专利名称：一种通过幼胚胚状体发生途径诱导乌桕植株再生的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及植物组织的再生方法，具体涉及ー种通过幼胚胚状体发生途径诱导乌桕再生的方法。
背景技术：
乌桕(Sapium sebiferum)是大戟科乌桕属落叶乔木,是ー种广泛分布,集观形、观叶、观果于一体，具有极高观赏价值的景观树种；其种子既含液体油又含固体脂，含油率为42%_53%，为重要的エ业木本油料植物；种子黑色圆形，外被白色蜡质假种壳，可制油漆，假种壳为制蜡烛和肥皂的原料，乌桕种壳表面白色的蜡层可以榨取固体的油脂叫桕脂或壳油；黑色的种壳内是种仁，可以榨取液体油称为桕油或梓油；乌桕还具有广泛的药用价值， 以根皮、树皮、叶入药，具有杀虫，解毒，利尿，通便的功效。目前已有1400多年的栽培历史，是我国特有的重要经济树种。目前生产上，乌桕以播种繁殖为主，然而乌桕种子具有明显的休眠习性，且种子外被蜡质，影响种子的吸水、发芽，播种前需进行脱蜡处理，这给乌桕的播种繁殖带来了很多不便；且出苗后还需移栽，过程繁琐，费时费力，且播种受时间的限制；目前有关乌桕直接诱导丛生芽和间接通过愈伤组织再生的快繁体系已有报道，一方面促进了乌桕的快繁和转化研究，但另一方面存在着再生过程繁琐，且通过丛生芽再生途径过程中嵌合体较多，愈伤组织再生植株存在着细胞无性系变异较大，遗传性状不稳定等问题。植物胚状体是指在离体培养条件下，没有经过受精过程，但是经过了胚胎发育过程所形成胚状类似物。幼胚胚状体再生途径所形成的胚状体具有双极性，胚的结构完整，数量大，繁殖率高，再生植株速度快；由于胚状体形成时与母本的維管束系统联系较少，可获得无病毒植株；同时再生植株遗传性状稳定，无性系变异小、转化获得的转基因植株嵌合体少，并且可保持较长时期的胚胎发生能力等，为植物倍性育种、突变体选育、细胞工程和基因工程等研究奠定了基础，也是研究乌桕胚胎早期形态建成和调控的理想模型。而关于通过幼胚胚状体发生途径诱导乌桕植株再生的方法，目前尚未有报道。因此，急需开发一种通过幼胚胚状体发生途径诱导乌桕植株再生的方法，以满足当前乌桕种苗快速繁殖和品种改良的需要。
发明内容
为解决上述问题，本发明运用生物技术手段，提供一种通过幼胚胚状体发生途径诱导乌桕植株再生的方法，从而建立一种高效快速、遗传性状稳定的乌桕植株再生方法。为了实现上述目的本发明采用如下技术方案
一种通过幼胚胚状体发生途径诱导乌桕植株再生的方法，其特征在干首先取乌桕未成熟种子，剥去绿色果壳后，在无菌操作台内进行表面消毒；然后剪开种壳取出带胚乳的未成熟合子胚，进行部分损伤后，接种于胚状体诱导培养基中，经过2个月左右黑暗培养，获得两种经不同发育途径产生的胚状体；将它们接种在相应的诱导培养基中进行继代和増殖培养；然后在成苗培养基上诱导成苗；培养20-30d左右，至幼苗长成2-4个叶片，进行炼苗并移栽，获得健壮的乌桕再生苗。所述的乌桕未成熟种子取材于7月中旬即授粉ー个半月左右。所述的乌桕未成熟种子表面消毒是指用75%的こ醇表面消毒2_3min，无菌水冲洗2遍,之后用0.1 %的升萊消毒5-7min,最后用无菌水冲洗5遍,消毒期间不停地摇动。所述的带有胚乳的未成熟合子胚在接种过程中用镊子对幼胚进行部分损伤。所述的胚状体诱导培养基为MS+ 0. 1-2. Omg/L 2，4-D或0. 1-2. Omg/L IAA或0. 2-2. Omg/L NAA +30g/L蔗糖+7. 5g/L琼脂，pH=5. 8-6. 0 ;所述的继代和增殖培养基为相应的诱导培养基。所述的胚状体成苗培养基为1/2MS+ 30g/L蔗 糖+7. 5g/L琼脂，pH=5. 8-6. O。所述的胚状体诱导条件为温度(25±2)°C，黑暗培养。
本发明有益效果在于1、本发明所提供的通过幼胚胚状体发生途径诱导乌桕植株再生的方法，由于其能真实反映植株果实特性，遗传性状稳定，且胚状体结构完整、数量大、繁殖系数高(每个胚可以产生数十个甚至更多的苗)等，为乌桕优良植株的快繁和遗传改良提供了重要的技术支持；同时，在一定程度上缓解了乌桕传统育种过程中费时费力的问题，也避免了通过器官发生和间接愈伤组织再生途径对乌桕进行繁殖和遗传改良方面所帯来的嵌合体多、遗传性状不稳定等问题。
图1为取材时期的乌桕果实。图2为胚状体发育的一种途径(发育过程从a到f)。图3为胚状体发育的第二种途径(发育过程从a到f)。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进ー步详细说明。
实施例一种通过幼胚胚状体发生途径诱导乌桕植株再生的方法具体操作如下1、于7月中旬即授粉ー个半月左右采集乌桕未成熟种子。2.剥去绿色果壳后，种子用75%的こ醇表面消毒2-3min,无菌水冲洗2遍，之后用0.1 %的升汞消毒5-7min，最后用无菌水冲洗5遍,消毒期间不停的摇动。3、取出带有胚乳的未成熟胚，进行部分损伤后放在胚状体诱导培养基上进行诱导，经过约2个月左右的黑暗培养获得两种不同形态的胚状体(图2、3 )，诱导率可达90%左右。胚状体诱导培养基为 MS+ 0. 1-2. Omg/L 2，4-D 或 0. 1-2. Omg/L IAA 或 0. 2-2. Omg/L NAA +30g/L 蔗糖 +7. 5g/L 琼脂，pH=5. 8-6. O。4、将继代和増殖培养后获得的胚状体接种于胚状体成苗培养基进行成苗培养。胚状体成苗培养基为1/2MS+ 30g/L蔗糖+7. 5g/L琼脂，pH=5. 8-6. O。最后开盖炼苗、移栽，获得健壮的乌桕再生植株。
权利要求
1.一种通过幼胚胚状体发生途径诱导乌桕植株再生的方法，其特征在于首先取乌桕未成熟种子，剥去果壳后，在无菌操作台内进行表面消毒；然后剪开种壳取出未成熟合子胚，用镊子进行部分损伤后，接种于胚状体诱导培养基中，经过2个月左右黑暗培养，获得2种经不同发育途径产生的胚状体；将两种胚状体接种在相应的诱导培养基中进行继代和增殖培养；然后转至成苗培养基上诱导成苗；培养20-30d左右，待幼苗长成2-4片叶子时，进行炼苗移栽，获得健壮的乌桕再生苗。
2.根据权利要求1所述的通过幼胚胚状体发生途径诱导乌桕植株再生的方法，其特征在于所述的乌桕未成熟种子取材于7月中旬即授粉一个半月左右。
3.根据权利要求1所述的通过幼胚胚状体发生途径诱导乌桕植株再生的方法，其特征在于所述的乌桕未成熟种子表面消毒是指用75%的乙醇表面消毒3min，无菌水冲洗2遍，之后用O.1 %的升萊消毒7min,最后用无菌水冲洗5遍,消毒期间不停地摇动。
4.根据权利要求1所述的通过幼胚胚状体发生途径诱导乌桕植株再生的方法，其特征在于所述的带有胚乳的未成熟合子胚在接种过程中用镊子对幼胚进行部分损伤。
5.根据权利要求1所述的通过幼胚胚状体发生途径诱导乌桕植株再生的方法，其特征在于所述的胚状体诱导培养基为MS+ O. 1-2. Omg/L 2，4-D或O. 1-2. Omg/L IAA或O.2-2. Omg/L NAA +30g/L蔗糖+7. 5g/L琼脂，pH=5. 8-6. 0 ;所述的继代和增殖培养基为相应的诱导培养基。
6.根据权利要求1所述的通过幼胚胚状体发生途径诱导乌桕植株再生的方法，其特征在于所述的胚状体成苗培养基为1/2MS+ 30g/L蔗糖+7. 5g/L琼脂，pH=5. 8-6. O。
7.根据权利要求1所述的通过幼胚胚状体发生途径诱导乌桕植株再生的方法，其特征在于所述的胚状体诱导条件为温度(25±2) V，黑暗培养。
全文摘要
本发明公开了一种通过幼胚胚状体发生途径诱导乌桕植株再生的方法，此方法繁殖速度快，繁殖系数高(每个胚可以产生数十个甚至更多的苗)；同时又能真实反映植株果实特性且遗传性状稳定，为成熟乌桕优良植株的快繁和遗传改良提供了重要的技术支持；同时，在一定程度上缓解了乌桕传统育种过程中费时费力的问题，也避免了通过器官发生和间接愈伤组织再生途径对乌桕进行繁殖和遗传改良方面所带来的嵌合体多、遗传性状不稳定等问题。
文档编号A01H4/00GK103004594SQ20121054117
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月13日 优先权日2012年12月13日
发明者吴丽芳, 侯金艳, 李明浩 申请人:中国科学院合肥物质科学研究院