专利名称：水稻抗逆相关基因OsPP2C44及其编码蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与水稻抗逆性相关的基因，具体地说，涉及一种新的水稻抗逆相关基因及其应用，属于基因工程领域。
背景技术：
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干旱缺水是造成全球粮食减产的重要因素之一。干旱胁迫严重影响植物生长和发育，甚至造成植物死亡。水稻是重要的粮食作物之一，水稻需水占农业用水的65%，利用现代生物学技术研究植物抗旱的生理生化反应，克隆重要的抗旱基因，进而转入植物中培育抗逆性增强的作物新品种特别是培育节水抗旱的水稻新品种是缓解全球干旱缺水、人口增长带来的粮食生产压力的有效途径。植物在长期的进化过程中形成了一系列的适应机制来应对干旱等逆境胁迫。干旱胁迫下，植物一方面通过调节气孔关闭来减少水分蒸腾，同时通过促进根系生长来增加水分吸收，从而有效避免干旱胁迫对植物的伤害。同时，植物可通过合成有机大分子等渗透调节和保护的分子以及抗氧化酶类来增强自身对逆境的耐受能力。植物生理学、遗传学、分子生物学的研究使得植物的抗逆机制逐渐明晰，一些重要的抗逆基因被克隆。与抗逆相关的基因根据功能不同基本分为两类一类是编码渗透调节蛋白、抗氧化酶、转运蛋白等功能蛋白的基因；另一类是编码转录因子、蛋白激酶等起调节作用蛋白的基因。蛋白的磷酸化和去磷酸化在细胞信号转导过程中扮演重要角色，其中蛋白去磷酸化的过程由蛋白磷酸酶负责。蛋白磷酸酶根据底物蛋白氨基酸残基的种类分为蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶和蛋白酪氨酸磷酸酶，丝/苏氨酸蛋白磷酸酶依据它们不同的底物特异性及对特定抑制剂的不同敏感性来划分的主要分PPl和PP2两类。PP2又按照亚基的结构、活力及对二价阳离子的依赖而被进一步分为3个亚类PP2A、PP2B、PP2C。PP2C是一种单体蛋白磷酸酶，活力依赖Mg2+。植物中PP2C蛋白磷酸酶广泛参与植物抗病信号传导、植物创伤、抗病反应及ABA调控的抗逆信号途径等生长发育及抵抗生物与非生物胁迫反应。植物中已经发现的多种PP2C类磷酸酶均参与ABA通路的信号传导，拟南芥中的两种PP2C类磷酸酶-ABI1/2便是直接从对ABA不敏感型的突变植株的基因中克隆到的。它们体现出的蛋白憐酸酶活力受:ABA的影响而升闻，在它们闻表达或活力提闻以后又会使植株对ABA的敏感性明显降低。本发明中的 基因克隆自水稻第4染色体的抗旱QTL区段，在干旱、盐、夕卜源ABA处理下的基因表达谱分析表明，该基因可响应逆境胁迫。超表达该基因的转基因水稻抵抗渗透胁迫的能力显著增强。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的水稻抗逆相关基因，及其编码的蛋白磷酸酶，具有典型的PP2C催化结构域，属PP2C类型，可响应逆境胁迫，超量表达后可提高转基因植物的抗渗透胁迫能力。本发明的再一目的是提供水稻抗逆相关基因0sPP2C44在提高水稻抗逆性中的应用。本发明从水稻中分离克隆的一段完整编码区段的DNA片段，对这个基因编码的蛋白序列进行分析表明，它编码蛋白磷酸酶，具有典型的PP2C催化结构域，属于PP2C亚家族，因此命名为0sPP2C44。本发明分离和应用一种包含0sPP2C44基因的DNA片段，该基因能响应冷、盐、外源ABA等胁迫处理，发生表达变化。本发明采用的技术方案是，提供一种与水稻抗逆性相关的 基因，其中，所述基因的序列如下列之一SEQ ID NO: I所示的DNA序列；与SEQ ID NO: I至少90%同源的DNA序列；功能相当于SEQ ID NO: I所示序列的亚片段。 本发明的另一种优选方案是，所述的0sPP2C44基因的序列为如下列之一
SEQ ID NO: I中第263-1228位所示的DNA序列；或与SEQ ID NO: I中第263-1228位所示的DNA序列相似性达90%的DNA序列。本发明还提供一种包含0sPP2C44基因编码的蛋白，其中，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者为所述SEQ ID NO:2序列的同源序列、或保守性变异体、或等位变异体、或天然突变体、或诱导突变体。本发明还提供一种包含 基因编码的重组载体，其中，构建所述重组载体所选用的载体为Ti质粒或植物病毒载体。本发明还提供一种包含0sPP2C44基因的一种植物转化体，其中，所述植物转化体的宿主为水稻。本发明另一优先方案是提供一种提高植物抗逆性中的应用，其中，所述抗逆性中应用的植物包含权利要求I或2所述0SPP2C44的基因，所述植物为水稻。获得上述采用已克隆的0sPP2C44基因为探针，从cDNA文库和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。也可以采用PCR (polymerase chain reaction)技术,从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的0sPP2C44基因以及任何感兴趣的一段DNA或与其同源的一段DNA。采用以上技术，可以分离得到fls/^尤办基因，将这一序列与任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体连接后转化植物，可获得对逆境响应增强的转基因植株。本发明提供的载体携带本发明 基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体，直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞。本发明0sPP2C44基因表达载体转化宿主是包括水稻在内的多种植物。本发明通过对水稻基因分离克隆及其对逆境胁迫的响应，提供了一种水稻DNA片断包含一个966bp的编码基因该基因含有蛋白磷酸酶基因家族典型的结构域，为该基因家族PP2C类型成员。0sPP2C44基因受干旱、盐及外源ABA诱导表达，与水稻抗逆性相关。本发明可以用于研究利用此基因遗传转化获得转基因植物的分子方法。本发明的水稻基因对逆境产生明显响应，可应用于在植物抗逆育种。
图I为本发明利用ClustalW2软件将0sPP2C44基因预测的蛋白序列与同源蛋白序列进行比对的结果；
图2为本发明的0sPP2C44基因在水稻不同组织中的表达水平；
图3为本发明的0sPP2C44基因在苗期水稻受到冷、热、盐、PEG和外源ABA处理时的表达水平；
图4为本发明的0sPP2C44基因超表达载体转化水稻植株的Southern blot检测；
图5为本发明的基因超表达载体转化水稻植株的表达水平检测；
图6为本发明基因超表达转基因水稻与野生型水稻抵抗甘露醇模拟渗透胁
迫比较分析。
具体实施例方式下述实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例I水稻0sPP2C44基因的克隆 I.幼苗培育
将水稻置于30°C萌发48小时，然后播种于温室中，待水稻叶片为3-5片时，准备抽取DNA 或 RNA。2. RNA 的分离
RNA的提取所取样品在研钵中用液氮冷冻后研磨成粉状，加入盛有ImL TRNzol-A+试剂(天根生化科技有限公司)的2mL EP管，充分振荡后，室温放置5min，之后加O. 2mL氯仿，剧烈震荡15s后，室温放置3min ;后于4°C，12000rpm离心IOmin后，上清液移至新的2mLEP管中，加等体积异丙醇沉淀RNA，加IOOPL RNase-free ddH20溶解。电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。3.逆转录合成第一链cDNA
(O反转录之前需用DNaseI消化所提取RNA样品，反应体系如下
试剂名称j使用量(μι)
RNA5—
10 X DNaseIBuffer I
DNaseI (5υ/μΡ O. 2—
DEPCH2Q|llptol(^L _
37°C反应 15min 后，加入 O. 25μ O. IM EDTA (保证终浓度 >2mM)，70°C温育 10 min 终
止反应，短暂离心后置于冰上备用。(2)第一链cDNA的合成参照Promega反转录系统A3500操作手册，具体步骤如下
DNaseI消化过的样品中依次加入下列各试剂配制20μ 的反应体系
权利要求
1.一种与水稻抗逆性相关的6(5/ ' 基因，其特征在于，所述6(5/ ' 基因的序列如下列之一 SEQ ID NO: I所示的DNA序列； 与SEQ ID NO: I至少90%同源的DNA序列； 功能相当于SEQ ID NO: I所示序列的亚片段。
2.根据权利要求I所述的基因，其特征在于，所述的基因的序列为如下列之一· SEQ ID NO: I中第263-1228位所示的DNA序列； 或与SEQ ID NO: I中第263-1228位所示的DNA序列相似性达90%的DNA序 列。
3.一种包含权利要求I或2所述基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示，或者为所述SEQ ID NO: 2序列的同源序列、或保守性变异体、或等位变异体、或天然突变体、或诱导突变体。
4.一种包含权利要求I或2所述基因的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，构建所述重组载体所选用的载体为Ti质粒或植物病毒载体。
6.一种包含权利要求I或2所述0sPP2C44基因的一种植物转化体。
7.根据权利要求6所述的转化体，其特征在于，所述转化体的宿主为水稻。
8.一种提高植物抗逆性中的应用，其特征在于，所述抗逆性中应用的植物包含权利要求I或2所述0sPP2C44的基因，所述植物为水稻。
全文摘要
本发明公布了一种从水稻DNA片断中分离克隆的与水稻抗逆性相关的OsPP2C44基因。该基因编码的蛋白含有蛋白磷酸酶家族保守的催化结构域，为该基因家族PP2C类型成员。OsPP2C44基因受高盐、低温、高温以及ABA诱导表达，超表达OsPP2C44可提高水稻苗期抵抗渗透胁迫的能力，与水稻抗逆性相关。本发明的水稻基因对逆境产生明显响应，可应用于在植物抗逆育种，提高植物的抗逆性。
文档编号A01H5/00GK102943084SQ20121049384
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月28日 优先权日2012年11月28日
发明者刘鸿艳, 徐凯, 陈守俊, 罗利军 申请人:上海市农业生物基因中心