专利名称：加速黄柄鹅膏菌丝体生长的优化培养方法
技术领域：
本发明涉及一种加速黄柄鹅膏/Varices)菌丝体生长的培养方法,属于生物技术领域，具体地说是属于大型真菌室内培养范畴。
背景技术：
鹅膏菌属―)隶属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、鹅膏菌科 teceae)，是有毒的大型真菌中较特殊、较有价值的一个世界性广布大属,其物种多 样性是非常丰富的，全球已报道近400种，中国已记录的近100种(含亚种、变种及变型)。鹅膏菌属中的大部份种属于著名剧毒菌，因此，鹅膏的价值在于其毒素。鹅膏菌毒素可分为四类，其中最主要也是最重要的是肽类毒素，肽类毒素又包括鹅膏毒肽(amatoxins)、鬼笔毒肽(phallotoxins)和毒伞素类(virotoxins)三种。鹅膏毒素的应用研究主要体现在以下几方面①可用于研究真核生物基因的表达、调控及细胞定位；②可开发抗菌、抗病毒、抗肿瘤、镇静麻醉及其它特效新药；③可用于生物防冶。鹅膏菌属大多属于外生菌根真菌，目前尚不能人工栽培，难以开发利用。虽然已有少数的种能进行菌丝的纯培养，但也存在一些问题，如菌丝生长缓慢、菌丝中毒素含量不高。鹅膏多肽毒素是一种由7-8个被修饰了的稀有氨基酸组成的环肽，可能不是基因编码的直接产物，而是经过加工后的次级产物，要克隆毒素的基因是复杂而困难的，且其化学合成品也没有活性。因此，至今国内外还没有一种能规模化开发的毒素产品。现作为生化试剂的肽类毒素全部来源于欧美的毒鹅膏(Mrnnita phalloides)子实体，销价昂贵。鹅膏种群小，个体少，产量低，分布数量极其有限。加之对生境敏感，一旦生境受到破坏，极易消失或灭绝，属于特殊的致危生物类群，这更增加了其进一步被研究、利用的难度。鹅膏的人工驯化或栽培是保证鹅膏资源可持续性利用的前提或关键，但此目前仍然属于难以攻克的问题及盲点，其中菌丝难以诱导，菌丝生长非常缓慢是制约及影响人工培养的重要环节或因素。黄柄鹅膏菌flavipes Imai)是鹅膏属中的一个广布种,主要分布于云南、四川、西藏(东南部林区)，其形态特征如下子实体较小或中等；菌盖直径3-7. 5cm,初期卵圆形，后扁平至近平展，褐色到黄褐色，中央色深而向边缘色浅呈黄色，表面湿时粘附有暗黄或金黄色块状粉质鳞片；菌肉白色，近表皮下褐黄色；菌褶白色带黄色，离生，不等长，较密；菌柄较长，柱形，向下渐粗，长7-lOcm，粗0. 6-lcm,淡黄且上部白色带黄色，基部呈球形且有环带状金黄色斑纹或粉末状菌托残痕，内部松软至空心；菌环膜质，黄色，生柄之中上部，上表面有细条纹；孢子形状从宽椭圆形至近卵圆形，光滑，无色，7. 5-10 u mX 5-7. 5 u m,糊性反应。本发明以云南武定狮子山自然保护区采集的黄柄鹅膏菌为材料，成功分离到了该种的菌丝，但菌丝生长非常慢，难以扩繁，本发明征对此问题进行了重点突破。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种简单，生产成本低，能促进菌丝快速生长的固体培养方法。本发明的技术方案，其步骤为
(I)材料的选择野外采摘生长优良、无虫害、未开伞或未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；
(2)材料的消毒及处理将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为四，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0. 08 0. 16cm2的小块；
(3)菌丝体诱导将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基(马铃薯200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、NH4NO3 0. 30 0. 40g/L、谷氨酸 0. 28 0. 32 g/L、Vbi
0.10mg/L、麦芽汁150 1111/1、琼脂11.0(^/1，控制？11值为5.4左右)表面，培养温度为21 220C，暗培养14 18天，菌块周围开始萌发出极少白色菌丝，53 60天，组织块多处隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；
(4)菌丝体均一性与扩大培养将上面诱导出的菌丝体从试管中转接入培养皿(诱导培养基)，在温度为21 22°C下，经过38 40天的暗培养，培养皿中形成直径2. 5 3. Ocm的圆形规则菌落，用直径I. 0 cm的圆形打孔器取菌落边缘同一生长期的菌块进行扩大培养,每35 36天扩大培养一次；
(5)培养基改良及优化以诱导培养基为基础，对菌丝体的培养基进行了反复筛选，得到了优化的培养基(马铃薯100. 00 120. 00g/L、葡萄糖9. 00 12. 00g/L、滇青R腐叶干粉(过80 100目分样筛)30. 00 50. 00g/L、生境土干粉(过80 100目分样筛)60. 00 80. 00g/L、蛋白胨 3. 00 5. 00 g /UNH4NO3 0. 60 0. 80g/L、6_BAl. 20 I. 50mg/L、麦芽汁200 230 ml/L、琼脂6. 00 8. 00 g/L，控制PH值为5. 4左右)，使用该培养基，22 25天，菌丝直径为7. 5 8. 5cm,菌丝基本长满培养皿。本发明的有益效果是采用简单培养基，使菌丝能快速增殖，缩短了生长周期，其特点如下，
(1)操作简单在诱导培养基基础上，对培养基进行了优化，使菌丝在短时间内大量繁
殖；
(2)周期缩短、生长速度加快本发明使培养时间从40天左右缩短到25天左右，而且菌丝生长速度明显提高，约为原来的3倍；
(3)生产成本低；本发明的培养基主要利用腐叶干粉、生境土等天然材料，成本低、效果好。
具体实施例方式以下的实施例子是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。实例一
野外采摘生长优良、无虫害、未开伞或未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；
将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为四，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0. 08 0. 16cm2的小块；
将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基(马铃薯200. 00g/L、葡萄糖20. 00g/L, NH4NO3 0. 30g/L、谷氨酸 0. 32 g/L、Vbi 0. 10mg/L、麦芽汁 150 ml/L、琼脂 11. 00g/L,控制PH值为5. 4左右)表面，培养温度为21 22°C，暗培养14天，菌块周围开始萌发出极少白色菌丝，60天，组织块多处隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；
将上面诱导出的菌丝体从试管中转接入培养皿(诱导培养基)，在温度为21 22°C下，经过40天的暗培养,培养皿中形成直径3. Ocm的圆形规则菌落,用直径I. 0 cm的圆形打孔器取菌落边缘同一生长期的菌块进行扩大培养，每35天扩大培养一次；
以诱导培养基为基础，对菌丝体的培养基进行了反复筛选，得到了优化的培养基(马铃薯100. 00g/L、葡萄糖10. 00g/L、滇青R腐叶干粉(过80目分样筛)30. 00g/L、生境土干 粉(过 80 目分样筛)70. 00g/L、蛋白胨 3. 00g /UNH4NO3 0. 80g/L、6_BAl. 50mg/L、麦芽汁200ml/L、琼脂6. 00 g/L,控制PH值为5. 4左右)，使用该培养基，25天，菌丝直径为8. 5cm,菌丝基本长满培养皿。实例二
野外采摘生长优良、无虫害、未开伞或未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；
将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为四，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0. 08 0. 16cm2的小块；
将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基(马铃薯200. 00g/L、葡萄糖20. 00g/L, NH4NO3 0. 40g/L、谷氨酸 0. 28g/L、Vbi 0. 10mg/L、麦芽汁 150 ml/L、琼脂 11. 00g/L,控制PH值为5. 4左右)表面，培养温度为21 22°C，暗培养16天，菌块周围开始萌发出极少白色菌丝，55天，组织块多处隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；
将上面诱导出的菌丝体从试管中转接入培养皿(诱导培养基)，在温度为21 22°C下，经过39天的暗培养,培养皿中形成直径2. 8cm的圆形规则菌落,用直径I. 0 cm的圆形打孔器取菌落边缘同一生长期的菌块进行扩大培养，每36天扩大培养一次；
以诱导培养基为基础，对菌丝体的培养基进行了反复筛选，得到了优化的培养基(马铃薯120. 00g/L、葡萄糖12. 00g/L、滇青R腐叶干粉(过100目分样筛)40. 00g/L、生境土干粉(过 100 目分样筛)60. 00g/L、蛋白胨 5. 00g/L、NH4NO3O. 60g/L、6_BAl. 30mg/L、麦芽汁 230ml/L、琼脂7. 00g/L,控制PH值为5. 4左右)，使用该培养基，23天，菌丝直径为8. Ocm,菌丝基本长满培养皿。实例三
野外采摘生长优良、无虫害、未开伞或未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；
将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为四，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0. 08 0. 16cm2的小块；
将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基(马铃薯200. 00g/L、葡萄糖20. OOg/L, NH4NO3 0. 35g/L、谷氨酸 0. 30 g/L、Vbi 0. 10mg/L、麦芽汁 150 ml/L、琼脂 11. 00g/L,控制PH值为5. 4左右)表面，培养温度为21 22°C，暗培养18天，菌块周围开始萌发出极少白色菌丝，53天，组织块多处隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；
将上面诱导出的菌丝体从试管中转接入培养皿(诱导培养基)，在温度为21 22°C下，经过40天的暗培养,培养皿中形成直径2. 5cm的圆形规则菌落,用直径I. 0 cm的圆形打孔器取菌落边缘同一生长期的菌块进行扩大培养，每35天扩大培养一次；
以诱导培养基为基础，对菌丝体的培养基进行了反复筛选，得到了优化的培养基(马铃薯110. 00g/L、葡萄糖9. 00g/L、滇青R腐叶干粉(过80目分样筛)50. 00g/L、生境土干粉(过80 目分样筛)60. 00g/L、蛋白胨 4. 00 g /UNH4NO3 0. 70g/L、6_BAl. 20mg/L、麦芽汁 210ml/L、琼脂8. 00 g/L,控制PH值为5. 4左右)，使用该培养基，22天，菌丝直径为7. 5cm,菌丝基本长满培养皿。实例四 野外采摘生长优良、无虫害、未开伞或未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；
将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为四，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0. 08 0. 16cm2的小块；
将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基(马铃薯200. 00g/L、葡萄糖20. 00g/L, NH4NO3 0. 38g/L、谷氨酸 0. 28 g/L、Vbi 0. 10mg/L、麦芽汁 150 ml/L、琼脂 11. 00g/L,控制PH值为5. 4左右)表面，培养温度为21 22°C，暗培养15天，菌块周围开始萌发出极少白色菌丝，58天，组织块多处隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；
将上面诱导出的菌丝体从试管中转接入培养皿(诱导培养基)，在温度为21 22°C下，经过38天的暗培养,培养皿中形成直径2. 8cm的圆形规则菌落,用直径I. 0 cm的圆形打孔器取菌落边缘同一生长期的菌块进行扩大培养，每35天扩大培养一次；以诱导培养基为基础，对菌丝体的培养基进行了反复筛选，得到了优化的培养基(马铃薯105. 00g/L、葡萄糖11. 00g/L、滇青R腐叶干粉(过100目分样筛)35. 00g/L、生境土干粉(过 100 目分样筛)75. 00g/L、蛋白胨 3. 50g/L、NH4NO3 0. 80g/L、6_BAl. 50mg/L、麦芽汁 220ml/L、琼脂6. 00g/L,控制PH值为5. 4左右)，使用该培养基，24天，菌丝直径为8. 2cm,菌丝基本长满培养皿。实例五
野外采摘生长优良、无虫害、未开伞或未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；
将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为四，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0. 08 0. 16cm2的小块；
将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基(马铃薯200. 00g/L、葡萄糖20. 00g/L, NH4NO3 0. 32g/L、谷氨酸 0. 31 g/L、Vbi 0. 10mg/L、麦芽汁 150 ml/L、琼脂 11. 00g/L,控制PH值为5. 4左右)表面，培养温度为21 22°C，暗培养17天，菌块周围开始萌发出极少白色菌丝，56天，组织块多处隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；将上面诱导出的菌丝体从试管中转接入培养皿(诱导培养基)，在温度为21 22°C下，经过39天的暗培养,培养皿中形成直径2. 9cm的圆形规则菌落,用直径I. O cm的圆形打孔器取菌落边缘同一生长期的菌块进行扩大培养，每36天扩大培养一次； 以诱导培养基为基础，对菌丝体的培养基进行了反复筛选，得到了优化的培养基(马铃薯115. OOg/L、葡萄糖10. 00g/L、滇青R腐叶干粉(过80目分样筛)45. 00g/L、生境土干粉(过 80 目分样筛)80. 00g/L、蛋白胨 4. 50g /UNH4NO3 0. 65g/L、6_BAl. 30mg/L、麦芽汁 200ml/L、琼脂6. 00g/L,控制PH值为5. 4左右)，使用该培养基，23天，菌丝直径为7. 8cm,菌丝基本长满培养皿。
权利要求
1.一种加速黄柄鹅膏/Varices)菌丝体生长的培养方法,其特征为,采用成熟子实体室内诱导菌丝，征对菌丝体培养过程中菌丝体生长极其缓慢等问题，通过培养基改良，提供能促进菌丝快速生长的优化培养基，主要包括下列步骤 (1)材料的选择野外采摘生长优良、无虫害、未开伞或未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体； (2)材料的消毒及处理将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为四，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成约0. 08 0. 16cm2的小块； (3)菌丝体诱导将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基表面，培养温度为21 22°C，暗培养14 18天，菌块周围开始萌发出极少白色菌丝，53 60天，组织块多处隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝； (4)菌丝体均一性与扩大培养将上面诱导出的菌丝体从试管中转接入培养皿(诱导培养基)，在温度为21 22°C下，经过38 40天的暗培养，培养皿中形成直径2. 5 3. Ocm的圆形规则菌落，用直径I. 0 cm的圆形打孔器取菌落边缘同一生长期的菌块进行扩大培养,每35 36天扩大培养一次； (5)培养基改良及优化以诱导培养基为基础，对菌丝体的培养基进行了反复筛选，得到了优化的培养基，使用该培养基，22 25天，菌丝直径为7. 5 8. 5cm，菌丝基本长满培养皿。
2.根据权利要求I所述的加速黄柄鹅膏菌丝体生长的培养方法，其特征在于步骤(3)中的诱导培养基为马铃薯200. 00g/L、葡萄糖20. 00g/L、NH4NO3 0. 30 0. 40g/L、谷氨酸、0.28 0.32 g/L、VB1 0. 10mg/L、麦芽汁 150 1111/1、琼脂11.00 g/L，控制 PH值为 5. 4 左右。
3.根据权利要求I所述的加速黄柄鹅膏菌丝体生长的培养方法，其特征在于步骤(5)中的优化培养基为马铃薯100. 00 120. 00g/L、葡萄糖9. 00 12. 00g/L、滇青网腐叶干粉(过80 100目分样筛)30. 00 50. 00g/L、生境土干粉(过80 100目分样筛)60. 00 、80. 00g/L、蛋白胨 3. 00 5. 00 g /UNH4NO3 0. 60 0. 80g/L、6_BAl. 20 I. 50mg/L、麦芽汁200 230 ml/L、琼脂6. 00 8. 00 g/L,控制PH值为5. 4左右。
全文摘要
本发明涉及一种加速黄柄鹅膏(Amanitaflavipes)菌丝体生长的培养方法，属于大型真菌培养技术领域。其特征为由未开伞的成熟子实体诱导菌丝体，通过培养基改良，提供简单、培养周期短、成本低，能促进菌丝快速生长的优化培养基。鹅膏属是特殊珍贵的大型经济真菌，其价值大应用范围广，在开发新特效药如抗肿瘤、抗菌抗病毒、镇静或麻醉药等领域具有潜在地应用前景，但至今因其资源珍稀、难以人工驯化、毒素的化学合成品无活性等问题尚难以开发应用。本发明以云南武定狮山采集的黄柄鹅膏为材料，征对其菌丝难以诱导、菌丝生长非常缓慢等制约培养的问题进行了创新性突破，为今后鹅膏菌丝规模化培养及人工驯化等提供了条件。
文档编号A01G1/04GK102696404SQ20121023701
公开日2012年10月3日 申请日期2012年7月10日 优先权日2012年7月10日
发明者何隽, 冯辽辽, 吴鹏, 周文, 唐萍, 张曦予, 李宗菊, 李彪, 赵昱 申请人:云南大学