专利名称：与猪生长速度相关的遗传标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及一种与猪生长速度相关的遗传标记及其应用。
背景技术：
养猪业是我国畜牧业生产的主体，其产值长期以来始终都是畜牧业总产值的第一位。随着人们生活水平的提高，对肉食品的数量和质量需求不断提高，如何培育出生长速度 快并且肉质风味好的猪种成为当前猪育种工作的热点。我国猪种资源丰富，为猪育种提供良好的素材，也为研究重要的与经济相关性状的基因和分子标记提供良好的材料。藏猪是我国特有的高原型猪种，体小皮薄、肉嫩味美，风味浓郁，肉质细腻、风味独特，素有“高原之珍”的美誉(刘轩，强巴央宗，王强等.藏猪繁殖性状多基因效应分析.遗传，2010，32 (5) :480-485)。藏猪产于我国青藏高原海拔250(T4300m区域，对高原低氧、低温和粗放的饲养环境有较强的适应性，是发展我国高海拔地区养猪业的重要品种资源。滇南小耳猪是云南省西双版纳州小型地方品种，具有适应热带雨林地区高温潮湿的生态环境，早熟易肥、屠宰率高、抗逆性强、皮薄骨细、肉质鲜嫩、营养丰富等优点。藏猪和滇南小耳猪均是小型地方品种，是研究猪生长和肉质性状基因的良好材料。随着分子数量遗传学、分子生物学技术的飞速发展，有关分子遗传标记和标记辅助选择的研究被广泛开展，并在畜禽育种中应用，产生了巨大的影响。生长性状是猪育种中选择的主要目标之一，不同品种或类型的猪生长速度有明显的差别。从分子水平上鉴定影响生长速度的基因或标记是目前猪功能基因研究的热点之一(姜运良，李宁，杜立新，吴常信.猪肌肉生长抑制素基因5’调控区T —A突变与生长性状的关系分析.遗传学报.2002，29(5):413 416)。研究者曾通过对基因的多态性与生长性状的关联分析，认为生长激素基因(PaszekAA, Wilkie P J, Wilkie P J, Flickinger G H, et al. Intervalmappingof growth in divergent swine cross. Mamm Genome. 1999,10(02) :117 122 ;Bidanel J P， Milan D， Iannuccelli N， et al.Detection ofquantitative traitloci for growth and fatness in pigs. Genet SeIEvoI. 2001,5-6,33 (03) :289 309 ;LEE S J，McPherron A C. Myostatinand the control of skeletal muscle mass. CurrOpin Genet Dev. 1999，9 (05) :604-607)、类胰岛素生长因子 I 基因、PITl 基因(Yu T P，SchmitzC B，Rothschild M F，Tuggle C K. Association of PITl poIymorphismswithgrowth and carcass traits in pigs. J Anim Sci. 1995，73(05):1282 1288)、MC4R基因(Kim K S，Larsen N，Short T，et al. Amissense variant of the porcinemelanocortin-4receptor(MC4R)gene isassociated with fatnsee growth,and feedintake traits. Mamm Genome. 2000，11:131 135)和痩素受体(Kennes Y M，Murphy B D，PothierFiPalin M F. Characterization of swine leptin(LEP)polymorphisms andtheirassociation with production traits. Anim Genet. 2001，32 (04) : 215-218)等与猪的生长速度有关。但目前，在猪分子育种实践中仍然缺少功能明确、效应显著的主效基因和分子标记。生长激素促分泌素受:体(growthhormone secretagogue receptor, GHSR)属于α 螺旋 7 次跨膜的 G 蛋白偶联受体(Herrington J, Hille B. Growth hormone-releasinghexapeptide elevates intracellular calciumresponse in rat somalotrophes bytwo mechanisms. Endocrinology. 1994,135 :1100-1108.)与生长激素分泌素(Ghrelin)结合，调节生长激素分泌，进而调节生长速度(Howard A D, Feighner S D, Cully D F, etal. A receptor in pituitary and hypothalamus that functions in growth hormonerelease. Science, 1996, 273(5277) :974-977)。基于该基因在生长发育过程中起到的重要作用，因此将其作为猪生长相 关的候选基因，采用PCR测序技术筛选不同类型猪群体间差异的SNP位点，从而建立起快速检测方法，为寻找影响猪生长性状的SNP位点及相关分子遗传标记的开发提供了新思路。
发明内容
本发明的目的是提供一种与猪生长速度相关的遗传标记及其应用。本发明的另一目的是提供用于检测所述与猪生长速度相关的遗传标记的引物及含有该引物的试剂盒。为了实现本发明目的，本发明的一种与猪生长速度相关的遗传标记，其位于猪GHSRla基因5’侧翼区上，它的核苷酸序列如SEQ IDN0. I所示，其中，151bp处的碱基C与猪快速生长性状相关，如果该碱基C突变为A，则与猪慢速生长性状相关。本发明还提供用于检测上述与猪生长速度相关的遗传标记的引物，包括正向引物F5’ -AAACGCACTAATAAATGCTTCA-3’ 和反向引物 R5’ -CTTCCTGCCCTCACCTTTT-3’。本发明还提供上述与猪生长速度相关的遗传标记在鉴定猪种中的应用，其包括步骤1)提取待测猪的基因组DNA ；2)以待测猪的基因组DNA为模版，利用所述引物F和R，通过PCR反应扩增出猪GHSRl a基因5’侧翼区177bp片段；3)检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中151bp处的碱基为C，则待测猪属于生长速度快的猪品种，如果扩增产物序列中151bp处的碱基为A，则待测猪属于生长速度慢的猪品种。前述应用中，步骤2)中PCR反应使用的扩增体系以25 μ I计为IOOng/μ I模板DNAl μ l，5pmol/y I 弓丨物 F和 R各 I μ 1，IOmmoI/L dNTPmix2. O μ l,5U/y L Taq DNA聚合酶
0.5 μ 1，10XPCR反应缓冲液2.5 μ 1，余量为水。前述应用中，步骤2)中PCR反应使用的条件为95°C 5分钟；95°C 30秒，58°C 30秒，720C 20秒，36个循环；72°C 7分钟。前述应用中，步骤3)中检测PCR扩增产物采用RFLP法，具体为用内切酶AccII对PCR扩增产物进行酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果检测结果仅为一条带，则待测猪属于生长速度慢的猪品种，检测结果出现两条带，则待测猪属于生长速度快的猪品种。本发明还提供含有所述引物F和R的用于检测猪生长速度的试剂盒。所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。优选所述试剂盒还包括标准阳性模板。
本发明进一步提供所述与猪生长速度相关的遗传标记在猪分子标记辅助育种中的应用。本发明提供了一种与猪生长速度相关的遗传标记及其应用，既采用聚合酶链式反应(PCR)和测序技术筛选到与猪生长速度相关的遗传标记，并通过限制片段多态性(RFLP)方法来检测待测猪的基因型，根据基因型进行猪的选育，从而加快猪的育种进程。本发明优点在于(一)本发明提供的分子遗传标记不受猪的年龄、性别等限制，可用于猪的早期选育，甚至在猪刚出生时就可准确地进行选留，可大大缩短世代间隔，加快猪的育种进程；(二)检测方法快速、准确。
图I为本发明较佳实施例大约克猪与藏猪、滇南小耳猪GHSRl α基因5’侧翼区序列比对结果。 图2为本发明猪GHSRl α基因5’侧翼区扩增结果；其中，琼脂糖胶浓度为1% ;图中泳道M为DM2000plus Marker ;泳道1_4为藏猪，泳道5_7为滇南小耳猪，泳道8_10为大
约克猪。图3为本发明猪GHSRl α基因AccII-RFLP检测结果；其中，琼脂糖胶浓度为3% ；图中泳道M为DM2000plus Marker ;泳道6为AA基因型，泳道2、5和7为AC基因型，泳道
1、3、8、9、10、11、12 和 13 为 CC 基因型。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例I猪GHSRl α基因5’侧翼序列片段的获得及SNP位点筛选选择中国地方品种“藏猪”(采自西藏农牧学院教学实习牧场)、“滇南小耳猪”(采自云南省西双版纳州滇南小耳猪资源保护场)和引进品种“大约克猪”(采自云南省昆明市云南农业大学实习猪场)为试验材料。藏猪和滇南小耳猪生长速度较慢，大约克猪生长速度较快。根据Genbank中猪的GHSRla基因序列(登录号NC_010455)，利用PrimerPremier 5. O软件设计以下引物正向引物F : 5’ -AGCCGCTTAATACCAGTCTG-3’反向引物R : 5’ -TAGAACCTATCATCCGTCGTG-3’用上述弓丨物对藏猪、滇南小耳猪、大约克猪基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系为 25yL，其中 10\ 0 反应缓冲液2.5 4 1^，10臟01/1(1见13 mix 2. O μ L，5pmol/μ L 的正反向引物各 I μ L, Taq DNA 聚合酶(5U/μ L) O. 5 μ L, DNA 模板 I μ L(DNA 约 IOOng)，加 dd H2O至25 μ L。PCR反应条件为第I步95° C变性5min ;第2步95° C变性30s ;第3步58° C复性30s ;第4步72° C延伸30s ;重复第2至第4步36个循环，之后再72° C延伸7min，最后降温至4° C保存。对上述3个猪种的PCR产物经Gel Extraction Kit试剂盒(购自上海生物工程技术有限公司，按照试剂盒说明书操作)纯化。每个猪种分别选10个个体进行PCR扩增，每个体的PCR产物各取8 μ L，混池成一个样本进行测序(北京诺赛生物科技公司)。上述PCR扩增片段长度为869bp，如SEQ ID NO. 6所示。三个猪种的测序结果经DNAMAN软件进行比对，其中位于该PCR扩增片段的第48bp处(位于5’侧翼区-1595bp处)的C碱基突变为A碱基(图I)，该突变位点可被Acc II内切酶(识别序列为CGCG)识别。
实施例2猪GHSRl α基因5’侧翼区多态性PCR-RFLP检测方法建立为了快速方便的检测猪GHSRl α基因5’侧翼区_1595bp处多态性，针对实施例I中发现的SNP位点设计新的扩增引物，引物序列为正向引物F : 5’ -AAACGCACTAATAAATGCTTCA-3’反向引物 R : 5’ -CTTCCTGCCCTCACCTTTT-3’用该对弓丨物对藏猪、滇南小耳猪、大约克猪等基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应体系为 25μ L，其中 10XPCR Buffer 2. 5 μ L, 10mmol/L dNTP mix2. O μ L，5pmol/μ L 的引物各
Iμ L, Taq DNA 聚合酶(5U/ μ L) O. 5 μ L，DNA 模板 I μ L (DNA 约 IOOng)，加 dd H2O M 25 μ L0PCR反应条件为第I步95° C变性5min;第2步95° C变性30s ;第3步58° C复性30s ;第4步72° C延伸20s ;重复第2至第4步36个循环，之后再72° C延伸7min，最后降温至4° C保存。PCR扩增产物用浓度为I. 5%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统中观察PCR扩增效果，可见到片段大小为177bp的清晰条带(图2)。该PCR产物用AccII内切酶酶切，反应体系为10X反应缓冲液I μ L，AccII内切酶O. 25 μ L(浓度为IOU/μ L)，PCR产物4 μ LjPdd H2O至10 μ L。37° C环境中酶切4_8h。然后，将得到的酶切产物在3%琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像系统中观察(图3)，判断基因型。当扩增片段的151bp处碱基均为C时，AccII内切酶可识别该位点，即可将PCR扩增片段切成两个片段，一个为150bp，另一个片段为27bp，该基因型记为CC型；当151bp处的碱基都为A时，Acc II内切酶不可识别，即PCR扩增片段不能被切开，凝胶中只有一条带，长度为177bp，该基因型记为AA型；当151bp处既含有C碱基又含有A碱基时，即凝胶电泳中含有三条带，长度分别为177bp，150bp和27bp，该基因型记为杂合型AC型。实施例3本发明筛选的遗传标记在不同猪群中的多态性检测采用实施例2中建立的PCR-RFLP技术，测定藏猪、滇南小耳猪、大约克猪群体GHSRl α基因5’侧翼区_1595bp的PCR-Acc II -RFLP多态性分布，检测结果如表I所示。表I猪GHSRl α基因5 ^侦彳翼区_1595bp位点多态性分布
品- 样品教基
ΛΛ AC’ CCAC
藏猪45 0.62 0.29 0.09 0,77 0.23
> Η Ι^'ε 40 0.25 0—55 CUO (152 O—4S 龛夏着 45OOIO 藏猪和滇南小耳猪同属生长速度慢的猪品种，等位基因C频率分别为23%和48%，而生长速度快的品种大约克猪等位基因C频率为100%。表I结果表明该基因位点的基因型和等位基因分布在不同生长性能的猪群间差异明显，可能与生长性能相关。实施例4淮猪新品系GHSRla基因型与生长速度的关联分析
采集122头淮猪新品系(采自安徽科鑫养猪育种有限公司，为该新品系的4世代群体)耳组织样品，个体间无亲缘关系，所有个体测定和计算达30kg体重的日龄和达90kg体重的日龄2个生长性状指标(表2)。表2淮猪新品系4世代生长性能
权利要求
1.一种与猪生长速度相关的遗传标记，其特征在于，其位于猪GHSRl a基因5'侧翼区上，它的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，其中，151bp处的碱基C与猪快速生长性状相关，如果该碱基C突变为A，则与猪慢速生长性状相关。
2.用于检测权利要求I所述与猪生长速度相关的遗传标记的引物，其特征在于，包括正向引物F5 ' -AAACGCACTAATAAATGCTTCA-3 '和反向引物R5' -CTTCCTGCCCTCACCTTTT-3'。
3.权利要求I所述与猪生长速度相关的遗传标记在鉴定猪种中的应用，其包括步骤 1)提取待测猪的基因组DNA； 2)以待测猪的基因组DNA为模版，利用权利要求2所述引物F和R，通过PCR反应扩增出猪GHSRl a基因5'侧翼区177bp片段； 3)检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中151bp处的碱基为C，则待测猪属于生长速度快的猪品种，如果扩增产物序列中151bp处的碱基为A，则待测猪属于生长速度慢的猪品种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR反应使用的扩增体系以 25 ii I 计为IOOng/ii I 模板 DNA I y 1，5pmol/y I 引物 F 和 R 各 I y 1，10mmol/L dNTPmix2. Ou l,5U/u L Taq DNA 聚合酶 0. 5 yl，10XPCR 反应缓冲液 2. 5 yl，余量为水。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR反应使用的条件为95°C5分钟；95°C 30 秒，58 0C 30 秒，72 °C 20 秒，36 个循环；72°C 7 分钟。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤3)中检测PCR扩增产物采用RFLP法，具体为用内切酶Acc II对PCR扩增产物进行酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果检测结果仅为一条带，则待测猪属于生长速度慢的猪品种，检测结果出现两条带，则待测猪属于生长速度快的猪品种。
7.含有权利要求2所述引物的用于检测猪生长速度的试剂盒。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
10.权利要求I所述与猪生长速度相关的遗传标记在猪分子标记辅助育种中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种与猪生长速度相关的遗传标记及其应用，其位于猪GHSR1α基因5′侧翼区上，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中，151bp处的碱基C与猪快速生长性状相关，如果该碱基C突变为A，则与猪慢速生长性状相关。本发明采用聚合酶链式反应(PCR)和测序技术筛选到与猪生长速度相关的遗传标记，并通过限制片段多态性(RFLP)方法来检测待测猪的基因型，根据基因型进行猪的选育，从而加快猪的育种进程。
文档编号A01K67/027GK102649958SQ20121015726
公开日2012年8月29日 申请日期2012年5月18日 优先权日2012年5月18日
发明者史利华, 吴克亮, 张 浩, 李庆岗, 陶著 申请人:中国农业大学