专利名称：转基因提高丹参中迷迭香酸含量的方法
技术领域：
本发明属于药用植物基因工程技术领域，具体涉及到在丹参中转化金鱼草Roseal基因提高迷迭香酸含量的方法。
背景技术：
丹参是我国常用大宗道地药材，为唇形科鼠尾草属植物丹参(Salviamiltiorrhiza Bunge)的干燥根及根莖,对心脑血管疾病、癌症及各种炎症具有显著的临床治疗作用。随着丹参有效成分及其药理活性的深入研究，近年来以丹参为主要原料的药品、制剂、化妆品和系列保健产品层出不穷，丹参资源供不应求。伴随着丹参药材需求的日益扩大和野生资源的逐渐减少，人工种植面积逐年增大。然而作为常异交植物，丹参种内变异较大，性状复杂。栽培丹参只种不选的状况使得各产地丹参质量参差不齐，品种退化严重，有效成分含量不稳定，成为丹参作为高品质植物药大规模进军国际市场的最大障碍之一。因 此，提高丹参中有效成分的含量，尤其是迷迭香酸的含量，对培育优异的丹参资源具有重要意义。为了提高品质、满足市场需求，近年来利用基因工程、细胞工程等现代生物技术手段对丹参进行改良以提高其药材有效成分的含量愈来愈受到人们的重视。在诸多方法之中，利用基因工程技术对药用植物次生代谢途径的遗传特性进行改造，提高药用植物有效成分含量，培育能够大量积累目标次生代谢物的新品种，愈来愈受到人们的关注。以转基因技术为核心的现代分子育种技术在改良药用植物、丰富中药资源、提高抗病性和抗逆性、培育高天然药物含量的新型转基因药材中有着诱人的应用前景。但目前利用转基因技术提高丹参中丹参酚酸类成分的含量，特别是迷迭香酸含量的方法尚无报道。植物代谢途径是由多种酶参与的多步反应，受发育、环境等因素的影响，而对单个基因进行修饰有时难以奏效。转录调控因子可调控植物次生代谢物合成途径中多个关键酶基因的表达，有效地激活或抑制整条代谢途径，从而调节特定次生代谢物质的合成与否以及积累量的多少。改变转录因子的表达往往可导致植物中该转录因子所控制性状发生较大改变，因此，利用基因工程的方法调控转录因子是具有应用价值的植物遗传操作手段。本发明通过构建转录因子过表达载体，将金鱼草Roseal基因导入丹参中，提高丹参中迷迭香酸的含量，可以填补该领域研究的空白，因而该技术路线具有较强的创新性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述技术中的不足，提供一种提高丹参中迷迭香酸含量的新方法。解决上述技术问题所采用的技术方案包括下述步骤I、金鱼草Roseal基因的克隆提取金鱼草总RNA并反转录成cDNA备用，设计金鱼草Roseal基因编码框的上游引物、下游引物，并在上游引物上引入BglII限制性酶切位点和保护碱基GAAGATCT，下游引物上引入BstEII限制件酶切位点和保护碱基CAGGGTCACC,上游引物的序列为5’ -GAAGATCTATGGAAAAGAATTGTCGTGGAGT-3'下游引物的序列为 5’-CAGGGTCACCTTAATTTCCAATTTGTTGGGCCT-3’，以金鱼草cDNA为模板，经聚合酶链式反应扩增，获得的扩增产物进行电泳分离，回收扩增产物与PMD19-T Simple载体用T4DNA连接酶连接，连接产物采用热激转化法转入大肠杆菌DH5a，连接产物与大肠杆菌DH5a的体积比为I : 10，连接产物转入100 μ L大肠杆菌DH5 a感受态细胞中，随机挑选所得阳性克隆，经菌落聚合酶链式反应检测、测序验证得到所述基因的编码序列如下
权利要求
1.ー种转基因提高丹參中迷迭香酸含量的方法，其特征在于该方法包括下述步骤 (1)金鱼草Roseal基因的克隆 提取金鱼草总RNA并反转录成cDNA备用，设计金鱼草Roseal基因编码框的上游引物、下游引物，并在上游引物上引入BglII限制性酶切位点和保护碱基GAAGATCT，下游引物上引入BstEII限制件酶切位点和保护碱某CAGGGTCACC，卜.游引物的序列为5’ -GAAGATCTATGGAAAAGAATTGTCGTGGAGT-3’，下游引物的序列为 5’ -CAGGGTCACCTTAATTTCCAATTTGTTGGGCCT-3’，以金鱼草cDNA为模板，经聚合酶链式反应扩增，获得的扩增产物进行电泳分离，回收扩增产物与PMD19-T Simple载体用T4DNA连接酶连接，连接产物采用热激转化法转入大肠杆菌DH5 α，连接产物与大肠杆菌DH5 α的体积比为I : 10，连接产物转入100 μ L大肠杆菌DH5a感受态细胞中，随机挑选所得阳性克隆，经菌落聚合酶链式反应检测、测序验证得到所述基因的编码序列如下atggaaaaga attgtcgtgg agtgagaaaa ggtacttgga ccaaagaaga 50agacactctc ttgaggcaat gtatagaaga gtatggtgaa gggaaatggc 100atcaagttcc acacagagca gggttgaacc ggtgtaggaa gagttgcagg 150ctgaggtggt tgaattatct gaggccaaat atcaaaagag gtcggttttc 200gagagatgaa gtggacctaa ttgtgaggct tcataagctg ttgggtaaca 250aatggtcgct gattgctggt agaattcctg gaaggacagc taatgacgtg 300aagaactttt ggaatactca tgtggggaag aatttaggcg aggatggaga 350acgatgccgg aaaaatgtta tgaacacaaa aaccattaag ctgactaata 400tcgtaagacc ccgagctcgg accttcaccg gattgcacgt tacttggccg 450agagaagtcg gaaaaaccga tgaattttca aatgtccggt taacaactga 500tgagattcca gattgtgaga agcaaacgca attttacaat gatgttgcgt 550cgccacaaga tgaagttgaa gactgcattc agtggtggag taagttgcta 600gaaacaacgg aggatgggga attaggaaac ctattcgagg aggcccaaca 650aattggaaat taa66^ (2)构建含有金鱼草Roseal基因的植物表达载体 用BglII和BstEII双酶切含有金鱼草Roseal基因的pMD 19-T Simple载体和pCAMBIA-1302植物表达载体，回收的酶切产物，用T4DNA连接酶连接，连接产物采用热激转化法转化大肠杆菌DH5 α，挑取单克隆，进行菌落聚合酶链式反应检测和提取质粒酶切筛选阳性克隆，得到含有金鱼草Roseal基因的植物表达载体,该表达载体序列如核苷酸序列表<210>2 ； (3)制备含有金鱼草Roseal基因的植物表达载体的根瘤农杆菌菌株 将含有金鱼草Roseal基因的植物表达载体转化根瘤农杆菌ΕΗΑ105感受态细胞，采用液氮冻融法进行转化，转化后的产物于28°C恒温培养箱中倒置培养18 36小吋，挑取抗性单菌落进行菌落聚合酶链式反应筛选，获得含有金鱼草Roseal基因植物表达载体的根瘤农杆菌菌株； (4)制备转基因丹參植株 采用常规组织培养方法获得无菌丹參试管苗，根瘤农杆菌介导的丹參遗传转化体系采用叶盘法，即将继代培养15天的丹參无菌苗叶片切成小块，转入每IL培养基中含有IOmL浓度为I. Omg/mL的6-苄氨基腺嘌呤、ImL浓度为I. Omg/mL的a_萘こ酸的MS培养基上预培养I天，用含有金鱼草Roseal基因植物表达载体的根瘤农杆菌菌株浸染预培养过的丹參叶片，浸染方法为28°C恒温100转/分钟浸染25 30分钟，浸染过的叶片置于每IL培养基中含有IOmL浓度为I. Omg/mL的6-苄氨基腺嘌呤、ImL浓度为I. Omg/mL的a_萘こ酸的MS培养基上暗培养2 3天至叶片边缘有农杆菌长出，叶片从培养基上取出，转接到每IL培养基中含有IOmL浓度为3mg/mL的潮霉素和IOmL浓度为200mg/mL的头孢霉素的MS培养基中进行培养，长出抗性芽后将其转入到每IL培养基中含有IOmL浓度为3mg/mL的潮霉素和IOmL浓度为200mg/mL的头孢霉素的1/2MS培养基上生根，获得潮霉素抗性的再生丹參植株，用金鱼草Roseal基因的特异性检测引物聚合酶链式反应扩增再生丹參植株的DNA，波长为302nm的紫外线下观察到663bp目的条带的阳性株系即为转基因丹參植株。
2.根据权利要求I所述的转基因提高丹參中迷迭香酸含量的方法，其特征在于在构建含有金鱼草Roseal基因的植物表达载体步骤(2)中，所述的用BglII和BstEII双酶切为取含有金鱼草Roseal基因的pMD19_T Simple载体、IOXH Buffer、二次蒸懼水、限制性内切酶BglII于37°C反应I小时20分钟，再加入限制性内切酶BstEII，60°C反应I小时，限制性内切酶BglII与限制性内切酶BstEII、含有金鱼草Roseal基因的pMD19-TSimple载体、二次蒸馏水、IOXHBuffer的体积比为3 3 20 19 5 ； 取？041^从-1302植物表达载体、10父!1 Buffer、二次蒸馏水、限制性内切酶BglII于37°C反应I小时20分钟，再加入限制性内切酶BstEII，60°C反应I小时，限制性内切酶BglII与限制性内切酶BstEII、pCAMBIA-1302植物表达载体、二次蒸馏水、IOXH Buffer的体积比为3 3 20 19 :5。
全文摘要
一种转基因提高丹参中迷迭香酸含量的方法，该方法包括金鱼草Rosea1基因的克隆、构建含有金鱼草Rosea1基因的植物表达载体、制备含有金鱼草Rosea1基因的植物表达载体的根癌农杆菌菌株、制备转基因丹参植株4个步骤。实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应检测转基因丹参中金鱼草Rosea1基因的表达；对表达金鱼草Rosea1基因的转基因丹参中迷迭香酸含量进行高效液相色谱测定，筛选得到迷迭香酸含量提高的转基因丹参植株。采用本发明获得的转基因丹参植株，生长90天的干燥根中，迷迭香酸的含量高达129.37±3.47mg/g，是非转化普通丹参干燥根中迷迭香酸含量的2.16倍。
文档编号A01H5/00GK102827866SQ201210351718
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月20日 优先权日2012年9月20日
发明者王喆之, 陈玉芹, 宋银, 姚伟, 王东浩 申请人:陕西师范大学