专利名称：黄瓜枯萎病的膏状生防制剂、制备方法、应用及其专用菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，具体而言，涉及一种黄瓜枯萎病的膏状生防制剂、
制备方法、应用及其专用菌株。
背景技术：
黄瓜是一种全球性的重要蔬菜作物。近年来，由于黄瓜栽培面积逐年扩大，加之大规模的南菜北运，使黄瓜成了可以周年供应的重要蔬菜，在“菜篮子工程”中占重要地位。但是，随着黄瓜生产的规模化、基地化、专业化，以及相关的生态环境变化，黄瓜生产上的病害问题显得十分突出，发生程度日趋严重，尤其是黄瓜枯萎病等土传病害危害更大，严重影响 了瓜类蔬菜作物的产量和品质。黄瓜枯萎病又称蔓割病、萎蔫病，是由尖孢镰刀菌(.Fusarium axysporum f. sp. Ci/c臟 引起典型的土传病害。在长年栽培黄瓜品种的地区，黄瓜枯萎病发病率为10°/Γ20%左右，严重的能达50%以上。据有经验的菜农估计，一般在采收前期发病的减产率为发病率的709Γ100%，中期为30°/Γ50%，生长末期的减产率则较小，严重时还可能造成绝收。因此，黄瓜枯萎病已成为严重阻碍黄瓜种植业的发展和农民的增收的重要病害。生产上一般采用选育抗病品种、嫁接育苗、药剂防治等方法减少枯萎病对生产造成的损失。现有的黄瓜品种，即使少数品种具有一定的抗、耐病能力(如中农5号、津春5号等)，不能从根本上解决病害的发生；嫁接技术难度较大，很难大面积推广；药剂防治作为简单、快速、有效的防治途径，得到人们的青睐，但尚无有效的农药可以防治这类病害，且长期使用现有的化学药物容易产生抗药性，而且会容易对环境造成严重污染。因此，通过寻求新型的防病、治病手段，达到有效地控制黄瓜枯萎病的危害，已成为生产实践中迫切需要解决的课题。微生物农药源于自然，具有环境兼容性好、持效期长、低毒安全等特点，成为各种果树病害防治的重要绿色环保途径之一。然而迄今为止，利用真菌及其膏状生防制剂高效防治黄瓜枯萎病的基因工程菌菌株则鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于解决上述现有技术中存在的不足和问题，提供一种用于防治高效防治黄瓜枯萎病的基因工程菌菌株、含该菌株的膏状生防制剂及其制备方法和应用。为了实现本发明的目的，本发明提供了一株基因工程菌菌株，其分类命名为棘孢木霉(Jrichoderma asperellum) GY20,其保藏编号为CGMCC NO :4899。本发明还提供了一种黄瓜枯萎病的膏状生防制剂，其中，所述制剂的活性成分为上述提及的所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum ) GY20的菌丝与厚垣孢子。进一步地，所述菌丝与厚垣孢子的比例，由以下培养方法决定
将在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上长好的棘孢木霉(斤icAoofe/ma asperellum) GY20孢子用无菌水洗下，调节成孢子含量为IO5孢子/mL的接种液，按5% (V/V)接种量接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，振荡培养48小时；将上步所得培养液以10% (V/V)的接种量再次接种于马铃薯葡萄液体培养基中振荡培养48小时进一步扩增后，再将所得培养液以10%(V/V)的接种量再次接种于含20L发酵培养液的发酵罐中进行发酵培养后离心得到。优选地，所述发酵罐中的发酵培养液各组分的重量份含量为甜菜液380-420、七水硫酸镁3-5、磷酸二氢钾38-42 ;所述发酵的条件为溶氧100%，搅拌速度为300-400转/分，发酵温度25-27摄氏度，发酵时间48小时，pH 7. 0-7. 2 ;所述振荡培养的条件均为140-160转/分、25-27摄氏度；所述发酵培养后离心的条件为7500-8500转/分，离心10分钟。最佳条件为所述发酵罐中的发酵培养液含量为甜菜液400. 0g、七水硫酸镁4. 0g、磷酸二氢钾40. Og ;所述发酵的条 件为溶氧100%，搅拌速度为350转/分，发酵温度26摄氏度，发酵时间48小时，pH 7.0-7. 2。所述发酵罐中的发酵培养液含量为甜菜液400. 0g、七水硫酸镁4. 0g、磷酸二氢钾40. Og ;所述发酵的条件为溶氧100%，搅拌速度为350转/分，发酵温度26摄氏度，发酵时间48小时，pH 7. 0-7. 2。优选地，所述振荡培养的条件均为150转/分、26摄氏度；所述发酵培养后离心的条件为8000转/分离心10分钟。优选地，所述膏状生防制剂还包括O. 00Γ0. 05%的铜离子抑制剂。优选地，所述膏状生防制剂还包括5 10%的可溶性淀粉。优选地，所述可溶性淀粉为土豆淀粉。本发明还提供了一种制备上述黄瓜枯萎病的膏状生防制剂的方法，其中，所述方法包括
I)将在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上长好的棘孢木霉(Trichoderma asperellum) GY20孢子用无菌水洗下，调节成孢子含量为IO5孢子/mL的接种液，按5% (V/V)接种量接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，振荡培养48小时；将上步所得培养液以10% (V/V)的接种量再次接种于马铃薯葡萄液体培养基中振荡培养48小时进一步扩增后，再将所得培养液以10%(V/V)的接种量再次接种于含20L发酵培养液的发酵罐中进行发酵培养后离心得到。2)调节pH值将上述菌丝与厚垣孢子混合体的pH值调节为3. (Γ4. O ；
3)制得膏状生防制剂向所述步骤2)得到的混合体中加入0. 00Γ0. 05%的铜离子抑制剂，最后加入5 10%的可溶性淀粉，搅拌均匀即可。优选地，所述发酵罐中的发酵培养液各组分的重量份含量为甜菜液380-420、七水硫酸镁3-5、磷酸二氢钾38-42 ;所述发酵的条件为溶氧100%，搅拌速度为300-400转/分，发酵温度25-27摄氏度，发酵时间48小时，pH 7. 0-7. 2 ;所述振荡培养的条件均为140-160转/分、25-27摄氏度；所述发酵培养后离心的条件为7500-8500转/分，离心10分钟。最佳条件为所述振荡培养的条件均为150转/分、26摄氏度；所述发酵罐中的发酵培养液含量为甜菜液400. 0g、七水硫酸镁4. 0g、磷酸二氢钾40. Og ;所述发酵的条件为溶氧100%，搅拌速度为350转/分，发酵温度26摄氏度，发酵时间48小时，pH 7. 0-7. 2 ；所述发酵培养后离心的条件为8000转/分离心10分钟；所述可溶性淀粉为土豆淀粉。
再者，本发明还提供了所述的基因工程菌菌株棘孢木mTrichodenmasperellum) GY20及所制得的膏状生防制剂在防治黄瓜枯萎病中的应用。本发明用于防治黄瓜枯萎病的含基因工程菌菌株棘孢木霉(Trichodermaasperellum^ GY20的膏状生防制剂与现有的“绿色木霉”膏状生防制剂相比，具有以下优
占-
^ \\\ ·
1、本发明膏状生防制剂由活性组分与辅料组成，活性组分为棘孢木霉(Trich ο dermaasperellum)GY20菌丝与厚垣孢子,其厚垣孢子分散在木霉菌丝中,其制备成的膏状生防制剂产品质量稳定，可室温保存18个月，冷藏条件下保存3年；
2、本发明膏状生防制剂对黄瓜枯萎病有良好防效温室试验结果表明，GY20对黄瓜枯 萎病的防治效果均可达90%以上，显著高于“绿色木霉”绿色木霉”膏状生防制剂对黄瓜枯萎病的防治效果58. 40% ；
3、无公害本发明棘孢木霉(TricAoofezmaGY20可安全释放的真菌,故不会因农药的使用带来的一系列环境负效应，同时含该木霉的膏状生防制剂的使用极大的减少了黄瓜生产中化学农药的施用量，不会产生任何废水废气废渣，为黄瓜无公害生物防治提供可靠保证，造福于现代高效农业；
4、成本较低本发明棘孢木霉(TricAoofezmaGY20及其膏状生防制剂生产成本很低，企业获取的利润空间极大。。
具体实施例方式本发明的生物材料棘孢木霉(Trichoderma asperellum ) GY20的保藏日期为2011年5月25日，保藏单位全称为中国微生物生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为北京.中国科学院微生物研究所，其保藏编号为CGMCC NO :4899。所述棘孢木霉GY20具有如下特征25°C黑暗条件下培养4d，菌落直径53-55mm，菌丝体白色，絮状，茂盛；分生孢子结构大量产生，产孢区均匀分布，灰绿色；瓶梗式产孢，分生孢子椭圆形、近球形，表面有细刺。木霉菌对多种重要植物病原真菌有作用，如腐霉菌、轮枝菌、镰刀菌、长孺孢菌、交链孢菌、丝核菌、葡萄孢菌等。一种黄瓜枯萎病的膏状生防制剂，其中，所述制剂的活性成分为权利要求1所述棘抱木霉(Trichoderma asperellum ) GY20的菌丝与厚垣抱子。其中，所述菌丝与厚垣孢子的比例，由以下培养方法决定
将在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上长好的棘孢木霉(斤icAoofe/ma asperellum) GY20孢子用无菌水洗下，调节成孢子含量为IO5孢子/mL的接种液，按5% (V/V)接种量接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，振荡培养48小时；将上步所得培养液以10% (V/V)的接种量再次接种于马铃薯葡萄液体培养基中振荡培养48小时进一步扩增后，再将所得培养液以10%(V/V)的接种量再次接种于含20L发酵培养液的发酵罐中进行发酵培养后离心得到。其中，所述发酵罐中的发酵培养液含量为甜菜液400.(^、七水硫酸镁4.(^、磷酸二氢钾40. Og ;所述发酵的条件为溶氧100%，搅拌速度为350转/分，发酵温度26摄氏度，发酵时间48小时，pH 7. 0-7. 2 ;所述振荡培养的条件均为150转/分、26摄氏度；所述发酵培养后离心的条件为8000转/分离心10分钟。进一步地，所述膏状生防制剂的PH值为3. (Γ4. 0，优选PH值为3. 5。
进一步地，所述膏状生防制剂还包括O. 00Γ0. 05%的铜离子抑制剂，优选所述膏状生防制剂包括O. ΟΟΓΟ. 05%的铜离子抑制剂，优选O. 01%的MDA-5。进一步地，所述膏状生防制剂还包括5 10%的可溶性淀粉。优选地，所述膏状生防制剂还包括5 10%的可溶性淀粉。优选地，所述可溶性淀粉为8%的土豆淀粉。另一方面，本发明保护一种制备上述所述的黄瓜枯萎病的膏状生防制剂的方法，其中，所述方法包括
I)将在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上长好的棘孢木霉(Trichoderma asperellum) GY20孢子用无菌水洗下，调节成孢子含量为IO5孢子/mL的接种液，按5% (V/V)接种量接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，振荡培养48小时；将上步所得培养液以10% (V/V)的接种量再次接种于马铃薯葡萄液体培养基中振荡培养48小 时进一步扩增后，再将所得培养液以10%(V/V)的接种量再次接种于含20L发酵培养液的发酵罐中进行发酵培养后离心得到。2)调节pH值将上述菌丝与厚垣孢子混合体的pH值调节为3. (Γ4. O ；
3)制得膏状生防制剂向所述步骤2)得到的混合体中加入0. 00Γ0. 05%的铜离子抑制剂，最后加入5 10%的可溶性淀粉，搅拌均匀即可。其中，所述振荡培养的条件均为150转/分、26摄氏度；所述发酵罐中的发酵培养液含量为甜菜液400. 0g、七水硫酸镁4. 0g、磷酸二氢钾40. Og ;所述发酵的条件为溶氧100%，搅拌速度为350转/分，发酵温度26摄氏度，发酵时间48小时，pH 7. 0-7. 2 ;所述发酵培养后离心的条件为8000转/分离心10分钟；所述可溶性淀粉为土豆淀粉。具体地，本发明的防治黄瓜枯萎病菌株GY20制备的膏状生防制剂，其制备方法包括以下步骤
(A)菌液的获得
用无菌接种刀挑取事先在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上培养好的GY20孢子，用无菌水洗下调节成孢子含量为IO5孢子/mL的接种液，按5% (V/V)接种量接种于装有200mL马铃薯葡萄液体培养基(PD)的容积为750 mL的三角瓶中，于26 °C >150 rpm/min条件下振荡培养48 h，将上步所得培养液200 mL等份接种于4个装有500mL H)培养液的容积为2000 mL的三角瓶中，150 rpm、26°C条件下振荡培养48 h ;把所得的2000mL培养液接种于装有20L培养液的容积为30L的发酵罐(镇江东方GUS-30)，20L发酵培养液含量为甜菜液400. 0g、七水硫酸镁4. 0g、磷酸二氢钾40. 0g，设置发酵条件为溶氧100%，搅拌速度为350rpm，发酵温度26 °C，发酵时间48 h，pH 7· 0_7· 2。(B)膏状生防制剂加工工艺
将发酵好的发酵液按如下方法加工成膏状生防制剂先将发酵液在8000rpm/min条件下离心lOmin，得菌丝及厚垣孢子混合体，用盐酸调节pH至3. 0^4. O,并加入0. 00Γ0. 05%的铜离子抑制剂，最后加入5 10%的可溶性淀粉，搅拌均匀即制成了膏状生防制剂。优选地，上述步骤(B)中用盐酸调节菌丝及厚垣孢子混合体pH至3. (Γ4. O后，力口入0. 001%的铜离子抑制剂，最后加入8%的可溶性淀粉。再一方面，本发明保护的是所述的基因工程菌菌株棘孢木霉(Trichooferfflaasperellum) GY20及上述任一所述的膏状生防制剂在防治黄瓜枯萎病中的应用。根据以下实施例，可以更好的理解本发明。实施案例中所描述的具体的物料配比，工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1膏状生防制剂及其制备方法 膏状生防制剂的组分为
活性组分棘孢木霉(Trichoderma asperellum ) GY20菌丝及厚垣孢子混合体94. 999%
铜离子抑制剂MDA-5 O. 001%
土豆淀粉5%
PH值3
上述所述百分比为重量百分比。上述膏状生防制剂的制备方法包括以下步骤
(A)菌液的获得
用无菌接种刀挑取事先在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上培养好的GY20孢子，用无菌水洗下调节成孢子含量为IO5孢子/mL的接种液，按5% (V/V)接种量接种于装有200mL马铃薯葡萄液体培养基(PD)的容积为750 mL的三角瓶中，于26 °C >150 rpm/min条件下振荡培养48 h，将上步所得培养液200 mL等份接种于4个装有500mL PD培养液的容积为2000 mL的三角瓶中，150 rpm、26°C条件下振荡培养48 h ;把所得的2000mL培养液接种于装有20L培养液的容积为30L的发酵罐(镇江东方GUS-30)，20L发酵培养液含量为甜菜液400. 0g、七水硫酸镁4. 0g、磷酸二氢钾40. 0g，设置发酵条件为溶氧100%，搅拌速度为350rpm，发酵温度26 °C，发酵时间48 h，pH 7· 0_7· 2。(B)膏状生防制剂加工工艺
将发酵好的发酵液按如下方法加工成膏状生防制剂先将发酵液在8000rpm/min条件下离心lOmin，得菌丝及厚垣孢子混合体，用盐酸调节pH至3. O,并加入O. 001%的铜离子抑制剂，最后加入5%的可溶性淀粉，搅拌均匀即制成了膏状生防制剂。实施例2-3
按照实施例1的方法制备实施例2-3，不同之处如表I所示
表I实施例2-3制备方法
权利要求
1.一株基因工程菌菌株，其分类命名为棘孢木霉(TricAoiferffl3 asperellum) GY20, 其保藏编号为CGMCC NO :4899。
2.—种黄瓜枯萎病的膏状生防制剂，其特征在于，所述制剂的活性成分为权利要求1 所述棘抱木霉(asperellum) GY20的菌丝与厚垣抱子。
3.根据权利要求2所述的膏状生防制剂，其特征在于，所述菌丝与厚垣孢子的比例， 由以下培养方法决定将在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上长好的棘孢木霉(Trichoderma asperellum) GY20孢子用无菌水洗下，调节成孢子含量为IO5孢子/mL的接种液，按V/V 5%接种量接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，振荡培养48小时；将上步所得培养液以V/V 10%的接种量再次接种于马铃薯葡萄液体培养基中振荡培养48小时进一步扩增后，再将所得培养液以V/V 10% 的接种量再次接种于含20L发酵培养液的发酵罐中进行发酵培养后离心得到。
4.根据权利要求3所述的膏状生防制剂，其特征在于，所述发酵罐中的发酵培养液各组分的重量份含量为甜菜液380-420、七水硫酸镁3-5、磷酸二氢钾38-42 ;所述发酵的条件为溶氧100%，搅拌速度为300-400转/分，发酵温度25-27摄氏度，发酵时间48小时， pH 7. 0-7. 2 ;所述振荡培养的条件均为140-160转/分、25-27摄氏度；所述发酵培养后离心的条件为7500-8500转/分，离心10分钟。
5.根据权利要求4所述的膏状生防制剂，其特征在于，所述发酵罐中的发酵培养液含量为甜菜液400. 0g、七水硫酸镁4. 0g、磷酸二氢钾40. Og ;所述发酵的条件为溶氧100%， 搅拌速度为350转/分，发酵温度26摄氏度，发酵时间48小时，pH 7. 0-7. 2 ;所述振荡培养的条件均为150转/分、26摄氏度；所述发酵培养后离心的条件为8000转/分离心10分钟；所述膏状生防制剂还包括重量百分比O. OOfO. 05%的铜离子抑制剂。
6.根据权利要求2或5所述的膏状生防制剂，其特征在于，所述膏状生防制剂还包括重量百分比5 10%的可溶性淀粉；所述的铜离子抑制剂为MDA-5。
7.根据权利要求6所述的膏状生防制剂，其特征在于，所述可溶性淀粉为土豆淀粉。
8.一种制备权利要求2 7所述的黄瓜枯萎病的膏状生防制剂的方法，其特征在于，所述方法包括1)将在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上长好的棘孢木霉(Trichodermaasperellum) GY20 孢子用无菌水洗下，调节成孢子含量为IO5孢子/mL的接种液，按5% (V/V)接种量接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，振荡培养48小时；将上步所得培养液以10% (V/V)的接种量再次接种于马铃薯葡萄液体培养基中振荡培养48小时进一步扩增后，再将所得培养液以10% (V/V)的接种量再次接种于含20L发酵培养液的发酵罐中进行发酵培养后离心得到；2)调节pH值将上述菌丝与厚垣孢子混合体的pH值调节为3.(Γ4. O ；3)制得膏状生防制剂向所述步骤2)得到的混合体中加入O.00Γ0. 05%的铜离子抑制剂，最后加入5 10%的可溶性淀粉，搅拌均匀即可。
9.根据权利要求8所述的膏状生防制剂，其特征在于，所述振荡培养的条件均为150 转/分、26摄氏度；所述发酵罐中的发酵培养液含量为甜菜液400. 0g、七水硫酸镁4. 0g、 磷酸二氢钾40. Og;所述发酵的条件为溶氧100%，搅拌速度为350转/分，发酵温度26摄氏度，发酵时间48小时，pH 7. 0-7. 2 ;所述发酵培养后离心的条件为8000转/分离心10 分钟；所述可溶性淀粉为土豆淀粉。
10.权利要求1所述的基因工程菌菌株及权利要求2 7任一所述的膏状生防制剂在防治黄瓜枯萎病中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种黄瓜枯萎病的膏状生防制剂、制备方法、应用及其专用菌株。所述专用菌株分类命名为棘孢木霉(Trichodermaasperellum)GY20,其保藏编号为CGMCCNO4899。本发明膏状生防制剂的所述制剂的活性成分为上述所述棘孢木霉(Trichodermaasperellum)GY20的菌丝与厚垣孢子。本发明的膏状生防制剂最大的优点是产品质量稳定，可室温保存18个月，冷藏条件下保存3年，且对黄瓜枯萎病有良好防效，不产生任何废水废气废渣，利于环境保护。
文档编号A01N25/00GK103013839SQ20121054206
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月14日 优先权日2012年12月14日
发明者李楠, 张海军, 罗志会, 刘慕兰, 李惠 申请人:江苏耕耘化学有限公司