专利名称：一种羌活组织培养离体快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及一种植物的组织培养和离体快速繁殖，尤其涉及一种羌活组织培养离体快速繁殖方法。
背景技术：
芜;活是伞形科(UmbelIiferae)宪活属iNotopterygium)多年生植物,为我国特有的重要濒危植物，是中、藏、羌药中最常用的药材之一，也是市场缺口较大的中藏药材。羌活以根状茎及根入药，味辛、性温，有散表寒、祛风湿利关节等功效，主治感冒风湿、发热头痛、、皮肤瘙痒、风水浮肿等症。我国历版药典对羌活均有收载，据《中华人民共和国药典》2005年版一部，为伞形科(Umbelliferae)多年生草本植物芜;活incisum Tingex H. T. Chang)和宽叶宪活(A forbesii Boissieu)的干燥根莖及根,用药开发历史悠久。依据药材性状一般划分为蚕羌、竹节羌、大头羌和条羌4个商品等级。按产地不同分为川羌(四川)和西羌(青海、甘肃等)。青海是羌活药材的道地产区，畅销全国并出口，主产果洛、玉树、黄南、海东等地2800米以上的高海拔山区。羌活药材长期依赖野生采挖来满足国内外市场需求，种质资源破坏严重、蕴藏量急剧减少，羌活种群遭到了毁灭性破坏，致使其资源已无法满足市场需要。尤其是近年来随着国内外对羌活需求量的增加，供需矛盾日益突出，加之利益驱使，大量掠夺性采挖，使羌活逐渐成为濒危植物，面临物种丧失，资源枯竭的危险，进行种质资源保护和扩大羌活繁育势在必行。植物组织培养技术是利用细胞的全能性(即个体的某个器官或组织已经分化的细胞再生成完整个体的遗传潜力。)，取植物个体上的细胞团或组织，通过人工配制的培养基，使这些细胞团或组织形成成千上万个植株。利用组织培养进行离体快速繁殖有以下几方面重要意义⑴繁殖速度快，不受外界气候因素影响，一年四季在室内均可快速大量繁殖；(2)便于保持优良生物学特性；⑶在保存和繁育优良突变体或优良杂种一代方面有非常重要的意义，一株具有明显优势的羌活突变体或一个具明显优势的后代经组织培养后可大面积推
I 寸寸。文献报道了众多高山野生药材的组织培养，如雪莲、红景天等，但以野生羌活幼叶为外植体的组织培养尚未见报道。从野外采集的外植体，其表面滋生大量细菌和真菌等微生物，有的甚至长到组织内部；加之羌活所含醌类、酚类物质较多，很容易氧化褐变，因此对外植体材料的选择和消毒处理方法都是非常关键。本发明首次采用幼叶外植体组织培养方法，开展野生羌活种质离体繁殖研究工作，这为挽救珍稀濒危羌活种质资源，开展遗传改良、促进羌活的工厂化育苗提供了一条新途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种易于操作、可进行大规模工厂化生产的羌活组织培养离体快速繁殖方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种羌活组织培养离体快速繁殖方法，包括以下步骤
⑴外植体的选择和消毒处理以羌活的幼叶为外植体，经流水冲洗1(T20分钟，再用体积浓度为75%的 酒精浸泡灭菌15 30秒，然后以无菌去离子水冲洗2 3次，再将冲洗后的外植体置于质量浓度为0. 19T0. 2%的升汞中，浸泡灭菌51分钟，并用无菌去离子水冲洗3飞次，即得消毒后的外植体；
⑵外植体接种将所述消毒后的外植体切成0. ro. 5cm2的小块，接种在愈伤组织诱导培养基上，其中每25ml所述愈伤组织诱导培养基中接种3小块所述消毒后的外植体；在温度为20V ±2°C、光源为日光灯、光强为30 60 umol . nT2. S—1、光照时间为12 h cf1的条件下培养10 25天，在幼叶切口处膨大形成愈伤组织；
⑶愈伤组织增殖将所述愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上，其中每25ml所述愈伤组织增殖培养基中接种2块所述愈伤组织；在温度为20°C ±2°C、光源为日光灯、光强为30^60 umol . nT2. S—1、光照时间为12 h cf1的条件下愈伤组织增殖20 35天，长出乳白色、颗粒状致密性的愈伤组织；
⑷愈伤组织的芽诱导将所述步骤⑶所得到的愈伤组织接种到诱芽培养基上，其中每25ml所述诱芽培养基中接种2块所述愈伤组织；在温度为20°C ±2°C、光源为日光灯、光强为30 60 umol . nT2. S—1、光照时间为12 h cf1的条件下培养30 35天，形成丛生羌活苗；
(5)生根诱导将所述丛生羌活苗分株后转入生根培养基中，其中每25ml所述生根培养基中接种I棵所述丛生羌活苗；在温度为20°C ±2°C、光源为日光灯、光强为3(T60 umol .m_2. s'光照时间为12 h .cf1的条件下培养2(T30天后，小苗基部出现白色、粗壮短根，并长出完整根系，即得完整再生小苗；
(6)育苗基质消毒将育苗基质在115 121°C温度下进行高温消毒，15 20min后即得消毒后的育苗基质；所述育苗基质是指腐殖质与珍珠岩按2 1重量比混合而成的混合基质；
(7)植株移栽将所述完整再生小苗直接移栽到所述消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常羌活植株；所述一棵完整再生小苗种植在所述消毒后的育苗基质IOcm2的范围内。所述步骤⑴中的羌活的基源植物为伞形科多年生草本植物羌活。所述步骤⑵中的愈伤组织诱导培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液IOml,有机成分母液IOml,铁盐母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液5 20ml，浓度为
0.lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液2 10ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入ImMNaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0^8. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。所述步骤⑶中的愈伤组织增殖培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液IOml,有机成分母液IOml,铁盐母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液l(Tl5ml，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5 10ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入ImMNaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0^8. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。所述步骤⑷中的诱芽培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液l(T20ml，浓度为0. Img/ml的萘乙酸(NAA)母液2 10ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. (T8. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。
所述步骤(5)中的生根培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液50ml，微量元素母液IOml，有机成分母液IOml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的吲哚丁酸(IBA)母液5 15ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0 8.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。所述步骤(6)中的育苗基质的总孔隙度为70% 75%，有机质含量为20%。所述大量元素母液是指含有硝酸铵(NH4NO3) 1650mg/L,硝酸钾(KNO3) 1900mg/L,硫酸镁(MgSO4) 370mg/L，磷酸二氢钾(KH2PO4) 170mg/L,氯化钙(CaCl2_ 2H20)440mg/L 的混合液。所述微量元素母液是指含有硫酸锰(MnSO4 4H20) 22. 3mg/L，硫酸锌(ZnSO4 7H20)8. 6mg/L，硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L，碘化钾(KI) 0. 83mg/L，钥酸钠(NaMoO4 2H20)0. 25mg/L，硫酸铜(CuSO4 5H20) 0. 025mg/L,氯化钴(CoCl2'6H20) 0. 025mg/L 的混合液。所述有机成分母液是指含有甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素0. lmg/L,盐酸吡哆醇0. 5mg/L,烟酸0. 5mg/L,肌醇100mg/L的混合液。所述铁盐母液是指含有硫酸亚铁(FeSO47H20) 27. 8mg/L, Na2 EDTA- 2H20 37. 3 mg/L的混合液。本发明与现有技术相比具有以下优点
I、本发明首次采用幼叶外植体通过生物工程技术一组织培养技术进行组织培养，克服了羌活育苗周期过长(2年)、繁殖系数低的问题；同时开展野生羌活种质资源离体繁殖研究工作，为挽救珍稀濒危羌活种质资源，开展遗传改良、促进羌活的工厂化育苗提供了一条新途径，提供了一种能进行羌活的人工繁殖、种质资源离体保存、利用及选育药用成分含量高的突变系的组织培养离体繁殖方法。2、由于本发明所用培养基中含有植物激素2，4-D和6-BA，2，4_D激素属细胞生长素类，此生长素的生理作用主要是促进细胞伸长生长和细胞分裂，具有诱导受伤的组织表面一至数层细胞恢复分裂能力的特点；6-BA激素属细胞分裂素类，具有诱导芽分化的主导作用，因此诱发时间短、出苗快、增殖频率高，尤其出苗齐，炼苗后可直接成活，易于操作，可进行大规模工厂化生产。3、本发明利用组织培养进行离体快速繁殖有以下几方面重要意义⑴繁殖速度快，不受外界气候因素影响，一年四季在室内均可快速大量繁殖，即启动快；⑵便于保持优良生物学特性，即同步性好；(3)在保存和繁育优良突变体或优良杂种一代方面有非常重要的意义，一株具有明显优势的羌活突变体或一个具明显优势的后代经组织培养后可大面积推广等等。
具体实施方式
实施例I 一种羌活组织培养离体快速繁殖方法，包括以下步骤
⑴外植体的选择和消毒处理以羌活的幼叶为外植体，经流水冲洗10分钟，再用体积浓度为75%的酒精浸泡灭菌15秒，然后以无菌去离子水冲洗2 3次，再将冲洗后的外植体置于质量浓度为0. 1%的升汞中，浸泡灭菌8分钟，并用无菌去离子水冲洗3次，最后用无菌滤纸吸干水分即得消毒后的外植体。⑵外植体接种将消毒后的外植体切成0. 3^0. 5cm2的小块，接种在愈伤组织诱导培养基上，其中每25ml愈伤组织诱导培养基中接种3小块消毒后的外植体；在温度为200C ±2°C、光源为日光灯、光强为30 60 umol . nT2. S—1、光照时间为12 h cf1的条件下培养1(T15天，在幼叶切口处膨大形成愈伤组织。愈伤组织诱导培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微 量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液5ml,浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液2ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。⑶愈伤组织增殖将愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上,其中每25ml愈伤组织增殖培养基中接种2块愈伤组织；在温度为20°C ±2°C、光源为日光灯、光强为3(T60umol . m_2. s'光照时间为12 h . cf1的条件下愈伤组织增殖2(T25天，长出乳白色、颗粒状致密性的愈伤组织。愈伤组织增殖培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液IOml,浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。⑷愈伤组织的芽诱导将步骤⑶所得到的愈伤组织接种到诱芽培养基上，其中每25ml诱芽培养基中接种2块愈伤组织；在温度为20°C ±2°C、光源为日光灯、光强为30飞0umol . m_2. s'光照时间为12 h cf1的条件下培养3(T35天，形成丛生羌活苗。诱芽培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液10ml，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液2ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。(5)生根诱导将丛生羌活苗分株，即在无菌超净工作台内，打开瓶口封口膜，用消过毒的镊子将生长旺盛的苗从丛生苗中分剥下来，然后转入生根培养基中，其中每25ml生根培养基中接种I棵丛生羌活苗；在温度为20°C ±2°C、光源为日光灯、光强为3(T60 umol.m_2. s'光照时间为12 h .cf1的条件下培养2(T30天后，小苗基部出现白色、粗壮短根，并长出完整根系，即得完整再生小苗，该完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已长出了小叶片，可以独立进行自养生长的幼小植株。
生根培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的卩引哚丁酸(IBA)母液5ml,后加双蒸懼水至IOOOml刻度处,搅勻后,加入ImMNaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 5克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。(6)育苗基质消毒将育苗基质在115 121°C温度下进行高温消毒，15^20min后即得消毒后的育苗基质。其中育苗基质是指腐殖质与珍珠岩按2 1重量比混合而成的混合基质，该育苗基质的总孔隙度为709^75%，有机质含量为20%。(7)植株移栽将完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常羌活植株，一般成活率在70%以上；一棵完整再生小苗种植在消毒后的育苗基质IOcm2的范围内。 实施例2 —种羌活组织培养离体快速繁殖方法，包括以下步骤
⑴外植体的选择和消毒处理以羌活的幼叶为外植体，经流水冲洗15分钟，再用体积浓度为75%的酒精浸泡灭菌20秒，然后以无菌去离子水冲洗2次，再将冲洗后的外植体置于质量浓度为0. 2%的升汞中，浸泡灭菌6分钟，并用无菌去离子水冲洗5次，最后用无菌滤纸吸干水分即得消毒后的外植体。⑵外植体接种将消毒后的外植体切成0. 3^0. 5cm2的小块，接种在愈伤组织诱导培养基上，其中每25ml愈伤组织诱导培养基中接种3小块消毒后的外植体；在温度为200C ±2°C、光源为日光灯、光强为30 60 umol . nT2. S—1、光照时间为12 h cf1的条件下培养15 20天，在幼叶切口处膨大形成愈伤组织。愈伤组织诱导培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液IOml,浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 5克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。⑶愈伤组织增殖将愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上,其中每25ml愈伤组织增殖培养基中接种2块愈伤组织；在温度为20°C ±2°C、光源为日光灯、光强为3(T60umol . m_2. s'光照时间为12 h . cf1的条件下愈伤组织增殖3(T35天，长出乳白色、颗粒状致密性的愈伤组织。愈伤组织增殖培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液12ml,浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 5克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。⑷愈伤组织的芽诱导将步骤⑶所得到的愈伤组织接种到诱芽培养基上，其中每25ml诱芽培养基中接种2块愈伤组织；在温度为20°C ±2°C、光源为日光灯、光强为30飞0umol . m_2. s'光照时间为12 h cf1的条件下培养3(T35天，形成丛生羌活苗。诱芽培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液15ml，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 5克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。(5)生根诱导将丛生羌活苗分株，即在无菌超净工作台内，打开瓶口封口膜，用消过毒的镊子将生长旺盛的苗从丛生苗中分剥下来，然后转入生根培养基中，其中每25ml生根培养基中接种I棵丛生羌活苗；在温度为20°C ±2°C、光源为日光灯、光强为3(T60 umol.m_2. s'光照时间为12 h .cf1的条件下培养2(T30天后，小苗基部出现白色、粗壮短根，并长出完整根系，即得完整再生小苗，该完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已长出了小叶片，可以独立进行自养生长的幼小植株。生根培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液 10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的卩引哚丁酸(IBA)母液IOml,后加双蒸懼水至IOOOml刻度处,搅勻后，加入ImMNaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 5克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。(6)育苗基质消毒将育苗基质在115 121°C温度下进行高温消毒，15^20min后即得消毒后的育苗基质。其中育苗基质是指腐殖质与珍珠岩按2 1重量比混合而成的混合基质，该育苗基质的总孔隙度为709^75%，有机质含量为20%。(7)植株移栽将完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常羌活植株，一般成活率在70%以上；一棵完整再生小苗种植在消毒后的育苗基质IOcm2的范围内。实施例3 —种羌活组织培养离体快速繁殖方法，包括以下步骤
⑴外植体的选择和消毒处理以羌活的幼叶为外植体，经流水冲洗15分钟，再用体积浓度为75%的酒精浸泡灭菌30秒，然后以无菌去离子水冲洗3次，再将冲洗后的外植体置于质量浓度为0. 15%的升汞中，浸泡灭菌7分钟，并用无菌去离子水冲洗4次，最后用无菌滤纸吸干水分即得消毒后的外植体。⑵外植体接种将消毒后的外植体切成0. ro. 3cm2的小块，接种在愈伤组织诱导培养基上，其中每25ml愈伤组织诱导培养基中接种3小块消毒后的外植体；在温度为200C ±2°C、光源为日光灯、光强为30 60 umol . nT2. S—1、光照时间为12 h cf1的条件下培养2(T25天，在幼叶切口处膨大形成愈伤组织。愈伤组织诱导培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液15ml,浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉7. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。
⑶愈伤组织增殖将愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上,其中每25ml愈伤组织增殖培养基中接种2块愈伤组织；在温度为20°C ±2°C、光源为日光灯、光强为3(T60umol . m_2. s'光照时间为12 h . cf1的条件下愈伤组织增殖25 35天，长出乳白色、颗粒状致密性的愈伤组织。愈伤组织增殖培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液15ml,浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液8ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉7. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。⑷愈伤组织的芽诱导将步骤⑶所得到的愈伤组织接种到诱芽培养基上，其中每25ml诱芽培养基中接种2块愈伤组织；在温度为20°C ±2°C、光源为日光灯、光强为30飞0umol . m_2. s'光照时间为12 h cf1的条件下培养3(T35天，形成丛生羌活苗。诱芽培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液15ml，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液IOml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉7. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。(5)生根诱导将丛生羌活苗分株，即在无菌超净工作台内，打开瓶口封口膜，用消过毒的镊子将生长旺盛的苗从丛生苗中分剥下来，然后转入生根培养基中，其中每25ml生根培养基中接种I棵丛生羌活苗；在温度为20°C ±2°C、光源为日光灯、光强为3(T60 umol.m_2. s'光照时间为12 h .cf1的条件下培养2(T30天后，小苗基部出现白色、粗壮短根，并长出完整根系，即得完整再生小苗，该完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已长出了小叶片，可以独立进行自养生长的幼小植株。生根培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的卩引哚丁酸(IBA)母液15ml,后加双蒸懼水至IOOOml刻度处,搅勻后，加入ImMNaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 5克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。(6)育苗基质消毒将育苗基质在115 121°C温度下进行高温消毒，15^20min后即得消毒后的育苗基质。其中育苗基质是指腐殖质与珍珠岩按2 1重量比混合而成的混合基质，该育苗基质的总孔隙度为709^75%，有机质含量为20%。(7)植株移栽将完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常羌活植株，一般成活率在70%以上；一棵完整再生小苗种植在消毒后的育苗基质IOcm2的范围内。实施例4 一种羌活组织培养离体快速繁殖方法，包括以下步骤 ⑴外植体的选择和消毒处理以羌活的幼叶为外植体，经流水冲洗13分钟，再用体积浓度为75%的酒精浸泡灭菌30秒，然后以无菌去离子水冲洗3次，再将冲洗后的外植体置于质量浓度为0. 15%的升汞中，浸泡灭菌8分钟，并用无菌去离子水冲洗5次，最后用无菌滤纸吸干水分即得消毒后的外植体。⑵外植体接种将消毒后的外植体切成0. ro. 3cm2的小块，接种在愈伤组织诱导培养基上，其中每25ml愈伤组织诱导培养基中接种3小块消毒后的外植体；在温度为200C ±2°C、光源为日光灯、光强为30 60 umol . nT2. S—1、光照时间为12 h cf1的条件下培养2(T25天，在幼叶切口处膨大形成愈伤组织。愈伤组织诱导培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液20ml,浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉8.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即 得。⑶愈伤组织增殖将愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上,其中每25ml愈伤组织增殖培养基中接种2块愈伤组织；在温度为20°C ±2°C、光源为日光灯、光强为3(T60umol . m_2. s'光照时间为12 h . cf1的条件下愈伤组织增殖25 30天，长出乳白色、颗粒状致密性的愈伤组织。愈伤组织增殖培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液15ml,浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液10ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉8.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。⑷愈伤组织的芽诱导将步骤⑶所得到的愈伤组织接种到诱芽培养基上，其中每25ml诱芽培养基中接种2块愈伤组织；在温度为20°C ±2°C、光源为日光灯、光强为30飞0umol . m_2. s'光照时间为12 h cf1的条件下培养3(T35天，形成丛生羌活苗。诱芽培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液20ml，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液2ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉8. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。(5)生根诱导将丛生羌活苗分株，即在无菌超净工作台内，打开瓶口封口膜，用消过毒的镊子将生长旺盛的苗从丛生苗中分剥下来，然后转入生根培养基中，其中每25ml生根培养基中接种I棵丛生羌活苗；在温度为20°C ±2°C、光源为日光灯、光强为3(T60 umol.m_2. s'光照时间为12 h .cf1的条件下培养2(T30天后，小苗基部出现白色、粗壮短根，并长出完整根系，即得完整再生小苗，该完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已长出了小叶片，可以独立进行自养生长的幼小植株。生根培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的卩引哚丁酸(IBA)母液8ml,后加双蒸懼水至1000ml刻度处,搅勻后,加入ImMNaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。(6)育苗基质消毒将育苗基质在115 121°C温度下进行高温消毒，15^20min后即得消毒后的育苗基质。其中育苗基质是指腐殖质与珍珠岩按2 1重量比混合而成的混合基质，该育苗基质的总孔隙度为709^75%，有机质含量为20%。(7)植株移栽将完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常羌活植株，一般成活率在70%以上；一棵完整再生小苗种植在消毒后的育苗基质IOcm2的范围内。实施例5 —种羌活组织培养离体快速繁殖方法，包括以下步骤
⑴外植体的选择和消毒处理以羌活的幼叶为外植体，经流水冲洗20分钟，再用体积浓度为75%的酒精浸泡灭菌25秒，然后以无菌去离子水冲洗2 3次，再将冲洗后的外植体置于质量浓度为0. 2%的升汞中，浸泡灭菌5分钟，并用无菌去离子水冲洗6次，最后用无菌滤纸吸干水分即得消毒后的外植体。⑵外植体接种将消毒后的外植体切成0. ro. 3cm2的小块，接种在愈伤组织诱导培养基上，其中每25ml愈伤组织诱导培养基中接种3小块消毒后的外植体；在温度为200C ±2°C、光源为日光灯、光强为30 60 umol . nT2. S—1、光照时间为12 h cf1的条件下培养2(T25天，在幼叶切口处膨大形成愈伤组织。愈伤组织诱导培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液15ml,浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉7.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。⑶愈伤组织增殖将愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上,其中每25ml愈伤组织增殖培养基中接种2块愈伤组织；在温度为20°C ±2°C、光源为日光灯、光强为3(T60umol . m_2. s'光照时间为12 h . cf1的条件下愈伤组织增殖25 35天，长出乳白色、颗粒状致密性的愈伤组织。愈伤组织增殖培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)母液IOml,浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉7.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。⑷愈伤组织的芽诱导将步骤⑶所得到的愈伤组织接种到诱芽培养基上，其中每25ml诱芽培养基中接种2块愈伤组织；在温度为20°C ±2°C、光源为日光灯、光强为30飞0umol . m_2. s'光照时间为12 h cf1的条件下培养3(T35天，形成丛生羌活苗。诱芽培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml,微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为0. lmg/ml的6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)母液10ml，浓度为0. lmg/ml的萘乙酸(NAA)母液5ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉7. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。(5)生根诱导将丛生羌活苗分株，即在无菌超净工作台内，打开瓶口封口膜，用消过毒的镊子将生长旺盛的苗从丛生苗中分剥下来，然后转入生根培养基中，其中每25ml生根培养基中接种I棵丛生羌活苗；在温度为20°C ±2°C、光源为日光灯、光强为3(T60 umol.m_2. s'光照时间为12 h .cf1的条件下培养2(T30天后，小苗基部出现白色、粗壮短根，并长出完整根系，即得完整再生小苗，该完整再生小苗是指完成了芽和根的分化，并已长出了小叶片，可以独立进行自养生长的幼小植株。生根培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液50ml,微量元素母液10ml，有机成分母液10ml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为
0. lmg/ml的吲哚丁酸(IBA)母液12ml，后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImMNaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉8. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为一瓶，经121°C高温消毒即得。(6)育苗基质消毒将育苗基质在115 121°C温度下进行高温消毒，15^20min后即得消毒后的育苗基质。其中育苗基质是指腐殖质与珍珠岩按2 1重量比混合而成的混合基质，该育苗基质的总孔隙度为709^75%，有机质含量为20%。(7)植株移栽将完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常羌活植株，一般成活率在70%以上；一棵完整再生小苗种植在消毒后的育苗基质IOcm2的范围内。上述实施例1飞中的羌活的基源植物为伞形科多年生草本植物羌活(.Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang);超净工作台，型号为 BCM-1000A,由苏州安泰空气技术有限公司生产。愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖培养基、诱芽培养基、生根培养基中大量元素母液是指含有硝酸铵(NH4NO3) 1650mg/L，硝酸钾(KNO3) 1900mg/L，硫酸镁(MgSO4) 370mg/L，磷酸二氢钾(KH2PO4) 170mg/L，氯化钙(CaCl2_2H20) 440mg/L的混合液；微量元素母液是指含有硫酸锰(MnSO4 4H20) 22. 3mg/L，硫酸锌(ZnSO4 7H20) 8. 6mg/L,硼酸(H3BO3) 6. 2mg/L,碘化钾(KI) 0. 83mg/L,钥酸钠(NaMoO4 2H20) 0. 25mg/L,硫酸铜(CuSO4 5H20) 0. 025mg/L,氯化钴(CoC12_6H20) 0. 025mg/L的混合液；有机成分母液是指含有甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素
0.lmg/L,盐酸卩比卩多醇0. 5mg/L,烟酸0. 5mg/L,肌醇100mg/L的混合液；铁盐母液是指含有硫酸亚铁(FeSO4 7H20) 27. 8mg/L，Na2 EDTA.2H20 37. 3 mg/L 的混合液。
权利要求
1.一种羌活组织培养离体快速繁殖方法，包括以下步骤 ⑴外植体的选择和消毒处理以羌活的幼叶为外植体，经流水冲洗1(T20分钟，再用体积浓度为75%的酒精浸泡灭菌15 30秒，然后以无菌去离子水冲洗2 3次，再将冲洗后的外植体置于质量浓度为0. 19T0. 2%的升汞中，浸泡灭菌51分钟，并用无菌去离子水冲洗3飞次，即得消毒后的外植体； ⑵外植体接种将所述消毒后的外植体切成0. ro. 5cm2的小块，接种在愈伤组织诱导培养基上，其中每25ml所述愈伤组织诱导培养基中接种3小块所述消毒后的外植体；在温度为20V ±2°C、光源为日光灯、光强为30 60 umol . m—2. s—1、光照时间为12 h cf1的条件下培养10 25天，在幼叶切ロ处膨大形成愈伤组织； ⑶愈伤组织増殖将所述愈伤组织接种到愈伤组织増殖培养基上，其中每25ml所述愈伤组织増殖培养基中接种2块所述愈伤组织；在温度为20°C ±2°C、光源为日光灯、光强为30^60 umol . HT2. S—1、光照时间为12 h cf1的条件下愈伤组织増殖20 35天，长出乳白色、颗粒状致密性的愈伤组织； ⑷愈伤组织的芽诱导将所述步骤⑶所得到的愈伤组织接种到诱芽培养基上，其中每25ml所述诱芽培养基中接种2块所述愈伤组织；在温度为20°C ±2°C、光源为日光灯、光强为30 60 umol . HT2. S—1、光照时间为12 h cf1的条件下培养30 35天，形成丛生羌活苗； (5)生根诱导将所述丛生羌活苗分株后转入生根培养基中，其中每25ml所述生根培养基中接种I棵所述丛生羌活苗；在温度为20°C ±2°C、光源为日光灯、光强为3(T60 umol .m_2. s'光照时间为12 h .cf1的条件下培养2(T30天后，小苗基部出现白色、粗壮短根，并长出完整根系，即得完整再生小苗； (6)育苗基质消毒将育苗基质在115 121°C温度下进行高温消毒，15 20min后即得消毒后的育苗基质；所述育苗基质是指腐殖质与珍珠岩按2 1重量比混合而成的混合基质； (7)植株移栽将所述完整再生小苗直接移栽到所述消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常羌活植株；所述ー棵完整再生小苗种植在所述消毒后的育苗基质IOcm2的范围内。
2.如权利要求I所述的ー种羌活组织培养离体快速繁殖方法，其特征在于所述步骤⑴中的羌活的基源植物为伞形科多年生草本植物羌活。
3.如权利要求I所述的ー种羌活组织培养离体快速繁殖方法，其特征在于所述步骤⑵中的愈伤组织诱导培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液IOml,有机成分母液IOml,铁盐母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4- ニ氯苯氧こ酸母液5 20ml,浓度为0. lmg/ml的萘こ酸母液2 10ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. (T8.0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为ー瓶，经121°C高温消毒即得。
4.如权利要求I所述的ー种羌活组织培养离体快速繁殖方法，其特征在于所述步骤⑶中的愈伤组织增殖培养基是指在1000ml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液IOml,有机成分母液IOml,铁盐母液5ml,朽1檬酸母液4ml, Vc母液2ml,鹿糖30克，浓度为0. lmg/ml的2，4-ニ氯苯氧こ酸母液l(Tl5ml,浓度为0. lmg/ml的萘こ酸母液5 10ml，后加双蒸馏水至1000ml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. (T8. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为ー瓶，经121°C高温消毒即得。
5.如权利要求I所述的ー种羌活组织培养离体快速繁殖方法，其特征在于所述步骤⑷中的诱芽培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液100ml，微量元素母液IOml，有机成分母液IOml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为.0. lmg/ml的6-节氨基腺嘌呤母液l(T20ml,浓度为0. lmg/ml的萘こ酸母液2 IOml,后加双蒸馏水至IOOOml刻度处，搅匀后，加入ImM NaOH溶液调整pH值至5. 8，最后加入琼脂粉.6.(T8. 0克，在I OOml三角瓶中每25ml分装为ー瓶，经121°C高温消毒即得。
6.如权利要求I所述的ー种羌活组织培养离体快速繁殖方法，其特征在于所述步骤(5)中的生根培养基是指在IOOOml的烧杯中，依次加入大量元素母液50ml，微量元素母液.1Oml，有机成分母液IOml，铁盐母液5ml，柠檬酸母液4ml，Vc母液2ml，蔗糖30克，浓度为.0. lmg/ml的卩引哚丁酸母液5 15ml,后加双蒸懼水至IOOOml刻度处,搅勻后,加入ImM NaOH溶液调整PH值至5. 8，最后加入琼脂粉6. (T8. 0克，在IOOml三角瓶中每25ml分装为ー瓶，经121°C高温消毒即得。
7.如权利要求I所述的ー种羌活组织培养离体快速繁殖方法，其特征在于所述步骤(6)中的育苗基质的总孔隙度为709^75%，有机质含量为20%。
全文摘要
本发明涉及一种羌活组织培养离体快速繁殖方法，该方法包括以下步骤⑴外植体的选择和消毒处理以羌活的幼叶为外植体，经浸泡灭菌、冲洗，即得消毒后的外植体；⑵外植体接种将消毒后的外植体切块，接种在形成愈伤组织；⑶愈伤组织增殖将愈伤组织接种进行增殖，形成致密的愈伤组织；⑷愈伤组织的芽诱导将致密的愈伤组织接种形成丛生羌活苗；⑸生根诱导将丛生羌活苗分株后接种培养，得完整再生小苗；⑹育苗基质消毒；⑺植株移栽将完整再生小苗直接移栽到消毒后的育苗基质中，炼苗后即长成正常羌活植株。本发明克服羌活育苗周期过长、繁殖系数低的问题，易于操作、可进行工厂化快速育苗。
文档编号A01H4/00GK102657087SQ20121014378
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月10日 优先权日2012年5月10日
发明者刘卫根, 周国英, 徐文华, 李春丽, 杨路存, 贺丽华 申请人:中国科学院西北高原生物研究所