专利名称：卵巢大皮质片玻璃化冷冻保护液及冷冻方法
技术领域：
本发明涉及细胞、组织和器官的超低温保存的技术领域，具体涉及ー种卵巢大皮质片玻璃化冷冻保护液及冷冻方法。
背景技术：
玻璃化冷冻是1985年由Rall和Fahy首先提出来的超快速超低温保存的新技术，不仅操作方法简便，而且冻存效果好，可较好保存有生命的细胞、组织和器官的生物活性，具有经济、简便和高效的优点，是近年低温生物学领域发展最快的研究方向之一。将癌症患者卵巣在癌症放化疗前进行冻存，癌症控制后，将冻存卵巣移植回体内，在一定程度上恢复患者卵巣的内分泌功能和生育能力。近年许多学者相继报道了小鼠、大鼠、羊、猴及人的卵巢组织玻璃化冷冻成功(參见文献Kagabu S Umezu M.Transplantation of しryopreserved mouse, Chinese hamster, rabbit, Japanesemonkey and rat ovaries into rat recipients [J]. Exp Anim，2000，49 (I):17-21.Alaghbari AM，Jr Menino AR. Survival of oocytes recovered from vitrifiedsheep ovarian tissues[J]. Annimal Reprod Science, 2002，71(1-2) :101-110.Lee KA，Lee SH，Yoon SJ，et al. Resumption of the human primordial folliclegrowth in xenografts after vitrification of the ovarian tissue [J].FertilSteril,2000, 74(3) :S214.)。虽然玻璃化冷冻法已广泛应用于实验动物中，但目前还没有ー个通用的冷冻方法和标准的冷冻液配置方案，导致玻璃化冻存的体积移植徘徊在小体积阶段。但由于卵巢小皮质片(ImmX2mmX2mm)所含卵泡有限，移植回体内后由于卵泡的消耗使生理性生殖内分泌状态维持时间较短(2 3年)，同时，切割时会因卵泡破坏过多造成卵泡数量的減少。大皮质片(80mm3以上)移植因含原始卵泡数量巨大，将明显延长移植物的功能寿命，目前，最大的皮质块面积为15mmX5mm,厚度均为l_2mm大小，且均采用低浓度保护剂的慢速冻存法(參见文献J Donnez,丽Dolmans, D Demylle, PJadoul, C Pirard, J Squifflet, B Martinez—Maarid, and A vanLangenaonckt. Livebirthafter orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue..2004,.Lancet, Oct 2004;364(9443) :1405-10 ；Dror Meirow,Jacob Levron, Talia Eldar-Geva etal. Pregnancy after Transplantation of Cryopreserved Ovarian Tissue in a Patientwith Ovarian Failure after Chemotherapy. N Engl J Med2005; 353; 318-321.),慢速冷冻法是采用冷冻降温仪按设置的程序进行冷冻，冷冻过程时间长，消耗液氮多，而且需要专门的仪器，一般实验室不易实施。卵巢大皮质片的玻璃化冷冻是近期研究者关注的焦点和难点，具体操作方法面临如下挑战组织块太大将使皮质片在玻璃化液中的渗透时间延长，虽然可提供足够的时间使得保护剂进入中央区域，但边缘区域就将暴露于高浓度保护剂中的时间过长，会产生细胞毒性损伤。若滲透时间较短，则造成皮质片中心的冷冻保护剂不能达到有效浓度。因此如何在最大限度地降低细胞毒性的条件下，保证中央区域保护剂的渗入是确保卵巣大皮质片玻璃化冷冻成功的关键。目前尚无适用于卵巢大皮质片玻璃化冷冻保护液及其冷冻方法。
发明内容
本发明的目的在于提供ー种适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻保护液，本发明的另ー目的是提供ー种适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻方法。本发明所要解决的技术问题主要是大皮质片的冻存由于保护液的渗入和透出时间长，经受的低温保护剂的毒性时间也长，可能面临更大的毒性损伤。同时，大皮质片无血管吻合移植将由于血流不能及时到达而面临缺血缺氧损伤，会损失卵母细胞和女性激素产生的基础——原始卵泡。因此，要解决以上技术问题，首先必须要有一种既能抵抗冻存过程中产生的凋亡又可促进冷冻后移植卵巣快速回复血流的玻璃化冷冻保护液。 本发明提供了ー种适用于卵巢大皮质片的玻璃化冻存保护液，该玻璃化冻存保护液是将促性腺激素作为抗凋亡剂加入到冻存使用液体中，所用的玻璃化冷冻保护液为EG5. 5/30液，此保护液由5. 5mol/Lこニ醇(EG)+30%聚鹿糖+0. 5mol/L鹿糖组成,在此基础上添加了促性腺激素(gonadotropins)。所述的促性腺激素，可以是人绝经期促性腺激素(HMG)、黄体生成素(LH)或促卵泡刺激激素(FSH)。优选促卵泡刺激激素(FSH)。成年小鼠卵巢器官大皮质片的玻璃化冷冻保护液玻璃化液EG5. 5/30 (5. 5mol/LEG+30%聚蔗糖+0. 5mol/L蔗糖玻璃化液)中添加0. 2IU/mL 0. 6IU/mL FSH、LH或人绝经期促性腺激素(HMG)，最佳地浓度为0. 3IU/mLFSH。绵羊卵巢大皮质片的玻璃化冷冻保护液玻璃化液EG5. 5/30(5. 5mol/LEG+30%聚蔗糖+0. 5mol/L蔗糖玻璃化液)中添加5 u g/mL 20 y g/mL的促卵泡成熟激素(FSH)，最佳地为10 u g/mL的FSH。本发明提供的适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻保护液，不仅可以抵抗卵巢组织在冻存中产生的凋亡，而且促进移植后血流的在灌注时间提前12-24h。利用该玻璃化冷冻保护液对成年小鼠卵巣器官、绵羊大皮质片的玻璃化冻存，冻存效果好，可较好保存有生命的细胞、组织和器官的生物活性，并且冻存卵巢大皮质片移植回体内，内分泌功能、生育功能等活性未受到影响。使用本发明的玻璃化冷冻保护液，冻存卵巢大皮质片，卵巢大皮质片的体积为80mm3 以上，一般在 80mm3-200mm3 之间，厚度< 2mm。本发明还提供了ー种适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻方法，该玻璃化冷冻方法主要涉及卵巣大皮质片体积玻璃化冻存渗透平衡最佳时间控制技木。进ー步地，本发明摸索出根据卵巢大皮质片的冷冻组织面积大小来确定其在玻璃化冷冻保护液中滲透平衡时间的规律，方便大皮质片卵巢组织的玻璃化冷冻时间的掌握并保证了冻存效果。本发明人将2 6月龄的绵羊卵巢皮质样本按体积分为小样(40mm3=5mmX 4mmX 2mm)、中样(80mm3=IOmm X 4mm X 2mm)、大样(160mm3=10mmX 8mmX 2mm)，采用两步渗透平衡法进行玻璃化冻存，全过程在室温(22 24°C)下进行。I.预渗透平衡I. 5mol/Lこニ醇(EG)+20%小牛血清(ICS)，小样15min、中样20min、大样25min ；2.玻璃化渗透平衡EG 5. 5/30液(5. 5mol/L EG+30%聚蔗糖+0. 5mol/L蔗糖玻璃化液),小样4min 8min、中样IOmin 13min、大样17min 20min ；3.直接投入液氮。解冻后，对玻璃化冻存结果的判断对解冻后的卵巢进行普通光学显微镜、及凋亡相关的免疫组织化学检测三种不同体积的卵巣皮质块在玻璃化冷冻液中经适宜的滲透平衡后，进行玻璃化冻存。凡玻璃化液渗透欠佳的，玻璃化冻存解冻后组织学表现卵泡细胞的脱落、排列紊乱；卵母细胞胞浆出现裂痕、卵母细胞变形等。这是卵泡细胞及卵母细胞内渗透的EG未达到玻璃化浓度，使冷冻和解冻时细胞内外有冰晶形成，造成细胞的机械性损伤而使大量的卵泡结构破坏。渗透时间过长，则表现为原始卵泡出现大量的固缩深染的细胞核，说明脱水过度，皱缩死亡。小体积组最佳的滲透平衡7min组，中体积为Ilmin组，大体积为19min组。对凋亡结果的判断与对正常卵泡的观察结果相同，最佳的滲透平衡时间冻存卵巢组织中凋亡的卵泡最少，与新鮮卵巢组间无统计学差异。从实验结果中本发明总结出在22 24°C范围和厚度彡2mm的恒定条件下，玻璃化液中的适宜的渗透平衡时间T (min)与最大面积S (mm2)存在这样的关系T=l/5 S+3。本发明还提供了ー种适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻方法，该方法具体为玻璃化渗透平衡时所用的玻璃化冷冻保护液为常用玻璃化液EG5. 5/30(5. 5mol/L EG+30%聚蔗糖+0. 5mol/L蔗糖玻璃化液)的基础上添加了促性腺激素； 渗透平衡时间T (min)与卵巢大皮质片面积S (mm2)的关系为T=l/5 S+3 ;渗透平衡温度为22 24°C ；所述的卵巢大皮质片体积为80mm3以上，厚度彡2mm。使用上述添加促性腺激素的EG5. 5/30玻璃化冷冻保护液的基础上，摸索出根据卵巢大皮质片的冷冻组织面积大小来确定其在玻璃化冷冻保护液中滲透平衡时间的规律，结合渗透平衡公式，可方便、有效地玻璃化冻存不同体积的小动物卵巣器官及大卵巢皮质组织。本发明的玻璃化冷冻保护液和玻璃化冷冻方法特别适用于卵巢大皮质片，提供了用玻璃化冻存卵巣的最适宜的滲透平衡时间，方便实验动物、良种大家畜、突然死亡的野生濒危物种卵巢的冻存；通过使用添加促性腺激素的EG5. 5/30玻璃化液，可提高卵泡存活，缩短移植物的血流再灌注的时间，提高冻存大皮质片的存活率。
图I :对解冻后的卵巢大皮质片普通光学显微镜图A :绵羊卵巢40mm3皮质片(小样)在不同玻璃化冻存渗透平衡时间下冻存解冻后的形态学表现，7min-8min组最佳；B :绵羊卵巢80mm3皮质片(中样)在不同玻璃化冻存渗透平衡时间下冻存解冻后的形态学表现，llmin-12min组最佳；C :绵羊卵巢160mm3皮质片(大样)在不同玻璃化冻存渗透平衡时间下冻存解冻后的形态学表现，18min-19min组最佳。图2 :玻璃化冻存后各组卵泡的组织学图像(X400)
其中A :新鲜对照组(fresh control group, FCG) ;B :非干预玻璃化冻存组(vitrification control group, VCG) ;C :FSH 干预下玻璃化组(FSH treatmentvitrification group, FSH-VG)；图中“一”表示原始卵泡，“ ★”表示初级卵泡，“ ▲”表示次级卵泡，Bar为50 y m。图3 :0. 3IU/FSH干预下玻璃化冻存解冻后，卵巢活化的caspase-3免疫组化结果其中A:新鲜对照组，B:非干预玻璃化组，CiFSH干预下的玻璃化组，显示活化的caspase-3表达低于非干预组；Bar为50 ii m。图4 :0. 3IU/FSH干预下玻璃化冻存解冻后，卵巢缝隙连接蛋白CX43免疫组化结果 (Cx43蛋白主要表达于卵泡颗粒细胞膜上)其中A:新鲜对照组，B:非干预玻璃化组，CiFSH干预下的玻璃化组，显示CX43表达优于非干预组；Bar为50 ii m。图中“一”表示原始卵泡，“ ★”表示初级卵泡，“ ▲”表示次级卵泡。图5 :FSH干预下玻璃化冻存解冻后卵巢Cx43蛋白western免疫印迹結果。FCG为新鲜对照组，VG为无干预玻璃化组，FSH-VG为FSH干预下的玻璃化组。
具体实施例方式下面结合具体实施例和附图，进ー步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明，而不用干限制本发明的应用范围。实施例I :卵巢大皮质片玻璃化冷冻方法(一)玻璃化冷冻将2 6月龄的绵羊卵巢大皮质片样本固定为2mm厚,按体积分为小样(40mm3=5mmX4mmX2mm)、中样(8Omm3=IOmmX4mm X 2mm)、大样(160mm3=IOmmX 8mm X 2mm)，采用两步渗透平衡法进行玻璃化冻存，全过程在室温(22 24°C)下进行第一步是预渗透平衡1.5mol/Lこニ醇(EG)+20%小牛血清(ICS)，小样15min、中样20min、大样25min ；第二步是玻璃化渗透平衡EG 5. 5/30液(EG 5. 5/30液具体配方是EG+30%聚蔗糖 +0. 5mol/L 鹿糖),小样5min 8min、中样IOmin 13min、大样17min 20min(姆样皮质片的玻璃化滲透平衡时间以一分钟为ー个小组，即小样皮质片渗透时间分组为5min、6min、7min、8min组；中样皮质片的渗透时间分组为lOmin、llmin、12min、13min ;大样皮质片的渗透时间分组为17min、18min、19min、20min。)；然后直接投入液氮。(ニ)解冻卵巣组织大皮质片出液氮后，在37°C水浴中解冻，具体解冻步骤依次为A至B至C至D :表I :卵巣组织大皮质片出液氮后的解冻步骤
权利要求
1.ー种适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻保护液，在5. 5mol/Lこニ醇+30%聚蔗糖+0. 5mol/L蔗糖的玻璃化液中添加促性腺激素，所述的卵巢大皮质片体积为80mm3以上，厚度 < 2_。
2.根据权利要求I所述的ー种适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻保护液，其特征在于所述的促性腺激素是人绝经期促性腺激素、黄体生成素或促卵泡刺激激素。
3.根据权利要求I或2所述的ー种适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻保护液，其特征在于所述的卵巢大皮质片是成年小鼠卵巢大皮质片，所述的促性腺激素是0. 2IU/mL 0.6IU/mL的人绝经期促性腺激素、黄体生成素或促卵泡刺激激素。
4.根据权利要求3所述的ー种适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻保护液，其特征在于所述的促性腺激素是0. 3IU/mL的促卵泡刺激激素。
5.根据权利要求I或2所述的ー种适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻保护液，其特征在于所述的卵巣大皮质片是绵羊卵巢大皮质片，所述的促性腺激素是5 u g/mL 20 y g/mL的促卵泡刺激激素。
6.根据权利要求5所述的ー种适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻保护液，其特征在于促性腺激素是10 U g/mL的促卵泡刺激激素。
7.ー种适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻方法，其特征在于该方法为 玻璃化渗透平衡时所用的玻璃化冷冻保护液如权利要求I至6任一所述； 滲透平衡温度为22 24°C;滲透平衡时间T (min)与卵巣大皮质片面积S (mm2)的关系为 T=l/5 S+3 ； 所述的卵巢大皮质片体积为80mm3以上,厚度< 2mm。
全文摘要
本发明涉及一种卵巢大皮质片玻璃化冷冻保护液及冷冻方法。虽然玻璃化冷冻法已广泛应用于实验动物中，但目前还没有一个通用的冷冻方法和标准的冷冻液配置方案，导致玻璃化冻存的体积移植徘徊在小体积阶段，而卵巢小皮质片所含卵泡有限，影响移植卵泡的寿命。本发明提供了适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻保护液，在常用玻璃化液的基础上添加了促性腺激素，本发明进一步提供了适用于卵巢大皮质片的玻璃化冷冻方法，特别是玻璃化冻存不同体积卵巢大皮质片的最适宜的渗透平衡时间，方便实验动物、良种大家畜、突然死亡的野生濒危物种卵巢的冻存；采用此方法能够提高卵泡存活，缩短移植物的血流再灌注的时间，提高冻存卵巢移植回体内的存活率。
文档编号A01N1/02GK102771471SQ20121019357
公开日2012年11月14日 申请日期2012年8月22日 优先权日2012年8月22日
发明者党玲, 王燕蓉, 王红燕 申请人:宁夏医科大学