专利名称：培育耐盐耐低温长春花株系快速繁殖的方法
技术领域：
本发明涉及一种长春花的培养方法，特别是公开一种培育耐盐耐低温长春花株系快速繁殖的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
长春花(Catharanthusroseus)是夹竹桃科(Apocynaceae)植物，它含有 100多种吲哚生物碱，多数具有生物活性。由长春花提取或半合成的生物碱包括硫酸长春碱(vinblastine)、硫酸长春新碱(vincristine)、硫酸长春地辛(长春酰胺，Vindestine,VDS)、酒石酸长春瑞滨(Vinrelbine, VNB),是目前临床应用最广的天然植物抗肿瘤药物，现还有两个长春碱类似物(脱水长春碱anhydrovinblastine和20, 20’ - 二氟长春瑞宾，vinflunine)正在进行临床研究。长春花的研究开发也是目前最具潜力也是最为活跃的领域之一。长春碱和长春新碱在植物体中的含量极其微小，大约为十万分之一，化学合成也不太理想。所以长春碱和长春新碱长期供应紧张。医药工业用长春花目前主要来源于野生资源，在中国主要分布在海南、广东雷州半岛等地，而在长江流域，包括上海，仅有少量人工栽培，供园林观赏，且只限于夏季栽培收获，在盐碱滩涂更是生长缓慢、个小，在深秋基本停止生长、在冬季完全枯萎死亡。
发明内容
本发明的目的克服现有技术中存在的问题，利用植物快速繁殖和诱导技术，提供一种培育耐盐耐低温长春花株系快速繁殖的方法，实现长春花在长江流域、特别是利用盐碱滩涂，大面积的人工栽培。本发明是这样实现的一种培育耐盐耐低温长春花株系快速繁殖的方法，其特征在于包括如下步骤
I、分别制备长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基取MS基本培养基，以每升加入和6 8克琼脂粉得长春花生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入O. I O. 3克萘乙酸、2 4克6-苄氨基嘌呤、O. 2 O. 4克秋水仙素和6 8克琼脂粉为单位，得诱导生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入1(Γ20克氯化钠和6 8克琼脂粉为单位，得耐盐耐低温筛选培养基备用。2、长春花无菌苗的制备以长春花种子为外植体，将其用浓度为70%医用乙醇浸泡30秒，随后转移至浓度为O. 2%的氯化汞水溶液中进行表面消毒；将消毒后的外植体播种于固体生长培养基中，在温度为25+l°C,光照为100 μ mo I · m 2 · s 1条件下,经4周培养后，得无菌苗。3、耐盐耐低温长春花株系的诱导将步骤2所得无菌苗作为种源，接种于诱导生长培养基中扩增及诱导，培养条件为温度25+l°C、光照为IOOymol ·πΓ2 ^1，培养40天，得诱导长春花分化苗；将所诱导长春花分化苗在所述耐盐耐低温筛选培养基中接种，继续培养40天，培养条件为温度25+1 °C、光照为100 μ mo I · m_2 · s—1 ;随后从所得耐盐耐低温植株中提取获得生物喊。 将步骤I中所述长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基分别调节PH值至5. 8后，高压灭菌。将步骤I中所述长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基、用HCl或NaOH或两者结合调节长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基的PH值至5. 8后，分别高压灭菌，并将长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基分别分装于玻璃三角瓶中。所述玻璃三角瓶的容积为O. I升，所述玻璃三角瓶中长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基的体积分别占的玻璃三角瓶25%。本发明的有益效果是本发明方法实现了耐盐耐低温长春花株系快速繁殖培育，且培育的耐盐耐低温长春花株系与野生长春花有效成分含量相当，满足医药领域临床应用的需求。本发明培育过程全程可控，不受自然环境影响，耐盐耐低温长春花株系可以在盐碱滩涂正常生长，延长了长春花在长江流域的生长期、增加了长春花的生物量。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。实施例I :
本实施例包括如下步骤
I)长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基的制备取MS基本培养基，以每升加入和6克琼脂粉得长春花生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入O. I克萘乙酸、3克6-苄氨基嘌呤、O. 2克秋水仙素和6克琼脂粉为单位，得诱导生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入10克氯化钠和6克琼脂粉为单位，得耐盐耐低温筛选培养基备用。生长培养基调pH值用pH计测定固体生长培养基、液体生长培养基pH值，并用HCl和NaOH分别调节长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基的pH值到5. 8。然后以三角瓶作为反应器，将长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基分别分装于容积为O. I升的三角瓶中，每瓶装O. 025升生长培养基，即生长培养基的体积占反应器容积的25%，用棉花和纸封口后，进行高压灭菌，压力为1.2Kg/cm2，时间为20分钟，备用。2)长春花无菌苗的制备
以长春花种子为外植体，将其用浓度为70%医用乙醇浸泡30秒，随后转移至浓度为O. 1%的氯化汞水溶液中进行表面消毒；将消毒后的外植体播种于固体生长培养基中，在温度为25°C下、光照为ΙΟΟμπιοΙ · πΓ2 · s4,经4周培养后,得长春花无菌苗。3)耐盐耐低温长春花株系的诱导及长春碱的制备
将步骤2所得无菌苗作为种源，诱导生长培养基中扩增及诱导，培养条件为温度25+l°C、光照为ΙΟΟμπιοΙ ·πΓ2 Μ—1，培养40天，得诱导长春花分化苗；将所诱导长春花分化苗在所述耐盐耐低温筛选培养基中接种，继续培养40天，培养条件为温度25+l°C、光照为100 μ mol · m_2 · s—1 ;得耐盐耐低温长春花植株，随后从所得耐盐耐低温植株中提取获得生物碱。实施例2:
本实施例包括如下步骤。1)长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基的制备取MS基本培养基，以每升加入和6. 5克琼脂粉得长春花生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入O. 15克萘乙酸、2克6-苄氨基嘌呤、O. 3克秋水仙素和6. 5克琼脂粉为单位，得诱导生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入15克氯化钠和6. 5克琼脂粉为单位，得耐盐耐低温筛选培养基备用。生长培养基调pH值用pH计测定固体生长培养基、液体生长培养基pH值，并用HCl和NaOH分别调节长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基的pH值到5. 8。然后以三角瓶作为反应器，将长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基分别分装于容积为O. I升的三角瓶中，每瓶装O. 025升生长培养基，即生长培养基的体积占反应器容积的25%，用棉花和纸封口后，进行高压灭菌，压力为1.2Kg/cm2，时间为20分钟，备用。2)长春花无菌苗的制备
以长春花种子为外植体，将其用浓度为70%医用乙醇浸泡30秒，随后转移至浓度为O. 1%的氯化汞水溶液中进行表面消毒；将消毒后的外植体播种于固体生长培养基中，在温度为25°C下、光照为100 μ mol · πΓ2 · s4,经4周培养后,得长春花无菌苗。3)耐盐耐低温长春花株系的诱导及长春碱的制备
将步骤2所得无菌苗作为种源，诱导生长培养基中扩增及诱导，培养条件为温度25+l°C、光照为ΙΟΟμπιοΙ ·πΓ2 Μ—1，培养40天，得诱导长春花分化苗；将所诱导长春花分化苗在所述耐盐耐低温筛选培养基中接种，继续培养40天，培养条件为温度25+l°C、光照为100 μ mol · m_2 · s—1 ;得耐盐耐低温长春花植株，随后从所得耐盐耐低温植株中提取获得生物碱。实施例3
本实施例包括如下步骤。1)分别制备长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基取MS基本培养基，以每升加入和7克琼脂粉得长春花生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入0. 2克萘乙酸、3. 5克6-苄氨基嘌呤、0. 3克秋水仙素和7克琼脂粉为单位，得诱导生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入15克氯化钠和7克琼脂粉为单位，得耐盐耐低温筛选培养基备用。生长培养基调pH值用pH计测定固体生长培养基、液体生长培养基pH值，并用HCl和NaOH分别调节长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基的pH值到5. 8。然后以三角瓶作为反应器，将长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基分别分装于容积为0. I升的三角瓶中，每瓶装0. 025升生长培养基，即生长培养基的体积占反应器容积的25%，用棉花和纸封口后，进行高压灭菌，压力为1.2Kg/cm2，时间为20分钟，备用。2)长春花无菌苗的制备
以长春花种子为外植体，将其用浓度为70%医用乙醇浸泡30秒，随后转移至浓度为O. 1%的氯化汞水溶液中进行表面消毒；将消毒后的外植体播种于固体生长培养基中，在温度为25°C下、光照为100 μ mol · πΓ2 · s4,经4周培养后,得长春花无菌苗。3)耐盐耐低温长春花株系的诱导及长春碱的制备
将步骤2所得无菌苗作为种源，诱导生长培养基中扩增及诱导，培养条件为温度25+l°C、光照为ΙΟΟμπιοΙ ·πΓ2 Μ—1，培养40天，得诱导长春花分化苗；将所诱导长春花分化苗在所述耐盐耐低温筛选培养基中接种，继续培养40天，培养条件为温度25+l°C、光照为100 μ mol · m_2 · s—1 ;得耐盐耐低温长春花植株，随后从所得耐盐耐低温植株中提取获得生物碱。实施例4
本实施例包括如下步骤。I)长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基的制备取MS基本培养基，以每升加入和7. 5克琼脂粉得长春花生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入0. 25克萘乙酸、4克6-苄氨基嘌呤、0. 35克秋水仙素和7. 5克琼脂粉为单位，得诱导生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入18克氯化钠和6克琼脂粉为单位，得耐盐耐低温筛选培养基备用。生长培养基调pH值用pH计测定固体生长培养基、液体生长培养基pH值，并用HCl和NaOH分别调节长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基的pH值到5. 8。然后以三角瓶作为反应器，将长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基分别分装于容积为0. I升的三角瓶中，每瓶装0. 025升生长培养基，即生长培养基的体积占反应器容积的25%，用棉花和纸封口后，进行高压灭菌，压力为1.2Kg/cm2，时间为20分钟，备用。2)长春花无菌苗的制备
以长春花种子为外植体，将其用浓度为70%医用乙醇浸泡30秒，随后转移至浓度为0. 1%的氯化汞水溶液中进行表面消毒；将消毒后的外植体播种于固体生长培养基中，在温度为25°C下、光照为100 μ mol · πΓ2 · s4,经4周培养后,得长春花无菌苗。3)耐盐耐低温长春花株系的诱导及长春碱的制备
将步骤2所得无菌苗作为种源，诱导生长培养基中扩增及诱导，培养条件为温度25+l°C、光照为ΙΟΟμπιοΙ ·πΓ2 Μ—1，培养40天，得诱导长春花分化苗；将所诱导长春花分化苗在所述耐盐耐低温筛选培养基中接种，继续培养40天，培养条件为温度25+l°C、光照为100 μ mol · m_2 · s—1 ;得耐盐耐低温长春花植株，随后从所得耐盐耐低温植株中提取获得生物碱。实施例5
本实施例包括如下步骤。I)长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基的制备取MS基本培养基，以每升加入和8克琼脂粉得长春花生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入0. 3克萘乙酸、3. 5克6-苄氨基嘌呤、0. 4克秋水仙素和8克琼脂粉为单位，得诱导生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入20克氯化钠和8克琼脂粉为单位，得耐盐耐低温筛选培养基备用。生长培养基调pH值用pH计测定固体生长培养基、液体生长培养基pH值，并用HCl和NaOH分别调节长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基的pH值到5. 8。然后以三角瓶作为反应器，将长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基分别分装于容积为O. I升的三角瓶中，每瓶装O. 025升生长培养基，即生长培养基的体积占反应器容积的25%，用棉花和纸封口后，进行高压灭菌，压力为1.2Kg/cm2，时间为20分钟，备用。 2)长春花无菌苗的制备
以长春花种子为外植体，将其用浓度为70%医用乙醇浸泡30秒，随后转移至浓度为O. 1%的氯化汞水溶液中进行表面消毒；将消毒后的外植体播种于固体生长培养基中，在温度为25°C下、光照为100 μ mol · πΓ2 · s4,经4周培养后,得长春花无菌苗。3)耐盐耐低温长春花株系的诱导及长春碱的制备
将步骤2所得无菌苗作为种源，诱导生长培养基中扩增及诱导，培养条件为温度25+l°C、光照为ΙΟΟμπιοΙ ·πΓ2 Μ—1，培养40天，得诱导长春花分化苗；将所诱导长春花分化苗在所述耐盐耐低温筛选培养基中接种，继续培养40天，培养条件为温度25+l°C、光照为100 μ mol · m_2 · s—1 ;得耐盐耐低温长春花植株，随后从所得耐盐耐低温植株中提取获得生物碱。实施例6
本实施例包括如下步骤。I)长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基的制备取MS基本培养基，以每升加入和7. 8克琼脂粉得长春花生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入0. 25克萘乙酸、3. 5克6-苄氨基嘌呤、0. 35克秋水仙素和7. 5克琼脂粉为单位，得诱导生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入15克氯化钠和7. 5克琼脂粉为单位，得耐盐耐低温筛选培养基备用。生长培养基调pH值用pH计测定固体生长培养基、液体生长培养基pH值，并用HCl和NaOH分别调节长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基的pH值到5. 8。然后以三角瓶作为反应器，将长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基分别分装于容积为0. I升的三角瓶中，每瓶装0. 025升生长培养基，即生长培养基的体积占反应器容积的25%，用棉花和纸封口后，进行高压灭菌，压力为1.2Kg/cm2，时间为20分钟，备用。2)长春花无菌苗的制备
以长春花种子为外植体，将其用浓度为70%医用乙醇浸泡30秒，随后转移至浓度为
0.1%的氯化汞水溶液中进行表面消毒；将消毒后的外植体播种于固体生长培养基中，在温度为25°C下、光照为100 μ mol · πΓ2 · s4,经4周培养后,得长春花无菌苗。3)耐盐耐低温长春花株系的诱导及长春碱的制备
将步骤2所得无菌苗作为种源，诱导生长培养基中扩增及诱导，培养条件为温度25+l°C、光照为ΙΟΟμπιοΙ ·πΓ2 Μ—1，培养40天，得诱导长春花分化苗；将所诱导长春花分化苗在所述耐盐耐低温筛选培养基中接种，继续培养40天，培养条件为温度25+l°C、光照为100 μ mol · m_2 · s—1 ;得耐盐耐低温长春花植株，随后从所得耐盐耐低温植株中提取获得生物碱。
权利要求
1.一种培育耐盐耐低温长春花株系快速繁殖的方法，其特征在于包括如下步骤 1)分别制备长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基取MS基本培养基，以每升加入和6 8克琼脂粉得长春花生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入O. I O. 3克萘乙酸、2 4克6-苄氨基嘌呤、O. 2 O. 4克秋水仙素和6 8克琼脂粉为单位，得诱导生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入1(Γ20克氯化钠和6 8克琼脂粉为单位，得耐盐耐低温筛选培养基备用； 2)长春花无菌苗的制备以长春花种子为外植体，将其用浓度为70%医用乙醇浸泡30秒，随后转移至浓度为O. 2%的氯化汞水溶液中进行表面消毒；将消毒后的外植体播种于固体生长培养基中，在温度为25+l°C,光照为100 μ mo I · nf2 · s_1条件下,经4周培养后,得无菌苗； 3)耐盐耐低温长春花株系的诱导将步骤2所得无菌苗作为种源，接种于诱导生长培养基中扩增及诱导，培养条件为温度25+l°C、光照为ΙΟΟμπιοΙ ·πΓ2 μ—1，培养40天，得诱导长春花分化苗；将所诱导长春花分化苗在所述耐盐耐低温筛选培养基中接种，继续培养40天，培养条件为温度25+l°C、光照为ΙΟΟμπιοΙ · m_2 · s—1 ;随后从所得耐盐耐低温植株中提取获得生物碱； 将步骤I中所述长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基分别调节pH值至5. 8后，高压灭菌； 将步骤I中所述长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基、用HCl或NaOH或两者结合调节长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基的PH值至5. 8后，分别高压灭菌，并将长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基分别分装于玻璃三角瓶中。
2.根据权利要求I所述的培育耐盐耐低温长春花株系快速繁殖的方法，其特征在于所述玻璃三角瓶的容积为0. I升，所述玻璃三角瓶中长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基的体积分别占的玻璃三角瓶25%。
3.根据权利要求I或2所述的培育耐盐耐低温长春花株系快速繁殖的方法，其特征在于所述长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基的制备方法取MS基本培养基，以每升加入和6克琼脂粉得长春花生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入0. I克萘乙酸、3克6-苄氨基嘌呤、0. 2克秋水仙素和6克琼脂粉为单位，得诱导生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入10克氯化钠和6克琼脂粉为单位，得耐盐耐低温筛选培养基备用。
4.根据权利要求I或2所述的培育耐盐耐低温长春花株系快速繁殖的方法，其特征在于所述长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基的制备方法取MS基本培养基，以每升加入和7克琼脂粉得长春花生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入0. 2克萘乙酸、3. 5克6-苄氨基嘌呤、0. 3克秋水仙素和7克琼脂粉为单位，得诱导生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入15克氯化钠和7克琼脂粉为单位，得耐盐耐低温筛选培养基备用。
5.根据权利要求I或2所述的培育耐盐耐低温长春花株系快速繁殖的方法，其特征在于所述长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基的制备方法取MS基本培养基，以每升加入和8克琼脂粉得长春花生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入O. 3克萘乙酸、3. 5克6-苄氨基嘌呤、O. 4克秋水仙素和8克琼脂粉为单位，得诱导生长培养基备用；另取MS基本培养基，以每升加入20克氯化钠和8克琼脂粉为单位，得耐盐耐低温筛选培养基备用
全文摘要
本发明为一种培育耐盐耐低温长春花株系快速繁殖的方法。本发明以制备长春花生长培养基、诱导生长培养基和耐盐耐低温筛选培养基为基础，并以野生长春花叶片为原始材料诱导出无菌苗，经过无菌苗快速繁殖及多代诱导驯化，建立了适合耐盐耐低温长春花株系培育系统，耐盐耐低温长春花株系的生物碱含量比野生长春花要高20%左右。本发明的优点是(一)培育过程完全可控，不受自然环境的影响；(二)耐盐耐低温长春花可在盐碱滩涂正常生长；(三)延长了长春花在长江流域的生长期、增加了长春花的生物量。
文档编号A01H4/00GK102613088SQ20121011899
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月23日 优先权日2012年4月23日
发明者倪新忠, 倪迪安 申请人:上海安体康生植物化学有限公司