专利名称：松材线虫的玻璃化冷冻保存及解冻复苏方法
技术领域：
本发明涉及松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)的冷冻保存方法,尤其涉及松材线虫的玻璃化冷冻保存及解冻复苏方法，属于松材线虫的冷冻保存领域。
背景技术：
松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是松材线虫病的病原物,属于侧尾腺口纲，垫刃目，滑刃超科，滑刃科，伞滑刃线虫属。松树是中国的主要造林树种且其中许多种类是感病的，全中国一半以上省份的气候适合松材线虫病的发生，在中国大部分地区具备成灾和流行的基本条件，是中国林业和生态环境建设的心腹大患。松材线虫病又名松材线虫萎蔫病、松树萎蔫病、松树枯萎病，是松属树种的一种毁灭性的病害，因其危害严重且防治非常困难而被世界上许多国家列为检疫对象。松材线虫危害黑松(Pinus thunbergii)、赤 松(P. sylvestris)、马尾松(P. massoniana)和湿地松(P. elliottii)等多种松树，被称为松树的“癌症”。自发现松材线虫病以来，国内外就展开了大量研究，一直在不断地探索其防治措施。松材线虫的低温冷冻保存能够充分利用并收集各种来源的松材线虫，可为松材线虫的致病机理和生物防治技术的研究和应用提供大量实验材料，并且不受时间和空间的限制。线虫种质资源的提供与保存作为整个研究中最为基础的一个环节，将受到人们越来越多的重视。松材线虫的实验室传统保存方法是将松材线虫连同培养基置于(4_8°C )冰箱中保存，虽然比较有效，但因受到温度和湿度的限制，不能满足商业化制剂的要求和需要，很难进入商品化生产阶段，也由于人力和物力上的巨大消耗，难于在实验室作为种质资源长期保存的方法。受细胞冻存的启发，低温冻存也开始应用于线虫学方面。为了寻找线虫低温保存技术，各国学者从十九世纪二十年代就开始进行低温保存技术的研究，Rahm在1921年和1922年进行了 Plecus rhizophilus和P. parietinus线虫种的低温忙藏试验，在窒息条件下，Plecus spp.暴露在_272°C几个小时、暴露在_192°C 5d,仍可存活。试验中Rahm发现Plecus spp.线虫慢慢在水中冷冻条件下,在_253°C,最多可存活24h。后来DeConinck又进行了 Anguillula silusiae线虫_196°C的液氮冷藏试验,他发现在不加保护剂条件下，A. silusiae线虫经_30°C和_196°C两步处理时，可获得3龄和4龄幼虫5%的存活率。冷冻保护剂(cryoprotective agents, CPA)是指某一类化合物,可以保护细胞抵抗低温或超低温对细胞产生的损害，如细胞内结冰、脱水、溶质浓度提高和蛋白质变性及其骨架结构的损伤等，这类化合物称作冷冻保护剂。冷藏试验研究发现，冷冻保护剂溶液是影响冷冻效果的重要因素。根据能否渗透进入细胞，可将冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两种。此外，还有一些新的冷冻保护剂，如抗冻蛋白、植物类抗冻因子等。不同线虫属之间或同一属内不同种之间对冷冻保护剂的反应存在着很大差别。九十年代以后，科学家们更注重冷冻技术的研究，根据冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶，冻存方法可分为玻璃化和非玻璃化两种。
玻璃化冷冻即应用高浓度的冷冻保护剂溶液在超速冷冻过程中，形成一种极其粘稠的固化状态，从而避免细胞内冰晶形成的一种冷冻技术。重要的是，玻璃化过程完全避免了冷冻细胞的在解冻直至恢复细胞生物活性中冰晶的形成。玻璃化冷冻是指超快速降低细胞温度的一种冷冻模式，一般是将经过冷冻保护剂平衡后的线虫直接由零度以上温度浸入液氮中保存，避免了细胞内冰晶形成所致化学、物理损伤，同时缩短了冷冻处理所需的时间，简化了步骤，也不需昂贵的程序降温仪；但是，高浓度的保护剂也会对细胞造成巨大损伤。因此，玻璃化法研究的重点是寻找容易实现玻璃化并且对生物材料毒性较小的冷冻剂，还要更进一步地提高冷冻和解冻速率。玻璃化冻存法操作相对简单、快捷，不必使用贵重的程序控温仪器，实用性强且应用范围广泛；另外，玻璃状的粘稠固体能够使其在冷冻时不会形成冰晶，减少了生物材料受到的化学和物理损伤，从而提高存活率。玻璃化冷冻采用的保护剂浓度远高于常规冷冻的浓度，目的是为了使玻璃化液在冷冻过程(由零度以上温度浸入液氮)中，由液态转变为一种类似“玻璃”的非结构状态，但没有冰晶形成，所形成的“玻璃”结构保持着液态时正常的离子分布，维持了正常的超微·结构，减少了对虫体及细胞损害，提高了冷冻复苏率和繁殖率。可见，提高保护剂的浓度能够促进玻璃化的形成，减少冰晶的损伤，但是过高的保护剂浓度又会对线虫造成渗透损伤，毒性致死。因此，必须在二者之间寻求到一种平衡，使得线虫在该浓度的处理下冷冻效果最佳。现有的松材线虫的冷冻保存及解冻方法均不同程度的存在着冻后存活率较低的缺陷，有待改进。
发明内容
本发明的目的是提供一种冻后存活率高的松材线虫玻璃化冷冻保存及解冻复苏方法；本发明的目的是通过以下技术方案来实现的松材线虫的玻璃化冷冻保存及解冻复苏方法，包括以下步骤(I)将松材线虫悬液与冷冻保护剂混合均匀得到混合物；将混合物进行平衡处理；(2)平衡处理后的混合物在液氮中冷冻保存；(3)解冻、复苏；其中，所述的冷冻保护剂是二甲基亚砜和卵黄。现有的冷冻保护剂的种类较多，采用不同种类、不同用量的冷冻保护剂，其对于松材线虫的冷冻保存效果存在着显著性的差异；为了筛选出适宜于松材线虫冷冻保存的冷冻保护剂，本发明进行了冷冻保护剂的优化筛选试验。试验结果发现，相比于其它的冷冻保护齐U，采用二甲基亚砜(DMSO)和卵黄作为松材线虫的冷冻保护剂，冷冻后的保护效果最好，由此，本发明优选二甲基亚砜(DMSO)和卵黄作为松材线虫的冷冻保护剂。卵黄是禽鸟或爬行动物的卵的内部贮藏养料、呈黄色的球形体，外部围有蛋白。卵黄是专供卵生和卵胎生动物胚胎发育过程中所需要的营养物质。本发明中所述的“卵黄”可以是任何一种禽鸟或爬行动物所产卵的卵黄，例如可以是鸡鸭等家禽动物的卵黄，其制备方法可以是将鸡蛋或鸭蛋煮熟后，取出其中的卵黄即可。在此基础上，本发明通过进一步的试验发现，冷冻保护剂的浓度或用量对于松材线虫冷冻后存活率的影响非常显著；本发明通过优化试验发现，控制冷冻保护剂二甲基亚砜在混合物中的终浓度是2% -5% (v/v)，控制卵黄在混合物中的终浓度是15% -25% (g/ml)时，经过液氮冷冻后的松材线虫的存活率较高，其中，当二甲基亚砜在混合物中的终浓度是4% (v/v)，卵黄在混合物中的终浓度是20% (g/ml)时，松材线虫在液氮中冷冻保存I个月后的冻后存活率达到了 61.9±0. 7%。本发明进一步发现，在确定“2-5 % 二甲基亚砜+15-25 %卵黄”作为松材线虫的冷冻保护剂的基础上，本发明发现，进一步添加不同浓度的清蛋白对于松材线虫的冻后效果也有着较为显著的影响。清蛋白又称白蛋白。是一类不被50%饱和度的硫酸铵溶液沉淀的球状蛋白质，存在于动物组织、体液和某些植物的种子中，其分子量较低，溶于水，易结晶。在中性溶液中加热即沉淀或凝固；清蛋白的重要代表是血清蛋白、乳清蛋白、卵清蛋白、麦清蛋白、豆清蛋白及有毒的蓖麻蛋白。
为了筛选出白蛋白的最适宜的保护浓度，本发明以“4%二甲基亚砜+20%卵黄”的组合作为主要冷冻保护剂，分别添加不同浓度的清蛋白以观察不同用量的清蛋白对松材线虫冻后存活率的影响。试验结果发现，清蛋白的添加量为O. 1-0. 6%(g/ml)之间能够有效提升松材线虫的冻后存活率，其中尤以O. l%(g/ml)的加入量对于松材线虫的冻后存活率的提升最为显著。本发明方法中所述的“平衡处理”是在冷冻之前，将松材线虫悬液与冷冻保护剂的混合物在0-4°C温度条件下静置一段时间；本发明通过试验发现，不同的平衡时间对于松材线虫冻后的存活率也有着较为显著的影响。在冷冻前，经过不同时间来平衡的线虫存活率差异显著，试验结果表明，在冷冻之前，将松材线虫悬液与冷冻保护剂的混合物在0-4°C温度条件下平衡(或静置)2-3h后再进行冷冻，冻后效果最好。解冻及复苏方式不同，对线虫冻后存活率的影响也大有不同。本发明通过实验发现干解冻后的线虫存活率明显极低，且不受解冻温度变化的影响。而通过水浴解冻，线虫存活率受解冻温度的影响较大，解冻温度为40°C水浴时，线虫的存活率最高；50°C水浴解冻的线虫存活率低于40°C组；20°C和60°C之间差异不显著，在水浴解冻中存活率最低。试验结果表明，干解冻法不适于松材线虫低温保存的解冻方法。所以，本发明方法中所述的解冻复苏的方式优选为水浴解冻，更优选为40-50°C的水浴解冻，最优选为40°C的水浴解冻。将松材线虫线虫悬液与冷冻保护剂混合并进行平衡处理之前，还可以先将松材线虫悬液进行预处理；所述的“预处理方式”是将松材线虫悬液与冷冻保护剂混合在一起后在室温温度下静置12-48小时；其中所述的室温温度优选为20-25°C。不同的预处理对松材线虫冻后的存活率影响很大。本发明考察了不同的预处理方式对松材线虫线虫冻后存活率的影响，试验结果表明，采用适宜的预处理能够有效提高松材线虫的冷冻存活率。本发明通过大量的试验发现用终浓度1-5% (v/v)的DMSO和4-6% (v/v)的甘油联合在一起作为预处理中的冷冻保护剂对松材线虫悬液进行预处理，能够显著提升松材线虫的冻后存活率，其中，用终浓度3%(v/v)的DMSO和5%(v/v)的甘油联合在一起作为预处理中的冷冻保护剂，松材线虫在液氮中冷冻保存I个月后解冻复苏，松材线虫的存活率有显著提高，与其它处理方式存在显著性差异。本发明对玻璃化冷冻保存方法中的各工艺参数进行了优化，筛选到了最适宜于松材线虫玻璃化冷冻保存的保护剂的种类、浓度以及包括预处理、平衡和解冻复苏在内的最优处理方式。采用本发明方法冷冻保存松材线虫，冷冻后的松材线虫存活率高、冻后繁殖率高，能适用于不同株系松材线虫的冷冻保存。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。试验材料和方法1、主要溶液的配制 1.1冷冻保护液的配制DMS0、卵黄(从鸡蛋或鸭蛋中取出的卵黄)和清蛋白(乳清蛋白、卵清蛋白或血清蛋白)分别用无菌水配制成溶液；各种溶液经过灭菌后置于4°C冰箱保存备用。1. 2稀释液林格氏液(氯化钠8g/L,氯化钾O. 2g/L,氯化I丐O. 2g/L,碳酸氢钠O. 2g/L),无菌水和O.1M蔗糖。高压灭菌，4°C冰箱保存备用。2通用的试验方法2.1松材线虫的分离及松材线虫悬液的制备采用贝尔曼漏斗法分离实验室纯培养保存的松材线虫，将松材线虫接种到长满盘多毛孢的PDA平板上，25°C培养5-6d，线虫大量繁殖，再用贝尔曼漏斗法分离线虫，将收集到的松材线虫悬液箱保存备用。2. 2线虫悬液混均计数法将分离收集得到的松材线虫悬液进行浓缩(约5000条/ml)，取装有IOml线虫悬液的指形管，盖紧瓶盖，上下摇晃均匀，从中吸取IOOul移置在凹玻片上，在解剖镜下计数液滴中的线虫数量，重复5次，根据平均值计算出IOOul悬液中的线虫数量，再乘以10倍即为该线虫悬液的浓度。2. 3松材线虫的冷冻松材线虫悬液与冷冻保护剂混合均勻后在25°C培养箱中培养Id,再放入冷冻管中经过冷冻保护液处理后，迅速投入液氮罐中，保存24h。2. 4松材线虫的解冻与稀释将冷冻管从液氮罐中迅速取出，移至恒温水浴锅中剧烈振荡50-60S，待管中结冰完全融化立即加入稀释液。2. 5松材线虫的复苏与镜检将稀释后的松材线虫悬液放入25°C恒温箱中培养ld，解冻复苏后的线虫取50ul于凹玻片上静置5min，通过解剖镜的光热以及挑针的物理刺激观察线虫的扭动弯曲情况(活力级别分为强、弱和死亡)，以解冻后线虫能否活动作为存活与否的标准来计算总体的存活率(存活率计算公式存活率=存活后具活力的线虫数/线虫总数X 100 % )。再通过观察计算出幼虫存活率，挑出全部成虫于倒置显微镜下鉴别雌雄，并计算各自存活率。2. 6统计分析所得数据均通过SPSS13. O统计软件进行方差分析，结果数据以均数土标准差(X 土 SD)来表示，每组试验5个重复。试验例I玻璃化冷冻保护剂的筛选试验1、试验方法从同一松材线虫悬液中取出11200毫升，分成完全相同的112份样品(每份样品100毫升)，分成112个组进行下述试验试验I组向松材线虫悬液中加入冷冻保护剂DMSO和卵黄，得到混合溶液；其中，控制DMSO在混合溶液中的终浓度为O. 5%(v/v),卵黄在混合溶液中的终浓度为5% (g/ml);将混合溶液在4°C放置2h (即平衡处理)后迅速投入液氮中保存；液氮中保存I个月后于40°C水浴锅中解冻，加入适量无菌水稀释I倍，25°C培养箱中恢复培养；4°C保存，12h后计算存活率。试验2组-112组分别按照表I所述的用量向松材线虫悬液中加入冷冻保护剂DMSO和卵黄，试验方法均与试验I组相同。每组试验均重复5次，每组的冷冻存活率取5次重复试验的平均值。2、试验结果试验结果见表I。表I冷冻保护剂DMSO和卵黄的用量优选试验
权利要求
1.松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)的玻璃化冷冻保存及解冻复苏方法,包括以下步骤(I)松材线虫悬液与冷冻保护剂混合均匀得到混合物；将混合物进行平衡处理；(2)平衡处理后的混合物在液氮中冷冻保存；(3)解冻、复苏；其中，所述的冷冻保护剂是二甲基亚砜和卵黄。
2.按照权利要求1所述的玻璃化冷冻保存及解冻方法，其特征在于按v/v计，二甲基亚砜在混合物中的终浓度是2% -5%;按g/ml计，卵黄在混合物中的终浓度是15% -25%。
3.按照权利要求1或2所述的玻璃化冷冻保存及解冻方法，其特征在于按v/v计，二甲基亚砜在混合物中的终浓度是4% ;按g/ml计，卵黄在混合物中的终浓度是20%。
4.按照权利要求1所述的玻璃化冷冻保存及解冻方法，其特征在于所述的冷冻保护剂包含有白蛋白。
5.按照权利要求4所述的玻璃化冷冻保存及解冻方法，其特征在于按g/ml计，清蛋白在混合物中的终浓度是O. 1-0. 6%。
6.按照权利要求5所述的玻璃化冷冻保存及解冻方法，其特征在于按g/ml计，清蛋白在混合物中的终浓度是O. 1%。
7.按照权利要求1所述的玻璃化冷冻保存及解冻方法，其特征在于所述的平衡处理是将混合物在0-4°C温度条件下静置2-3小时。
8.按照权利要求1所述的玻璃化冷冻保存及解冻方法，其特征在于将松材线虫线虫悬液与冷冻保护剂混合并进行平衡处理之前，将松材线虫悬液进行预处理；所述的预处理是将松材线虫悬液与冷冻保护剂混合在一起得到混合物，将混合物在室温下静置；所述的冷冻保护剂是二甲基亚砜和甘油。
9.按照权利要求8所述的玻璃化冷冻保存及解冻方法，其特征在于按v/v计，二甲基亚砜在混合物中的终浓度是1_5%，优选为3% ;甘油在混合物中的终浓度是4-6%，优选为5%。
10.按照权利要求8所述的玻璃化冷冻保存及解冻方法，其特征在于所述的室温温度为20-25°C，所述的静置时间为12-48小时。
全文摘要
本发明公开了松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)的玻璃化冷冻保存及解冻复苏方法，该方法包括以下步骤(1)将松材线虫悬液与冷冻保护剂混合均匀得到混合物；将混合物进行平衡处理；(2)平衡处理后的混合物在液氮中冷冻保存；(3)解冻、复苏；其中，所述的冷冻保护剂是二甲基亚砜和卵黄。本发明对玻璃化冷冻保存方法中的各工艺参数进行了优化，筛选到了最适宜于松材线虫玻璃化冷冻保存的保护剂的种类、浓度以及包括预处理、平衡和解冻复苏在内的最适宜的处理方式。采用本发明方法冷冻保存松材线虫，冷冻后的松材线虫存活率高、冻后繁殖率高，能适用于松材线虫不同株系的冷冻保存。
文档编号A01N1/02GK102986648SQ20121042488
公开日2013年3月27日 申请日期2012年10月30日 优先权日2012年10月30日
发明者王曦茁, 张永安, 汪来发, 朴春根, 田国忠, 林彩丽, 李永 申请人:中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所