 . 7 ；在YEB固体培养基或YEB液体培养基中利福平的浓度为50mg/L、庆大霉素的浓度为30mg/L、壮观霉素的浓度为30mg/L ；(3)侵染将步骤(2)获得的菌液在室温、3500rpm离心15min，弃去上清液，将沉淀用60mL M液重悬，240C，90rpm活化30min得到侵染液；按50个25mL的比例将经步骤⑴预培养的茎段放入所述侵染液中，24°C条件下90rpm侵染30min ；(4)共培养从侵染液中取出茎段，置于无菌滤纸上吸干表面残留的侵染液，放在Ml固体培养基上，24V，暗条件下共培养2天；(5)延迟选择取出步骤(4)共培养的莖段,先用去离子水在180rpm下洗漆5min,洗漆2次,接着用浓度为500mg/L的头孢霉素-去离子水溶液洗涤5min，洗涤2次，用无菌滤纸上吸干表面水分并转移至CM延迟选择培养基中，24°C暗培养11天，取出更换至新的CM延迟选择培养基上继续24°C暗培养10天，得到带有愈伤组织的茎段；(6)诱导不定芽将所述带有愈伤组织的茎段转移至SMa筛选培养基中，光照条件下进行培养，每20天更换一次培养基；待长出绿色愈伤组织0. 2-0. 5cm2，取出绿色愈伤组织至新鲜SIMa筛选培养基中培养，待绿色愈伤组织表面开始长出不定芽；将带有不定芽的绿色愈伤组织转移到含有SIMb筛选培养基的组培瓶中，直到不定芽生长至l-2cm ；(7)伸长培养切割留有少量愈伤组织的呈玻璃化状态的不定芽，转移至含有SEM筛选培养基的组培瓶中进行伸长培养，培养3周，获得表型趋于正常的芽；(8)诱导生根及检测取步骤(7)获得的芽，切去底部膨大部位，转入RM培养基中，诱导生根，从已生根的再生杨树上剪取叶片提取基因组DNA，并进行全基因组PCR检测，验证农杆菌基因转化了的杂交杨树(见图4)。
基本培养基1/2 MS，蔗糖25g，pH 5. 6，琼脂7. 2g，余量为水。Ml'培养基的组成为MS盐4. 4g，蔗糖25g，生长素NAA I. 86mg,细胞分裂素2ipI. 02mg, pH = 5.6,琼脂 7. 2g，加水至 1L。M液的组成为MS盐4. 4g,鹿糖25g,生长素NAA I. 86mg,细胞分裂素2ip I. 02mg,pH = 5. 6,乙酰丁香酮19. 86mg,加水至1L。Ml固体培养基的组成为MS盐4. 4g,鹿糖25g,生长素NAA 1.86mg,细胞分裂素2ipl. 02mg, pH = 5. 6,乙酰丁香酮 19. 86mg,琼脂 7. 2g，加水至 1L。CIM延迟选择培养基的组成为MS盐4. 4g，蔗糖25g，生长素NAA I. 86mg, pH =5. 6，细胞分裂素2ip I. 02mg,头孢霉素400mg,琼脂7. 2g，加水至IL0SIMa筛选培养基的组成为MS盐4. 4g，蔗糖25g，细胞分裂素TDZ 0. 05mg, pH =5. 6，头孢霉素400mg，潮霉素B IOmg,琼脂7. 2g,加水至1L，所述光照条件下进行培养的培养条件为培养温度24°C，光照15001uX，光照周期光照/黑暗为16h/8h。SIMb筛选培养基的组成为MS盐4. 4g，蔗糖25g，细胞分裂素TDZ 0. 0022mg,头孢霉素400mg,潮霉素B IOmg, pH = 5.6,琼脂7. 2g，加水至IL0SEM筛选培养基的组成为MS盐4. 4g，蔗糖25g，细胞分裂素BAP 0. 05mg,头孢霉素400mg,潮霉素B IOmg, pH = 5.6,琼脂7. 2g，加水至IL0RM培养基的组成为MS盐2.2g，蔗糖25g，头孢霉素400mg，潮霉素B IOmg, pH =5. 6，琼脂7. 2g，加水至1L。实施例2一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法，包括下述步骤(I)预培养将717杨树(P. tremulaXP. alba)顶芽置于基本培养基上继代繁殖，培养5周获得组培苗；切取所述组培苗的带有0. 1-0. 5cm2叶片的叶柄，置于Ml'培养基中，于26°C黑暗条件下预培养3天；(2)菌种活化与培养用移液枪枪头挑取_80°C保存的农杆菌C58/pMP90/pH7GWIWG2 (I)至含有利福平，庆大霉素和壮观霉素的YEB固体培养基上，28°C倒置暗培养24h ;挑取培养后的农杆菌在另一含有与前面同样的抗生素的YEB固体培养基上划线，28°C倒置暗培养40h ；挑取单菌落至含有与前面同样的抗生素的3mLYEB液体培养基的无菌试管中，180rpm 28°C暗培养14h ;吸取0. 5mL菌液至含有与前面同样的抗生素的50mLYEB液体培养基的锥形瓶中，180rpm 28°C暗培养至OD6tltl = 0. 6 ；在YEB固体培养基或YEB液体培养基中利福平的浓度为25mg/L、庆大霉素的浓度为25mg/L、壮观霉素的浓度为50mg/L ；(3)侵染将步骤(2)获得的菌液在室温、3750rpm离心13min，弃去上清液，将沉淀用50mL M液重悬，260C，80rpm活化45min得到侵染液；按40个25mL的比例将经步骤⑴预培养的叶柄放入所述侵染液中，26°C条件下80rpm侵染45min ；(4)共培养从侵染液中取出叶柄，置于无菌滤纸上吸干表面残留的侵染液，放在Ml固体培养基上，26 °C，暗条件下共培养60h ；(5)延迟选择取出步骤(4)共培养的叶柄,先用去离子水在200rpm下洗漆4min,洗漆3次,接着用浓度为350mg/L的头孢霉素-去离子水溶液洗涤4min，洗涤3次，用无菌滤纸上吸干表面水分并转移至CM延迟选择培养基中，26°C暗培养10天，取出更换至新的CM延迟选择培养基上继续26°C暗培养11天，得到带有愈伤组织的叶柄；(6)诱导不定芽将所述带有愈伤组织的叶柄转移至SIMa筛选培养基中，光照条件下进行培养，每17天更换一次培养基；待长出绿色愈伤组织0. 2-0. 5cm2，取出绿色愈伤组织至新鲜SIMa筛选培养基中培养，待绿色愈伤组织表面开始长出不定芽；将带有不定芽的绿色愈伤组织转移到含有SIMb筛选培养基的组培瓶中，直到不定芽生长至l-2cm ；(7)伸长培养切割留有少量愈伤组织的呈玻璃化状态的不定芽，转移至含有SEM筛选培养基的组培瓶中进行伸长培养，培养2周，获得表型趋于正常的芽；(8)诱导生根及检测取步骤(7)获得的芽，切去底部膨大部位，转入RM培养基中，诱导生根，从已生根的再生杨树上剪取叶片提取基因组DNA，并进行全基因组PCR检测，验证农杆菌基因转化了的杂交杨树。基本培养基1/2MS，蔗糖20g，pH 5. 8，琼脂7. lg，余量为水。Ml'培养基的组成为MS盐4. 4g，蔗糖20g，生长素NAA I. 86mg,细胞分裂素2ip
I.02mg, pH = 5. 8,琼脂 7. Ig,加水至 1L。M液的组成为MS盐4. 4g,鹿糖20g,生长素NAA I. 86mg,细胞分裂素2ip I. 02mg,pH = 5. 8,乙酰丁香酮19. 86mg,加水至1L。Ml固体培养基的组成为MS盐4. 4g,鹿糖20g,生长素NAA 1.86mg,细胞分裂素2ipl. 02mg, pH = 5. 8,乙酰丁香酮 19. 86mg,琼脂 7. lg，加水至 1L。CIM延迟选择培养基的组成为MS盐4. 4g，蔗糖20g，生长素NAA I. 86mg, pH =5. 8，细胞分裂素2ip I. 02mg,头孢霉素350mg,琼脂7. Ig,加水至IL0SIMa筛选培养基的组成为MS盐4. 4g，蔗糖20g，细胞分裂素TDZ 0. 05mg, pH =5. 8，头孢霉素350mg，潮霉素B IOmg,琼脂7. Ig,加水至1L，所述光照条件下进行培养的培养条件为培养温度26°C，光照18001uX，光照周期光照/黑暗为16h/8h。SIMb筛选培养基的组成为MS盐4. 4g，蔗糖20g，细胞分裂素TDZ 0. 0022mg,头孢霉素350mg,潮霉素B IOmg, pH = 5.8,琼脂7. Ig,加水至IL0SEM筛选培养基的组成为MS盐4. 4g，蔗糖20g，细胞分裂素BAP 0. 05mg,头孢霉素350mg,潮霉素B IOmg, pH = 5.8,琼脂7. Ig,加水至IL0RM培养基的组成为MS盐2.2g，蔗糖20g，头孢霉素350mg，潮霉素B IOmg, pH =5. 8，琼脂7. lg，加水至1L。 实施例3一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法，包括下述步骤(I)预培养
将717杨树(P. tremulaXP. alba)腋芽置于基本培养基上继代繁殖，培养6周获得组培苗；切取所述组培苗0. 8-1. 5cm不带腋芽的茎段，用刀片沿着茎段纵轴方向划3次造成伤口置于Ml'培养基中，于25°C黑暗条件下预培养3天；(2)菌种活化与培养用移液枪枪头挑取_80°C保存的农杆菌C58/pMP90/pH7GWIWG2 (I)至含有利福平，庆大霉素和壮观霉素的YEB固体培养基上，29°C倒置暗培养28h ;挑取培养后的农杆菌在另一含有与前面同样的抗生素的YEB固体培养基上划线，29°C倒置暗培养36h ；挑取单菌落至含有与前面同样的抗生素的4mLYEB液体培养基的无菌试管中，200rpm29°C暗培养12h ;吸取ImL菌液至含有与前面同样的抗生素的75mLYEB液体培养基的锥形瓶中，200rpm 29°C暗培养至OD6tltl = 0. 8 ；在YEB固体培养基或YEB液体培养基中利福平的浓度为30mg/L、庆大霉素的浓度为20mg/L、壮观霉素浓度为40mg/L ；(3)侵染将步骤(2)获得的菌液在室温、4000rpm离心lOmin，弃去上清液，将沉淀用75mLM液重悬，250C，IOOrpm活化60min得到侵染液；按30个25mL的比例将经步骤⑴预培养的莖段放入所述侵染液中，25°C条件下IOOrpm侵染60min ；(4)共培养从侵染液中取出茎段，置于无菌滤纸上吸干表面残留的侵染液，放在Ml固体培养基上，25 0C，暗条件下共培养3天；(5)延迟选择取出步骤(4)共培养的茎段，先用去离子水在220rpm下洗涤5min，洗涤2次，接着用浓度为500mg/L的头孢霉素-去离子水溶液洗涤5min，洗涤2次，用无菌滤纸上吸干表面水分并转移至CM延迟选择培养基中，25°C暗培养10天，取出更换至新的CM延迟选择培养基上继续25°C暗培养11天，得到带有愈伤组织的茎段；(6)诱导不定芽将所述带有愈伤组织的茎段转移至SIMa筛选培养基中，光照条件下进行培养，每15天更换一次培养基；待长出绿色愈伤组织0. 2-0. 5cm2，取出绿色愈伤组织至新鲜SIMa筛选培养基中培养，待绿色愈伤组织表面开始长出不定芽；将带有不定芽的绿色愈伤组织转移到含有SIMb筛选培养基的组培瓶中，直到不定芽生长至l-2cm ；(7)伸长培养切割留有少量愈伤组织的呈玻璃化状态的不定芽，转移至含有SEM筛选培养基的组培瓶中进行伸长培养，培养4周，获得表型趋于正常的芽；(8)诱导生根及检测取步骤(7)获得的芽，切去底部膨大部位，转入RM培养基中，诱导生根，从已生根的再生杨树上剪取叶片提取基因组DNA，并进行全基因组PCR检测，验证农杆菌基因转化了的杂交杨树。基本培养基1/2MS，蔗糖30g，pH 5. 7，琼脂7. Og，余量为水。Ml'培养基的组成为MS盐4. 4g，蔗糖30g，生长素NAA I. 86mg，细胞分裂素2ip
I.02mg, pH = 5. 7，琼脂 7. Og,加水至 IL0
M液的组成为MS盐4. 4g,鹿糖30g,生长素NAA I. 86mg,细胞分裂素2ip I. 02mg,pH = 5. 7,乙酰丁香酮19. 86mg,加水至1L。Ml固体培养基的组成为MS盐4.4g，蔗糖30g，生长素NAA I. 86mg，细胞分裂素2ipl. 02mg, pH = 5. 7,乙酰丁香酮 19. 86mg,琼脂 7. 0g，加水至 1L。CIM延迟选择培养基的组成为MS盐4. 4g，蔗糖30g，生长素NAA I. 86mg, pH =5. 7，细胞分裂素2ip I. 02mg,头 孢霉素500mg,琼脂7. Og,加水至IL0SMa筛选培养基的组成为MS盐4. 4g，蔗糖30g，细胞分裂素TDZ 0. 05mg, pH =5. 7，头孢霉素500mg，潮霉素B IOmg,琼脂7. Og,加水至1L，所述光照条件下进行培养的培养条件为培养温度22°C，光照20001uX，光照周期光照/黑暗为16h/8h。SMb筛选培养基的组成为MS盐4. 4g，蔗糖30g，细胞分裂素TDZ 0.0022mg，头孢霉素500mg,潮霉素B IOmg, pH = 5. 7，琼脂7. Og,加水至IL0SEM筛选培养基的组成为MS盐4. 4g，蔗糖30g，细胞分裂素BAP 0. 05mg,头孢霉素500mg,潮霉素B IOmg, pH = 5. 7，琼脂7. Og,加水至IL0RM培养基的组成为MS盐2. 2g，蔗糖30g，头孢霉素500mg，潮霉素B IOmg, pH =5. 7，琼脂7. 0g，加水至1L。上面各实施例所涉及的MS盐(Duchefa Biochemie B. V.公司)各实施例中的YEB固体培养基牛肉浸膏5. Og/L、胰蛋白胨5. Og/L、酵母提取物
I.Og/L、蔗糖 5. 0g/L、MgSO4. 7H20 0. 5g/L、琼脂 15g/L ；pH = 7. 0，余量为水。各实施例中的YEB液体培养基牛肉浸膏5. 0g/L、胰蛋白胨5. 0g/L、酵母提取物
I.0g/L、蔗糖 5. 0g/L、MgSO4. 7H20 0. 5g/L、pH = 7. 0，余量为水。实施例4 :不同外植体类型对717 (P. tremulaXP. alba)杨树产生阳性抗性芽的影响本实验采用717杨树不带腋芽的茎段，带有0. 1-0. 5cm2叶片的叶柄，l_2cm2的叶片三种不同的组织作为农杆菌侵染的外植体材料。实验步骤和条件均采用实施例I的步骤和条件，结果表明(表I)，在其它转化条件相同的情况下，不同的外植体材料产生的抗潮霉素阳性再生芽的频率不同，其中茎段的转化效率最高，叶柄次之，但差异并不显著，而由叶片产生的再生芽的频率最低，几乎没有再生芽产生。因此本发明采用不带腋芽的茎段，带有0. 1-0. 5cm2叶片的叶柄作为合适的转化受体材料，而不选用现有技术常用的叶片为转化受体材料。这表明本发明中所建立的转化体系适合茎段及叶柄的转化，对以叶片作为外植体的转化并不适用。表I不同受体材料对717杨树产生抗性不定芽的影响
权利要求
1.一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法，其特征包括下述步骤 (1)预培养 将717杨树腋芽或顶芽置于基本培养基上继代繁殖，培养4-6周获得组培苗；切取所述组培苗0. 8-1. 5cm不带腋芽的茎段，用刀片沿着茎段纵轴方向划2-3次造成伤口或切取所述组培苗的带有0. 1-0. 5cm2叶片的叶柄置于Ml'培养基中，于24-26°C黑暗条件下预培养2-3 天； (2)菌种活化与培养 用移液枪枪头挑取_80°C保存的农杆菌至含有抗生素的YEB固体培养基上，27-29°C倒置暗培养20-28h ;挑取培养后的农杆菌在另一含有抗生素的YEB固体培养基上划线，27-29°C倒置暗培养36-48h ； 挑取单菌落至含有抗生素的2-4mLYEB液体培养基的无菌试管中，150_200rpm27-29°C暗培养12-16h ;吸取0. 1-1. OmL菌液至含有抗生素的50_75mLYEB液体培养基的锥形瓶中，150-200rpm 27-29°C暗培养至 OD600 = 0. 6-0. 8 ； (3)侵染 将步骤(2)获得的菌液在室温、3500-4000rpm离心10_15min，弃去上清液，将沉淀用 50-75mL M 液重悬，24_26°C，80-100rpm 活化 0. 5_lh 得到侵染液；按 30-50 个25mL 的比例将经步骤(I)预培养的茎段或带有叶片的叶柄放入所述侵染液中，24-26°C条件下80-100rpm 侵染 30_60min ； (4)共培养 从侵染液中取出茎段或带有叶片的叶柄，置于无菌滤纸上吸干表面残留的侵染液，放在Ml固体培养基上，24-26 °C，暗条件下共培养2-3天； (5)延迟选择 取出步骤(4)共培养的茎段或带有叶片的叶柄，先用去离子水在180-220rpm下洗涤4-5min，洗涤2_3次，接着用浓度为350-500mg/L的头孢霉素-去离子水溶液洗涤4_5min，洗涤2-3次，用无菌滤纸上吸干表面水分并转移至CM延迟选择培养基中，24-26°C暗培养10-11天，取出更换至新的CM延迟选择培养基上继续24-26°C暗培养10-11天，得到带有愈伤组织的茎段或叶柄； (6)诱导不定芽 将所述带有愈伤组织的茎段或叶柄转移至SIMa筛选培养基中，光照条件下进行培养，每15-20天更换一次培养基；待长出绿色愈伤组织0. 2-0. 5cm2，取出绿色愈伤组织至新鲜SIMa筛选培养基中培养，待绿色愈伤组织表面开始长出不定芽；将带有不定芽的绿色愈伤组织转移到含有SIMb筛选培养基的组培瓶中，直到不定芽生长至l-2cm ； (7)伸长培养 切割留有少量愈伤组织的呈玻璃化状态的不定芽，转移至含有SEM筛选培养基的组培瓶中进行伸长培养，培养2-4周，获得表型趋于正常的芽； (8)诱导生根及检测 取步骤(7)获得的芽，切去底部膨大部位，转入RM培养基中，诱导生根，从已生根的再生杨树上剪取叶片提取基因组DNA，并进行全基因组PCR检测，验证农杆菌基因转化了的杂交杨树。
2.根据权利要求I所述的一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法，其特征在于步骤(I)中所述Ml'培养基的组成为MS盐4. 4g，蔗糖20-30g，生长素NAA 1.86mg，细胞分裂素2ipl. 02mg, pH = 5. 6-5. 8，琼脂 7-7. 2g，加水至 IL0
3.根据权利要求I所述的一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法，其特征在于步骤(2)中所述农杆菌为C58/pMP90/pH 7GWIWG2(I)，所述抗生素为利福平、庆大霉素和壮观霉素，在YEB固体培养基或YEB液体培养基中利福平的浓度为25-50mg/L、庆大霉素的浓度为20-30mg/L、壮观霉素的浓度为30-50mg/L。
4.根据权利要求I所述的一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法，其特征在于步骤(3)中所述M液的组成为MS盐4.4g，蔗糖20-30g，生长素NAA I. 86mg，细胞分裂素2ipI. 02mg, pH = 5. 6-5. 8,乙酰丁香酮 19. 86mg,加水至 1L。
5.根据权利要求I所述的一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法，其特征在于步骤(4)中所述Ml固体培养基的组成为MS盐4. 4g，蔗糖20-30g，生长素NAA 1.86mg，细胞分裂素2ipl. 02mg, pH = 5. 6-5. 8，乙酰丁香酮 19. 86mg，琼脂 7-7. 2g，加水至 IL0
6.根据权利要求I所述的一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法，其特征在于步骤(5)中所述CM延迟选择培养基的组成为MS盐4. 4g，蔗糖20-30g，生长素NAA I. 86mg, pH =5.6-5. 8，细胞分裂素2ip I. 02mg,头孢霉素350_500mg,琼脂7-7. 2g，加水至IL0
7.根据权利要求I所述的一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法，其特征在于步骤(6)中所述SMa筛选培养基的组成为MS盐4. 4g，蔗糖20_30g，细胞分裂素TDZ O. 05mg, pH=5. 6-5. 8，头孢霉素350-500mg，潮霉素B 10mg，琼脂7-7. 2g，加水至1L，所述光照条件下进行培养的培养条件为培养温度22-26°C，光照1500-20001uX，光照周期光照/黑暗为16h/8h。
8.根据权利要求I所述的一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法，其特征在于在步骤(6)中所述SMb筛选培养基的组成为MS盐4.4g，蔗糖20-30g，细胞分裂素TDZO. 0022mg,头孢霉素 350-500mg,潮霉素 B IOmg, pH = 5. 6-5. 8，琼脂 7-7. 2g，加水至 IL0
9.根据权利要求I所述的一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法，其特征在于在步骤(7)中所述SEM筛选培养基的组成为MS盐4.4g，蔗糖20_30g，细胞分裂素BAP O. 05mg,头孢霉素 350-500mg,潮霉素 B IOmg, pH = 5. 6-5. 8，琼脂 7-7. 2g，加水至 IL0
10.根据权利要求I所述的一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法，其特征在于在步骤(8)中所述RM培养基的组成为MS盐2.2g，蔗糖20-30g，头孢霉素350_500mg，潮霉素BIOmg, pH = 5. 6-5. 8，琼脂 7-7. 2g，加水至 IL0
全文摘要
本发明公开了一种杂交杨树的农杆菌基因转化方法，包括下述步骤(1)预培养；(2)菌种活化与培养；(3)侵染；(4)共培养；(5)延迟选择；(6)诱导不定芽；(7)伸长培养；(8)诱导生根及检测。本发明提供的方法，NAA和2ip联合作用诱导经农杆菌介导的茎段或叶柄产生愈伤组织，在细胞分裂素TDZ作用下，促使愈伤再分化形成不定芽，呈玻璃化状态的幼芽在BAP诱导下伸长，形态逐渐趋于正常，具有抗性的再生杨树在含有抗生素潮霉素的1/2MS培养基中生根。本方法获得的抗性转基因杨树，周期短，转化效率高，为转基因杨树在实践中的育种提供了坚实的基础和理论支持。
文档编号A01H5/00GK102634541SQ20121010490
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月11日 优先权日2012年4月11日
发明者王旭, 王洁华 申请人:天津大学