专利名称：一种贴壁培养的细胞的冷冻保存方法
技术领域：
本发明涉及一种生物冷冻保存技术，具体是一种贴壁培养的细胞的冷冻保存方法。
背景技术：
随着生物技术的快速发展，细胞培养技术已经广泛应用于生物学、医学、新药研发等各个领域，成为科研或生产中不可或缺的技术手段。实验室一般安排专人进行细胞培养工作，以期提供生长形态良好、遗传稳定的细胞用于后续试验研究。然而 细胞长期体外培养会造成细胞的生长与形态等发生退变或转化，细胞失去原有的遗传特性；有时还会由于细胞污染而造成传代中断，种质细胞丢失。因此，在实际工作中通常利用冷冻方法保存细胞。细胞在培养过程中，按照生长方式分为贴壁生长和悬浮生长两种，其中大部分细胞是贴壁生长的。贴壁培养的细胞的传统冷冻方法一般是先将贴壁的细胞消化下来，然后收集细胞消化液并离心，之后去除上清加入冷冻液，放入冻存管中逐步降温，最后放入液氮中长期保存(程金华等，2006)。这种方法用于种质细胞资源的长期保存非常成功，保存时间可长达十几、甚至二十几年，细胞解冻后依然有活力(Huang et al.，2010)。但是传统冷冻保存要求细胞必须生长良好且存活率高(即为对数生长期)，这时有80-90%细胞贴壁，数量在IO6以上。然而在实际工作中有时会遇到临时断电、培养箱出现问题或试验计划有变动等突发情况，这时细胞贴壁还未满80-90%，达不到传统冷冻保存所需的细胞数量；然而细胞又比较珍贵，丢弃非常可惜甚至永远丧失这一种质资源。
发明内容
为了克服传统冷冻方法存在的技术缺陷，尽最大可能保存种质细胞资源，本发明提供了一种贴壁培养的细胞的冷冻保存方法。该方法直接在细胞培养瓶内加入冷冻液，然后将培养瓶逐步降温，最后放入超低温冰箱(-80°C)中保存，待培养条件许可时解冻细胞，继续培养。本发明的技术方案是一种贴壁培养的细胞的冷冻保存方法，其特征是，( I) 2 X 冷冻液将14-20 份二甲基亚砜(DMS0)、2_6 份 Supercool X-1000,20-40 份胎牛血清(FBS)溶解在35-45份DMEM/F12液中，之后分装到灭菌的I. 5毫升离心管中，每管O. 5-1. O毫升，放置4°C保存；上述份数均为体积份数；注本发明所用试剂除Supercool X-1000购自21st Century Medicine公司外，其余试剂均可购自Sigma、Gibco或Roche公司等。(2)冷冻前2X冷冻液、新鲜的细胞培养液添加量表I冷冻前2X冷冻液、新鲜的细胞培养液添加量与培养瓶型号对应表
权利要求
1.一种贴壁培养的细胞的冷冻保存方法，其特征是，将培养瓶内细胞培养液吸净，根据培养瓶型号，重新加入新鲜的细胞培养液，然后加入2X冷冻液，轻轻晃动培养瓶，让细胞培养液与2X冷冻液混匀，渗透进入贴壁细胞质内，之后将培养瓶依次平放在冰箱4°C层30-60分钟，-20°C层30-40分钟，最后放在_80°C的超低温冰箱中保存； 所述2X冷冻液为将14-20份二甲基亚砜、2-6份Supercool X-1000、20_40份胎牛血清溶解在35-45份DMEM/F12液中，之后分装到灭菌的I. 5毫升离心管中，每管0. 5-1. 0毫升，放置4°C保存；上述份数均为体积份数； 所述冷冻前T25型培养瓶的2X冷冻液、新鲜细胞培养液添加量均为0. 5ml ；T75型培养瓶的2X冷冻液、新鲜细胞培养液添加量均为I. 5ml。
2.采用权利要求I所述冷冻保存方法保存的细胞的解冻方法，其特征是，解冻时，直接将培养瓶从超低温冰箱中取出，在空气中停留3-4秒，然后快速放入37-40°C水浴锅中，轻轻晃动至冷冻液溶解，在超净台内加入细胞培养液，轻轻晃动培养瓶，让细胞培养液充分稀释冷冻液内二甲基亚砜，之后放入培养箱内培养。
3.如权利要求2所述的解冻方法，其特征是，所述解冻后T25型培养瓶的细胞培养液添加量为10ml，T75型培养瓶的细胞培养液添加量为30ml。
全文摘要
本发明公开了一种贴壁培养的细胞的冷冻保存方法。该方法直接在细胞培养瓶内加入冷冻液，然后将培养瓶逐步降温，最后放入超低温冰箱中保存，可保存2-3个月，待培养条件许可时解冻细胞，继续培养。本发明冷冻与解冻步骤简单、快速，省却传统冷冻方法中的细胞消化、离心等步骤，大大降低了细胞污染以及对细胞活性的损伤；冷冻时不受细胞贴壁程度的影响(20-30%即可)，打破了传统冷冻对细胞数量的限制，非常适用于应对实验室中突发情况可能对细胞培养造成的毁灭性损失；不需要购买细胞冻存管，直接利用原培养瓶冷冻，解冻后细胞也不需接种到新的培养瓶，而是在原培养瓶内加入培养液继续培养，大大节省了试验费用。
文档编号A01N1/02GK102696575SQ20121015263
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月17日 优先权日2012年5月17日
发明者万发春, 刘晓牧, 刘桂芬, 宋恩亮, 成海建, 谭秀文, 赵红波 申请人:山东省农业科学院畜牧兽医研究所