rd29启动子或其片段用于棉花中转基因的胁迫诱导型表达的用途
【专利摘要】在一个方面，本申请披露了一种嵌合基因，该嵌合基因包含（a）一个第一核酸序列，该第一核酸序列包含SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2的至少400个连续核苷酸或与其具有至少80%序列一致性的一个核酸序列，这些序列中的任一项赋予所述嵌合基因胁迫诱导性；（b）一个第二核酸序列，该第二核酸序列编码一种感兴趣的表达产物，该感兴趣的表达产物参与棉花植株对胁迫的响应；以及任选地（c）一个转录终止和聚腺苷酸化序列。在另一方面，本申请披露了一种棉花植株细胞，该棉花植株细胞包含（a）一种嵌合基因，该嵌合基因包含一个第一核酸序列，该第一核酸序列包含SEQ?ID?NO:1或SEQ?ID?NO:2的至少400个连续核苷酸或与其具有至少80序列一致性的一个核酸序列，这些序列中的任一项赋予所述嵌合基因胁迫诱导性；（b）一个第二核酸序列，该第二核酸序列编码一种感兴趣的表达产物；以及任选地（c）一个转录终止和聚腺苷酸化序列。另外，本申请披露了如在权利要求书中所表征的一种棉花植株、一种在胁迫条件下在棉花中表达转基因的方法、一种产生棉花植株的方法、一种检测转基因在胁迫条件下的表达的方法以及一种调节棉花植株对胁迫的抗性的方法。
【专利说明】rd29启动子或其片段用于棉花中转基因的胁迫诱导型表达的用途
[0001]在一个方面，本申请披露了一种嵌合基因，该嵌合基因包含(a) —个第一核酸序列，该第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的至少400个连续核苷酸或与其具有至少80%序列一致性的一个核酸序列，这些序列中的任一项赋予所述嵌合基因胁迫诱导性；(b) —个第二核酸序列，该第二核酸序列编码一种感兴趣的表达产物，该感兴趣的表达产物参与棉花植株对胁迫的响应；以及任选地(c) 一个转录终止和聚腺苷酸化序列。在另一方面，本申请披露了一种棉花植株细胞，该棉花植株细胞包含(a) —种嵌合基因，该嵌合基因包含一个第一核酸序列，该第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的至少400个连续核苷酸或与其具有至少80%序列一致性的一个核酸序列，这些序列中的任一项赋予所述嵌合基因胁迫诱导性；(b) —个第二核酸序列，该第二核酸序列编码一种感兴趣的表达产物；以及任选地(c)一个转录终止和聚腺苷酸化序列。另外，本申请披露了如在权利要求书中所表征的一种棉花植株、一种在胁迫条件下在棉花中表达转基因的方法、一种产生棉花植株的方法、一种检测转基因在胁迫条件下的表达的方法以及一种调节棉花植株对胁迫的抗性的方法。
[0002]在本说明书中，引用了包括专利申请和制造商手册的多种文献。这些文献的披露虽然不被视为与本发明的专利性相关但通过引用以其全文结合在此。更确切地说，所有参考的文献均在相同程度上通过引用结合，就如同每一单独文献特别地并且独立地被指示通过引用结合一样。
[0003]近年来，全球变暖的现象和它对作物生产的影响已变成一个至关紧要的问题。在植物科学水平上解决这个问题几乎完全是一个处理植物胁迫的问题。国际农业和环境研究机构现在再次发现植物胁迫是全球变暖对地区和全球粮食生产的影响的一个主要组成部分。应对这些挑战的研究涉及在广泛发散的学科的学习，这些学科如大气科学、土壤科学、植物生理学、生物化学、遗传学、植物育种、分子生物学以及农业工程。
`[0004]非生物植物环境胁迫构成了对作物生产的一个主要限制。在世界范围内具有当代经济重要性的主要植物环境胁迫是包括干旱和洪水的水分胁迫、冷(低温和冷冻)、热、盐度、溃水、土壤矿物质缺乏、土壤矿物质毒性以及氧化胁迫。这些因素不是孤立的，而是相关的并且彼此影响。
[0005]脱落酸(ABA)是一种植物激素，它在许多植物发育过程(包括芽休眠)中起作用。此外，ABA介导植物中对水分胁迫、高盐胁迫、冷胁迫(曼斯菲尔德(Mansfield) 1987、Yamaguch1-Shinozaki 1993、Yamaguch1-Shinozaki 1994)以及植物病原体(势雄(Seo)和小柴(Koshiba)，2002)的反应的胁迫响应。ABA是一种倍半萜(15-碳)，它部分地通过甲羟戊酸途径产生于叶绿体和其他质体中。它部分地合成于叶绿体中，并且因此,生物合成主要发生于叶子中。ABA的产生因胁迫(如水分流失和冷冻温度)而增加。相信生物合成间接地通过产生类胡萝卜素而发生。
[0006]已知与脱落酸有关的生理响应包括了刺激气孔闭合、抑制茎生长、诱导种子中的储存蛋白合成以及抑制赤霉素对刺激α-淀粉酶从头合成的作用。[0007]不同植物之间的基础ABA水平可能显著不同。举例来说，未受胁迫的拟南芥叶子中的ABA的基础浓度是每克鲜重2到3ng (洛佩兹-卡博内尔(Lopez-Carbonell)和郝勒吉(Jdiuregui), 2005)。在水分胁迫条件下，ABA浓度达到每克鲜重10到21ng。另一方面，在未受胁迫的棉花中，叶子中的ABA浓度在每克鲜重145到2490ng之间变化(埃克森(Ackerson), 1982)。
[0008]参与响应于非生物胁迫的基因以及介导胁迫响应的启动子在本领域中已有描述。
[0009]早在1994年,Yamaguch1-Shinozaki和Shinozaki已描述并且分析了调节拟南芥中的rd29a基因的一种启动子，这种启动子响应于脱水、低温、高盐或用外源性脱落酸处理而被诱导。
[0010]当今农业实践和研究中的一项主要挑战是如何以经济并且环境可持续的方法处理植物环境胁迫。鉴于世界上已经存在的暴露于非生物胁迫条件的地区和正在进行的气候变化，提供赋予对至少一个种类非生物胁迫抗性的转基因植株仍是一个主要目标，以便在世界上暴露于这类非生物胁迫的地区中也实现令人满意的营养状况。
[0011]因此，在一个实例中，本申请披露了一种嵌合基因，该嵌合基因包含(a) —个第一核酸序列，该第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的至少400个连续核苷酸或与其具有至少80%序列一致性的一个核酸序列，这些序列中的任一项赋予所述嵌合基因胁迫诱导性；(b) —个第二核酸序列，该第二核酸序列编码一种感兴趣的表达产物，该感兴趣的表达产物参与棉花植株对胁迫的响应；以及任选地(c) 一个转录终止和聚腺苷酸化序列。
[0012]除非另外指明，否则下文针对在此所披露的嵌合基因所描述的实施例也适用于在此所披露的其他方面的对应实施例。
[0013]如在此所用的术语“包含”应解释为规定所陈述的特征、完整的事物、步骤或组分的存在是指但并不排除存在或增加一种或多种特征、完整的事物、步骤或组分或其群组。因此，例如包含一个核苷酸或氨基酸序列的一种核酸或蛋白质可以包含比实际引用的序列更多的核苷酸或氨基酸，即，被包埋在一个更大的核酸或蛋白质中。包含在功能上或结构上被定义的一个DNA区的一种嵌合基因可以包含额外的DNA区等。然而，在本披露的情形下，术语“包含”也包括“由……组成”。
[0014]一种嵌合基因是一种人造基因，它由不相关的基因或其他核酸序列的可操作连接的片段构筑。换句话说，“嵌合基因”表示并非正常见于植物物种中的一种基因或指代基因的启动子或一个或多个其他调节区与所转录的核酸的一部分或全部在自然界中并不相关(即，相对于所转录的核酸为异源的)的任何基因。更具体地说，一种嵌合基因是一种人造(即，非天然存在的)基因，这种基因通过以下方式产生:将包含SEQ ID N0:1或SEQ ID NO:2的至少400个连续核苷酸的第一核酸序列或与其具有至少80%序列一致性的一个核酸序列(这些序列中的任一项赋予所述嵌合基因胁迫诱导性)与并非天然地可操作地连接于所述核酸序列的编码一种感兴趣的表达产物的一个第二核酸序列可操作地连接。天然地可操作地连接于所述第一核酸序列的这一核酸序列是rd29A基因的编码序列。
[0015]术语“异源”是指来源于不同来源的两种或更多种核酸或蛋白质序列之间的关系。举例来说，一个启动子相对于一个可操作地连接的核酸序列(如一个编码序列)在这种组合并非正常见于自然界中时是异源的。另外，一个特定序列相对于它插入的细胞或有机体可以是“异源”的(即，在那个特定细胞或有机体中并非天然存在)。举例来说，在此所披露的嵌合基因是一种异源核酸。
[0016]核酸可以是单链或双链的DNA或RNA。核酸可以是化学合成的或通过体外或甚至体内生物表达产生。
[0017]核酸可以使用受适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和一台常规的DNA/RNA合成器以化学方式合成。RNA合成试剂的供应商是普罗利高公司(Pix)Iig0 ;德国汉堡(Hamburg, Germany))、达尔马康研究公司(Dharmacon Research ;美国科罗拉多州拉斐特(Lafayette, CO, USA))、皮尔斯化学品公司(Pierce Chemical ；美国伊利诺伊州罗克福德的佩尔生物科学公司成员(part of Perbio Science, Rockford, IL, USA))、哥伦研究公司(Glen Research ;美国弗吉尼亚州斯特林(Sterling, VA, USA))、凯姆基因公司(ChemGenes ;美国马萨诸塞州亚什兰(Ashland, MA, USA))以及克鲁凯姆公司(Cruachem ;英国格拉斯哥(Glasgow, UK))。
[0018]与本披露的嵌合基因结合，DNA包括cDNA和基因组DNA。
[0019]所述第一核酸序列赋予在此所披露的嵌合基因胁迫诱导性。同样地，所述第一核酸序列赋予在下文中进一步描述的编码一种感兴趣的表达产物的第二核酸序列的表达响应于非生物胁迫条件的诱导性。换句话说，所述嵌合基因的表达在包含所述嵌合基因的一种植株暴露于胁迫时被诱导。在这点上，胁迫包括非生物胁迫，如水分胁迫、干旱胁迫、冷胁迫、高盐胁迫以及施用ΑΒΑ。
[0020]选择第一核酸序列的长度以及它在SEQ ID NO:1或SEQ ID Ν0:2内的位置，使得它足够长并且被定位以使得包含它的嵌合基因的表达在暴露于胁迫时被诱导。评估一个第一核酸序列(它在本申请中代表一个启动子序列)在暴露于胁迫时是否能够诱导将它包含在内的嵌合基因(或具体地说，与它可操作地连接的核酸序列)的表达的方法是熟练的人员所已知的。举例来说，可以执行报告基因研究，以便评估所述第一核酸在胁迫条件下的诱导功能。这包括使所述第一核酸序列可操作地连接于一个报告基因(如GUS ( β -葡萄糖醛酸酶)或GFP (绿色荧光蛋白))，将所`得核酸构建体或嵌合基因转化到一种植株或植株细胞(在此情况下为一种棉花植株)中，并且评估在植株或植株细胞暴露于胁迫(如水分胁迫(如干旱胁迫)、冷胁迫、高盐胁迫或暴露于ABA)时与不包含所述构建体的一种植株或植株细胞相比所述报告基因的表达的诱导。
[0021]因此，在一些实例中，赋予胁迫诱导性的所述第一核酸序列可以包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少400、至少450、至少500、至少550、至少600、至少650、至少700、至少800或至少900个连续核苷酸。在另一个实例中，所述第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID Ν0:2的核苷酸序列。在又另一个实例中，所述第一核酸序列由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2 组成。
[0022]在一个方面，提供了能够赋予一种嵌合基因胁迫诱导性的启动子的核酸序列，具体地说包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性的一个核苷酸序列的核酸序列。此类核酸序列还包括以人造方式获得的核酸序列，如例如通过使用SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的定点诱变而产生的那些核酸序列。总体而言，在此所披露的核苷酸序列变异体可以与SEQ ID NO:1或SEQ ID Ν0:2的核酸序列具有至少70%、如72%、74%、76%、78%、至少80%、例如81%到84%、至少85%、例如86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97% 到 98% 以及 99% 序列一致性。序列一致性是基于更短核苷酸序列计算的。在此所披露的核酸序列也可以包括但不限于序列的缺失、单点或多点突变、在一个特定限制酶识别位点处的改变、功能元件的添加或者可以增强或以其他方式改变启动子表达的分子修饰的其他手段，只要基本上保留胁迫诱导性即可。用于获得此类衍生物的技术在本领域中是熟知的(参见例如J.F.萨布鲁克(J.F.Sambrook),D.W.拉塞尔(D.W.Russell)以及N.厄温(N.1rwin)，2000)。举例来说，本领域的普通技术人员可以在披露在此的这些启动子中对这些功能元件进行定界并且使任何非必要元件缺失。功能元件可以被修饰或组合以增加本发明的这些序列用于任何特定应用的效用和表达。本领域的普通技术人员对于描述用于构筑、操作以及分离大分子(例如DNA分子、质粒等)以及重组有机体的产生以及DNA分子的筛选和分离的特定条件和程序的标准来源材料是熟悉的。
[0023]如上文所描述的具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的至少400个连续核苷酸的启动子序列和它们的变异体可以例如被改变以包含例如“增强子DNA”，从而有助于提高基因表达。如本领域中所熟知的，某些DNA元件可以用于增强DNA的转录。这些增强子经常被发现于在真核细胞中起作用的一个启动子的转录起始的5’处，但是经常可以被插入编码序列的上游(5’)或下游(3’)。在一些实例中，这些增强子DNA元件是内含子。在这些内含子中，作为增强子DNA有用的是来自水稻肌动蛋白I基因的5’内含子(参见US5641876)、水稻肌动蛋白2基因、拟南芥组蛋白4内含子、玉米乙醇脱氢酶基因、玉米热激蛋白70基因(参见US5593874)、玉米皱缩I基因、马铃薯(Solanum tuberosum)的光敏I基因以及矮牵牛(Petunia hybrida)的热激蛋白70基因(参见US5659122)。因此，如在此所涵盖，一个启动子或启动子区包括通过插入或缺失调节区、使启动子经受随机或定点诱变等而获得的启动子的变异体。一个启动子的活性或强度可以根据它产生的RNA的量或一种细胞或组织中蛋白质累积的量相对于已预先评估转录活性的如上文所描述的一个启动子来测量。
[0024]如在此所用的术语“序列一致性百分比”是指经最佳比对的DNA的一个窗口的两个区段之间的一致的核苷酸的百分比。用于比对一个比较窗口的序列的最佳比对为本领域的普通技术人员所熟知，并且可以通过如史密斯(Smith)和沃特曼(Waterman)的局部同源算法(沃特曼M.S.,伦敦的查普曼和霍尔出版社(Chapman&Hall.London), 1995)、尼德曼(Needleman)和翁施(W unsch) (1970)的同源比对算法、皮尔森(Pearson)和利普曼(Lipman) (1988)的相似性搜索方法的工具,并且优选地通过这些算法的计算机化的实施(如可作为GCG (注册商标)，威斯康星程序包(Wisconsin Package ;来自加利福尼亚州圣地亚哥的艾可塞利斯公司(Accelrys Inc., San Diego, Calif.)的注册商标)的一部分获得的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA)来执行。一个测试序列与一个参考序列的比对的区段的“一致性分数”是由两个比对的序列共有的相同组分数除以参考序列区段中的总组分数，即，该全部参考序列或该参考序列的一个更小定义的部分。序列一致性百分数以一致性分数乘以100表示。一个或多个DNA序列可以与一个全长DNA序列或其一部分或与一个更长DNA序列比较。
[0025]本发明仅涵盖第一核酸，这些第一核酸具有具备上文所指示程度的序列一致性的核苷酸序列，它们赋予在此所描述的嵌合基因胁迫诱导性。
[0026]在一个实例中，如上文所描述的第一核酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的3’末端。所述3’端包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的至少最后100个碱基、至少最后200个喊基、至少最后300个喊基或至少最后400个喊基。
[0027]在另一个实例中，第一核酸序列包含选自以下的已知响应元件中的至少一项:来自SEQ ID NO:1中的位置796到803和SEQ ID NO: 2中的位置797到804的ABA响应元件(ABRE)以及两个干旱响应元件(来自SEQ ID NO:1中的位置637到645和SEQ ID NO: 2中的位置637到645的DREl以及来自SEQ ID NO:1中的位置694到702和SEQ ID NO: 2中的位置694到702的DRE2)。在又另一个实例中，所述第一核酸序列包含以上响应元件中的至少两项，如ABRE和DREl、ABRE和DRE2或DREl和DRE2。所述第一核酸也可以包含所有三种响应元件。在另一个实例中，包含至少一种、至少两种或所有三种响应元件的一个第一核酸序列的任何以上实例另外包含如刚才上文所描述的SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:2的3’末端。
[0028]一个表达产物表示由编码这种产物的核酸、DNA或RNA的转录和任选地翻译而产生的中间物或最终产物。在转录过程中，在调节区控制下的一个DNA序列(特别是启动子)被转录成一个RNA分子。一个RNA分子可以自身形成一种表达产物并且接着例如能够与另一个核酸或蛋白质相互作用。可替代地，一个RNA分子在它能够被翻译成一种肽或蛋白质时可以是一种中间产物。当一个RNA是一种基因的表达的最终产物并且能够与另一个核酸或蛋白质相互作用时，该基因被认为编码作为表达产物的该RNA分子。RNA表达产物的实例包括抑制性RNA，如正义RNA (共抑制)、反义RNA、核糖酶、miRNA或siRNA、mRNA、rRNA以及tRNA。当一种基因的表达的最终产物是一种蛋白质或肽时，该基因被认为编码作为表达产物的该蛋白质。
[0029]术语“参与棉花植株对胁迫的响应”与感兴趣的表达产物结合表示在天然地包含如上文所描述的编码一种表达产物的一种基因的一种植株暴露于胁迫条件时，所述基因的表达开启或增加或消除或减少，表明它们在植株对胁迫的响应中的作用。评估一种表达产物是否也参与棉花植株对胁迫的响应的方法是本领域中已 知的。举例来说，可以使用上文另外描述的报告基因检验，并且报告基因可以可操作地连接于启动子，该启动子天然可操作地连接于编码该表达产物的核酸序列。在转化到棉花植株或棉花植株细胞中之后，可以评估该报告基因的表达。如果与可操作地连接于一个组成性活性启动子的如控制一个管家基因的报告基因相比，在植株或植株细胞暴露于胁迫之后观测到在所述报告基因的表达方面的一个差异，那么这指示了所述启动子以及相应地编码该表达产物的核酸的表达是可由胁迫诱导的。在这点上，应注意，这类产物的表达不需要由所有种类的胁迫诱导。相反地，它可由适用于如本申请中其他地方所描述的植株的至少一个种类的胁迫诱导即足够。另一个实例包括例如通过施加微阵列对参与胁迫响应的基因进行转录组分析。
[0030]例如使用包含可操作地连接于一个容易评分的标志物(如在此进一步解释的一种β -葡萄糖醛酸酶(GUS)报告基因)的启动子序列的一个启动子-报告子构建体，本领域的普通技术人员可以对一个启动子序列或一个功能启动子片段的启动子活性的确认进行测定。在此描述的所鉴别或产生的启动子的片段或变异体赋予将它们包含在内的嵌合基因胁迫诱导性的能力可以方便地通过以下方式测试:使此类核酸序列可操作地连接于编码一种容易评分的标志物(例如一种葡萄糖醛酸酶基因)的一个核苷酸序列，将这一嵌合基因引入一种植株中并且分析与不暴露于胁迫的植株中该标志物的表达模式相比在该植株暴露于胁迫时该标志物的表达模式。一种标志物(或报告基因)的其他候选物是氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、β -半乳糖苷酶(β -GAL)以及具有荧光或磷光性质的蛋白质(如来自水母(Aequora Victoria)的绿色荧光蛋白(GFP)或荧光素酶)。为了界定一个最小启动子，通过本领域所熟知的重组DNA技术使代表启动子的一个核酸序列可操作地连接于一种标志物(报告子)基因的编码序列。报告基因可操作地连接于启动子的下游，使得在启动子处引发的转录通过报告基因进行。包含在启动子控制下的报告基因的表达盒可以通过在本领域中所熟知并且在本申请中其他地方所描述的转化技术而引入一个适当细胞类型中。为了检验报告子蛋白，制备细胞溶解物并且针对报告子蛋白执行本领域中所熟知的适当检验。举例来说，如果CAT是所选择的报告基因，那么将来自用包含在研究中的一个启动子控制下的CAT的构建体转染的细胞的溶解物与同位素标记的氯霉素和乙酰基-辅酶A(乙酰基-CoA)混合。该CAT酶将乙酰基从乙酰基-CoA转移到氯霉素的2-或3-位上。通过使乙酰化的氯霉素与未反应的材料分离的薄层色谱法监测反应。接着，通过放射自显影法使反应产物显影。酶活性水平对应于所制备的酶的量，这又揭露了启动子或其片段或变异体在植株的胁迫暴露时的表达水平。也可以将这一表达水平与其他启动子相比，以测定研究中的启动子的相对强度。一旦确认了活性和功能性，就可以使用额外的突变和/或缺失分析来测定例如为引发转录所需的最小区域和/或序列。因此，序列可以在启动子区的5’末端处和/或在启动子区的3’末端处或在启动子序列内缺失和/或可以引入核苷酸取代。接着，这些构建体再次被引入细胞中并且测定它们的活性和/或功能性。
[0031]代替测 量一个报告子酶的活性，也可以通过测量所产生的RNA的水平来测定转录启动子活性(和功能性)。可以在单一时间点或在多个时间点测量这一 RNA (如mRNA)的水平，并且像这样，成倍增加可以是平均成倍增加或从以实验方式测量的值获得的一个外推值。由于它是水平的比较，所以可以使用测量mRNA水平的任何方法。在一个实例中，将在暴露于胁迫的一种植株的至少一种组织中的表达与在不暴露于胁迫的一种植株的至少一种组织中的表达比较。在另一个实例中，比较多种组织或器官。如在此所使用，植株器官的实例是种子、叶、根等，而组织的实例是叶原基、茎尖、维管组织等。一个启动子的活性或强度可以相对于mRNA或蛋白质的总量根据它具体产生的mRNA或蛋白质累积的量来测量。作为替代方案，一个启动子的活性或强度可以相对于一个充分表征的启动子(它的转录活性已被事先评估)来表示。
[0032]在本披露的范围内，也可以使用与上文所描述的第一和第二核酸序列组合其他调节序列，这些调节序列位于包含一个启动子的所述第一核酸序列与包含表达产物的编码序列的所述第二核酸序列之间。此类调节序列的非限制性实例包括转录激活子(“增强子”)，例如申请W087/07644中所描述的烟草花叶病毒(TMV)或由卡林顿(Carrington)和弗雷德(Freed) 1990，病毒学杂志(J.Virol.> 64:1590-1597描述的烟草蚀纹病毒(TEV)的翻译激活子或如本申请中其他地方所描述的内含子。其他适合的调节序列包括多个5’UTR。如在此所使用，一个5’ UTR (也称为前导序列)是一个信使RNA (mRNA)的一个特定区域，该特定区域定位于转录起始位点与编码区的起始密码子之间。它涉及mRNA稳定性和翻译效率。举例来说，可以利用35S转录起始位点的一个矮牵牛叶绿素a/b结合蛋白基因下游的5’非翻译前导子来增加报告基因表达的稳定状态水平(哈普斯特尔(Harpster)等人，1988，分子与普通遗传学杂志(Mol Gen Genet.)212 (I): 182-90)。W095/006742描述了使用来源于编码热激蛋白的基因的5’非翻译前导子序列来增加转基因表达。[0033]嵌合基因还可以包含在一种植株细胞(特别是一种棉花植株细胞)中可操作的一个转录终止或聚腺苷酸化序列。作为转录终止或聚腺苷酸化序列，可以使用具有以下来源的任何相对应的序列:细菌来源,如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的nos终止子；病毒来源，如CaMV35S终止子；或植株来源，如公开的专利申请EP0633317A1中所描述的一种组蛋白终止子。
[0034]SEQ ID NO:1的核苷酸序列代表具有一个缺失的rd29A基因的启动子，而SEQ ID勵:2代表不具有修饰的 294基因的启动子&(1294在此以下也称为 29)。该启动子包含至少两个顺式作用元件，这两个顺式作用元件中的一项参与对脱水的ABA相关的响应(ABA响应元件ABRE)，而另一项通过渗透势的改变而被诱导。
[0035]已展示对应于缺失一个碱基对的rd29启动子的一个核酸序列SEQ ID NO:1足以将棉花叶子中可操作地连接的基因的转录激活。
[0036]在转化到特定植株中并且所述植株随后暴露于不同类型的非生物胁迫时，包含与一种异源基因可操作地连接的rd29启动子的一种嵌合基因可以被表达。这可以展示于转基因拟南芥、烟草(Yamaguch1-Shinozaki和Shinozaki, 1992,分子与普通遗传学杂志，第331-340页)、马铃薯(贝楠(Behnam)等人，2007，植物细胞报告(Plant Cell Rep)；第1275-1282页)、菊花(洪(Hong)等人，2006，中国科学C辑生命科学(Sci China C LifeSci)，第436-45页)以及小麦(佩莱格里内斯基(Pellegrineschi)等人，2004，基因组(Genome),第 493-500 页)中。
[0037]将可操作地连接于报告基因⑶S的另一个启动子(ABA响应性稻米启动子rabl6A)转化到烟草中，在烟草中甚至在用ABA处理之后在营养组织中仍不可以检测到启动子活性。
[0038]存在转移到异源或(当偶合到一个转基因上时)甚至同源植株系统中的启动子并非必需产生如在它们的天然背景中发现的它们的功能和表达特征曲线并且可操作地连接于它们的天然基因的实例。举例来说，已显示来自番茄的属于Asr家族的一种ABA响应性启动子在番茄中在它的天然背景中具有功能性并且可由ABA诱导。然而，当偶合到GUS上并且转化到马铃薯中时，诱导性消除。另一方面，在番木瓜和烟草中均可以观测到ABA可诱导的表达。出人意料地，与在它的天然基因环境中的启动子不同，在番茄中转化的Asr-GUS构建体不再可被ABA诱导。因此，响应于胁迫条件(特别是由ABA介导的胁迫条件)的异源启动子的行为是不可预测的。换句话说，在一种植株中具有功能性的一个ABA响应性启动子在一个转基因植株中未必发挥这种功能。
[0039]除此以外，ABA在一些植株中的丰富浓度可能引起一个ABA响应性启动子的组成性诱导，由此防止一种胁迫特异性响应。
[0040]在未受胁迫的拟南芥叶子中ABA的基础浓度是每克鲜重2_3ng (洛佩兹-卡博内尔和郝勒吉，2005)。在干旱胁迫条件下，ABA浓度达到每克鲜重(f.w.) 10-21ng并且激活rd29a基因的启动子(rd29启动子)。然而，在未受胁迫的棉花植株中，叶子中的ABA浓度已在每克f.w.145到2490ng之间变化(埃克森，1982)。棉花中的这个浓度范围将预期当在棉花中引入拟南芥rd29启动子时永久地激活该启动子。因此，熟练的人员将不考虑将rd29拟南芥启动子用于棉花中的干旱可诱导的激活。
[0041]诸位发明人使用在包含一个ABA响应元件(ABRE)以及两个干旱响应元件DREl和DRE2的拟南芥rd29启动子控制下的GUS报告子产生转基因棉花植株。在本发明过程中，出人意料地发现这个启动子区在水分胁迫条件下触发GUS表达，尽管在未受胁迫的棉花植株的叶子中存在高ABA浓度。出人意料地，尽管在棉花叶子中ABA的内源性水平高，但rd29启动子的活性仅在干旱胁迫之后被诱导并且在再浇水之后返回到零。
[0042]此外，产生包含一种嵌合基因的棉花植株，该嵌合基因包含PNCl基因、NMAl基因或编码针对PARPl的一种微RNA的一个核酸作为一个第二核酸，这些棉花植株生长良好并且能育，与包含在rd29的控制下的包含CBF3/CREB1A编码序列作为第二核酸的一种嵌合基因的植株(艾伦(Alien)，2010)形成对照。在暴露于干旱胁迫的植株中，在rd29启动子控制下的PNCl表达也得以增加。
[0043]下文将描述上文所描述的嵌合基因以及在此所披露的不同的其他方面的效用。举例来说，本申请的披露可以用于调节棉花植株对胁迫的响应，例如以便在棉花植株在它们的生存期中暴露于一个或多个种类的非生物胁迫至少一次的地区中促进种植棉花植株。
[0044]在另一方面，本申请披露了一种棉花植株细胞，该棉花植株细胞包含一种嵌合基因，该嵌合基因包含(a)—个第一核酸序列，该第一核酸序列包含SEQ ID N0:1或SEQ IDNO: 2的至少400个连续核苷酸或与其具有至少80%序列一致性的一个核酸序列，这些序列中的任一项赋予所述嵌合基因胁迫诱导性；(b)编码一种感兴趣的表达产物的一个第二核酸序列；以及任选地(c) 一个转录终止和聚腺苷酸化序列。
[0045]—种棉花植株细胞可以是基本上包含为界定一种棉花植株所必需的基因信息的任何细胞，除在此所披露的嵌合基因之外，该基因信息还可以补充有一种或多种另外的转基因。细胞可以来源于形成一种棉花植株的不同的器官和/或组织，包括但不限于果实、种子、胚、生殖组织、分生组织区域、愈伤组织、叶子、根、茎、花、维管组织、配子体、孢子体、花粉以及花粉粒。
[0046]如在此所使用的“棉花”或“棉花植株”包括陆地棉(Gossypium hirsutum)、海岛棉(Gossypium barbad ense)、木本棉(Gossypium arboreum)以及草本棉(Gossypiumherbaceum)或来自此类种与其他种杂交或此类种之间杂交的子代。
[0047]在一个方面,如上文所描述的棉花植株细胞包含如在此所描述的嵌合基因。
[0048]在一个方面，本发明的棉花植株细胞可以再生成一个能成活的并且能育的棉花植株(参见表I)。此外，下文进一步描述的棉花植株是能成活的并且能育的。换句话说，包含本发明的嵌合基因的植株与野生型植株相比显示出正常活力和能育性。
[0049]尽管根据本发明的某些植株细胞可以能够再生成完整植株，但在一些实施例中，所述植株细胞不能进一步发育或再生成一个完整植株。
[0050]在描述在此的嵌合基因的一个实例中，所述感兴趣的表达产物是(i) 一种蛋白质或肽，或(ii) 一种RNA分子，它能够调节所述棉花植株中所包含的一种基因的表达。所述蛋白质或肽或所述棉花植株中所包含的所述基因优选地参与棉花植株对胁迫的响应。一种棉花植株中所包含的一种基因对该棉花植株来说可以是内源性的或已引入所述棉花植株中。后者尤其适用于对棉花植株来说不是内源性的目标表达产物或来自其他有机体的在棉花植株中具内源性但参与棉花植株对胁迫的响应的表达产物的同源物。
[0051]在如在此所描述的棉花植株细胞的一个实例中，所述感兴趣的表达产物是(i) 一种蛋白质或肽，它任选地参与棉花植株对胁迫的响应，或(ii) 一种RNA分子，它能够调节所述棉花植株中所包含的一种基因的表达，其中任选地所述基因参与棉花植株对胁迫的响应。
[0052]如在此所使用的术语“蛋白质”描述了由超过30个氨基酸组成的分子的群组，而术语“肽”描述了由至多30个氨基酸组成的分子。蛋白质和肽可以进一步形成二聚体、三聚体以及更高的寡聚物，即，由一个以上(聚)肽分子组成。形成此类二聚体、三聚体等的蛋白质或肽分子可以是相同或不同的。因此，相对应的更高级结构被称为同源二聚体或异源二聚体、同源三聚体或异源三聚体等。术语“蛋白质”和“肽”也指天然修饰的蛋白质或肽，其中修饰是例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化等来实现的。此类修饰在本领域中是众所周知的。
[0053]适合作为表达产物的任选地参与棉花植株对胁迫的响应的示例性蛋白质和核酸(如基因)包括:
[0054]在NAD+生物合成的补救路径中起作用的NPTl (烟酸磷酸核糖转移酶)和编码它的基因。该蛋白质为rDNA和端粒处的沉默所需并且在交配型基因座处的沉默中具有作用。关于在本发明中适合的所有其他基因，可以用于本发明中的编码NPTl的序列可以来自动物、植株或真菌来源。编码NPTl的示例性核酸序列编码包括具有以下登录号的那些氨基酸序列的氛基酸序列:CAA85352 (酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae))、XP_448893 (光滑念珠菌(Candida glabrata))、XP_453357 (乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis))、NP_983562 (棉假囊酵母(Eremothecium gossypii))> XP_462577 (汉森德巴利酵母(Debaromyces hansenii))、XP_889008 (白色念珠菌(Candida albicans))>XP_500338 (解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))、XP_746744 (烟曲霉(Aspergillus fumigatus))、BAE64333 (米曲霉(Aspergillus oryzae))、XP_965789 (粗糖链抱霉(Neurosporacrassa))、EAQ93453 (球毛壳霉(Chaetomium globosum))、XP_682385 (构巢曲霉(Aspergillus nidulans))、AAN74808 (串珠状赤霉(Gibberella moniliformis))、Q9UTK3、XP_361075 (稻痕病菌(Magnaporthe grisea))、EAL18922 (新型隐球菌(Cryptococcusneoformans))、XP_56803 9 (新型隐球菌)以及 XP_760597 (玉蜀黍黑粉菌(Ustilagomaydis))。酿酒酵母(S.cerevisiae)NPTl完整cDNA和所编码的蛋白质分别由基因库登录号NC_001147和AAB59317提供。大肠杆菌(E.coli)NPTl是以基因库登录号J05568提供。人类核苷酸和氨基酸序列分别由基因库登录号BC006284和AAH06284以及分别X71355和CAA50490.AAH32466 和 BC032466 提供，并且在庄(Chong)等人(1993)基因组学(Genomics)18:355中有描述。小鼠NPTl核苷酸和氨基酸序列是由基因库登录号X77241和CAA54459提供并且在庄等人(1995)美国生理学杂志(Am.J.Physiol.) 5268:1038中有描述。
[0055]PNCl (吡嗪酰胺酶/烟酰胺酶I)(作为NAD+补救路径的一部分将烟酰胺转化为烟酸的一种烟酰胺酶)和编码它的基因。该酶通过卡路里限制为寿命延长所需。编码PNCl的示例性核酸序列编码包括具有以下登录号的那些氨基酸序列的氨基酸序列:Q06178、XP_444815 (光滑念珠菌)、NP_986687 (棉假囊酵母)、XP_453005 (乳酸克鲁维酵母)、XP_458184 (汉森德巴利酵母)、XP_718656 (白色念珠菌)、XP_504391 (解脂耶氏酵母)、NP_592856 (粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe))、XP_762639 (玉蜀泰黑粉菌)、XP_571297 (新型隐球菌)、BAE57070 (米曲霉)、XP_750776 (烟曲霉)、XP_659349 (构巢曲霉)、XP_389652 (玉蜀黍赤霉菌(Giberella zeae))、XP_957634 (粗糙链孢霉)、XP_363364(稻瘟病菌)、XP_758179 (玉蜀黍黑粉菌)以及EAQ85219 (球毛壳霉)。编码酿酒酵母PNCl的一种核苷酸序列和由此所编码的蛋白质分别以基因库登录号NC_001139和NP_011478代表。一种落花生(Arachis hypogaea) PNCl的核苷酸和氨基酸序列是由基因库登录号M37636和AAB06183提供，并且在巴菲尔德(Buffard)等人(1990)美国国家科学院院刊(PNAS) 87:8874中有描述。一种人类同源物的核苷酸和氨基酸序列分别由基因库登录号BC017344 和 AAH17344 ;分别 AK027122 和 NP_078986 ;分别 XM_041059 和 XP_041059 ；以及分别NM_016048和NP_057132提供。人类PNCl的核苷酸和氨基酸序列是以基因库登录号BC017344 表示。
[0056]参与NAD+补救路径的NMAl (烟酸单核苷酸腺苷酰基转移酶I)和编码它的基因。编码NMAl的示例性核酸序列编码包括具有以下登录号的那些氨基酸序列的氨基酸序列:Q06178、XP_444815 (光滑念珠菌)、NP_986687 (棉假囊酵母)、XP_453005 (乳酸克鲁维酵母)、XP_458184 (汉森德巴利酵母)、XP_718656 (白色念珠菌)、XP_504391 (解脂耶氏酵母)、NP_592856 (粟酒裂殖酵母)、XP_762639 (玉蜀黍黑粉菌)、XP_571297 (新型隐球菌)、BAE57070 (米曲霉)、XP_750776 (烟曲霉)、XP_659349 (构巢曲霉)、XP_389652 (玉蜀黍赤霉菌)、XP_957634 (粗糙链孢霉)、XP_363364 (稻瘟病菌)、XP_758179 (玉蜀黍黑粉菌)以及EAQ85219 (球毛壳霉)。编码酿酒酵母NMAl的一种核苷酸序列和由此所编码的蛋白质分别以基因库登录号NC_001144.2和NP_013432代表。人类同源物的核苷酸和氨基酸序列分别由基因库登录号 NM_022787 和 NP_073624 ;分别 AK026065 和 BAB15345 ;分别 AF459819 和AAL76934 ;分别 XM_087387 和 XP_087387 ；以及分别 AF345564 和 AAK52726 以及 NP_073624 ；AAL76934 ;NP_073624 ;以及AF314163提供。细菌同源物例如在张(Zhang)等人(2002)结构(Structure) 10:69 中有描述。
[0057]参与NAD+的从头合成和补救合成的NMA2 (烟酸单核苷酸腺苷酰基转移酶2)和编码它的基因。
[0058]关于以上四种蛋白质和编码它们的基因的实例，还参见W02006/032469。编码NMA2的示例性核酸序列编码 包括具有以下登录号的那些氨基酸序列的氨基酸序列:NP_011524、XP_444815 (光滑念珠菌)、NP_986687 (棉假囊酵母)、XP_453005 (乳酸克鲁维酵母)、XP_458184 (汉森德巴利酵母)、XP_718656 (白色念珠菌)、XP_504391 (解脂耶氏酵母)、NP_592856 (粟酒裂殖酵母)、XP_762639 (玉蜀黍黑粉菌)、XP_571297 (新型隐球菌)、BAE57070 (米曲霉)、XP_750776 (烟曲霉)、XP_659349 (构巢曲霉)、XP_389652 (玉蜀黍赤霉菌)、XP_957634 (粗糙链孢霉)、XP_363364 (稻瘟病菌)、XP_758179 (玉蜀黍黑粉菌)以及EAQ85219 (球毛壳霉)。编码酿酒酵母NMA2的一种核苷酸序列和由此所编码的蛋白质分别以基因库登录号NC_001139和NP_011524表示。人类同源物的核苷酸和氨基酸序列分别由基因库登录号NM_015039和NP_055854提供。编码酿酒酵母NMA2的一种核苷酸序列和由此所编码的蛋白质分别以基因库登录号NC_001139和NP_011524表示。人类同源物的核苷酸和氨基酸序列分别由基因库登录号NM_015039和NP_055854提供。
[0059].参与氧化胁迫的蛋白质(如胆碱氧化酶(C0D)、过氧化物歧化酶(SOD)以及抗坏血酸过氧化物酶(APX))和编码它们的基因。(艾哈迈德(Ahmad)等人，2010)。
[0060]包括G1073 (atHRCl)的转录因子以及如EP1668140中所披露的转录因子多肽的G1073进化枝中的等同物(equivalog)。[0061]参与胁迫响应性基因表达和胁迫耐受性(熊(Xiong)等人，植物细胞(The PlantCell) (2001)，第13卷，2063-2083)的Los5 (ΑΒΑ生物合成的一种关键调节子)和编码它的基因。
[0062]编码一种感兴趣的表达产物的任何基因可以对棉花植株来说是内源性的或可以已引入一种棉花植株中。在后者情况下，所引入的基因可以是并非发现于棉花中的基因的一种基因同源物或在棉花中具有一种同源物的基因。举例来说，编码NPTl的一种基因可以来源于真菌，如酵母。
[0063]所述感兴趣的表达产物也可以是能够调节所述棉花植株中所包含的一种基因的表达的一种RNA分子，其中所述基因任选地参与棉花植株对胁迫的响应。
[0064]参与棉花植株对胁迫的响应的基因的实例包括PARP1、PARP2、FTA、FTB、NPTUPNCU NMAU ΝΜΑ2 以及 Los5。
[0065]FTA (法尼基转移酶α )和FTB (法尼基转移酶β )是信号传导基因，这些信号传导基因被鉴别为在植株对环境胁迫(如干旱)作出响应的能力中起作用(还参见王(Wang)等人，2005)。法尼基转移酶催化法尼基化的第一步骤，在该第一步骤中一个15-碳法尼基部分被加入目标序列CaaX的半胱氨酸残基中。FTA和FTB相关的表达产物的示例性用途也可见于 ΕΡ1534842 中。
[0066]对于RNA分子的 情况，将清楚的是每当RNA分子的核苷酸序列参考相对应的DNA分子的核苷酸序列来定义时，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)应由尿嘧啶(U)代替。由本申请的上下文将清楚是参考RNA分子还是DNA分子。
[0067]术语“能够调节一种基因的表达”是指一种RNA分子(如在此所描述的一种抑制性RNA分子)以不同方式影响目标基因的表达水平的作用。这可以通过抑制一种目标基因的表达来实现，该抑制通过与以下直接相互作用来进行:驱使所述表达的组分(如该基因本身或被转录的mRNA),这引起表达减少；或参与抑制一种基因的表达的另一种基因(其中所述后一种基因任选地参与棉花植株对胁迫的响应)，这引起表达增加。
[0068]抑制性RNA分子使它们的目标表达产物(如目标蛋白质)的可供翻译成所述目标蛋白质使用的多种mRNA的水平降低。以此方式，蛋白质(例如参与不需要的对胁迫条件的响应的那些蛋白质)的表达可以被抑制。这可以通过公认的技术来实现，包括共抑制(正义RNA 抑制)、反义 RNA、双链 RNA (dsRNA)或微 RNA (miRNA)。
[0069]如在此所披露的作为表达产物的一种RNA分子包含编码一种目标表达产物(如目标蛋白质或RNA)的一个核苷酸序列或一个同源序列的一部分以使所述目标表达产物的表达下调。用于使表达下调的作为表达产物的一种RNA分子的另一个实例是反义RNA分子，这些反义RNA分子包含与编码一种表达产物(如一种感兴趣的蛋白质或RNA)的一个核苷酸序列或一个同源序列的至少一部分互补的一个核苷酸序列。在此，可以例如通过引入这种反义RNA或编码此类RNA分子的一种嵌合DNA来实现下调。在又另一个实例中，一种感兴趣的表达产物(如一种感兴趣的蛋白质或RNA)的表达通过引入一种双链RNA分子而下调，该双链RNA分子包含与编码所述感兴趣的表达产物的一个基因序列的至少一部分相对应并且对应地互补的一个正义RNA区和一个反义RNA区，该正义和反义RNA区能够彼此形成一个双链RNA区。这种双链RNA分子可以由如上文所描述的正义和反义分子以及由被加工以形成siRNA (如例如在EP1583832中所描述)或miRNA的单链分子两项编码。[0070]在一个实例中，可以通过引入一种嵌合DNA构建体来使一种目标蛋白质的表达下调，该嵌合DNA构建体产生能够通过共抑制而使表达下调的一种正义RNA分子。被转录的DNA区在转录时将以转录或后转录方式在目标植株或植株细胞中产生一种所谓的正义RNA分子，该正义RNA分子能够使编码一种目标表达产物(如一种目标蛋白质或RNA)的一种基因的表达减少。被转录的DNA区(和所得RNA分子)包含与编码植株细胞或植株中所存在的目标表达产物(如一种目标蛋白质)的核苷酸序列的相对应部分具有至少95%序列一致性的至少20个连续核苷酸。
[0071]作为替代方案，用于下调一种目标表达产物(如一种目标蛋白质或RNA)的表达的一种表达产物是一种反义RNA分子。使目标棉花植株或植株细胞中的一种感兴趣的表达产物的表达下调或减少是以转录或后转录方式实现的。被转录的DNA区(和所得RNA分子)包含与编码植株细胞或植株中所存在的所述目标表达产物的核酸序列的相对应部分的互补序列具有至少95%序列一致性的至少20个连续核苷酸。
[0072]然而，编码一种目标表达产物的核酸序列的约20nt的反义或正义RNA区的最小核苷酸序列可以包含在一个更大的RNA分子内，尺寸从20nt到等于该目标基因的尺寸的长度变化。因此，所提到反义或正义核苷酸区的长度可以是约从约21nt到约5000nt长，如21nt、40nt、50nt、100nt、200nt、300nt、500nt、1000nt、2000nt 或甚至约 5000nt 或更长。此外，为了本发明的目的，不需要所使用的抑制性RNA分子或转基因的编码区域的核苷酸序列与目标基因完全相同或互补，该目标基因对植株来说可以是内源性的或已被引入，编码在植株细胞中表达被靶向以减少的目标表达产物。序列越长，对总体序列一致性的要求越不严格。因此，正义或反义区可以与目标基因的核苷酸序列或其互补序列具有约40%或50%或60%或70%或80%或90%或100%的总体序列一致性。然而，如所提到，反义或正义区应包含具有与编码目标基因的核苷酸序列具有约95%到约100%序列一致性的20个连续核苷酸的一个核苷酸序列。具有约95%到约100%序列一致性的链段可以是约50、75或lOOnt。
[0073]上述嵌合基因对于反义RNA或正义RNA介导的基因表达水平下调的效率可以通过包含会引起异常的非聚腺苷 酸化的抑制性RNA分子的表达的DNA元件来进一步增强。适用于该目的的一个这种DNA元件是编码一种自剪接核糖核酸酶的一个DNA区，如W000/01133中所描述。该效率也可以通过提供使用如W003/076619中所描述的核定位或滞留信号产生的RNA分子来增强。
[0074]另外，如在此所描述的一种表达产物可以是一种核酸序列，该核酸序列产生能够使编码一种目标表达产物的一种基因的表达下调的一种双链RNA分子。在DNA区转录时，该RNA能够通过在一个正义和反义区之间的常规碱基配对而形成dsRNA分子，由此该正义和反义区是如上文所描述的核苷酸序列。根据W099/53050的披露，作为根据本发明的dsRNA的表达产物可以另外包含位于例如正义和反义RNA区之间的间隔序列中的一个内含子，如一个异源内含子。为了实现这种转基因的构筑，可以使用W002/059294A1中所描述的载体。
[0075]在一个实例中，所述RNA分子包含一个第一和第二 RNA区，其中1.所述第一 RNA区包含具有与所述内源性基因的核苷酸序列具有至少约94%序列一致性的至少19个连续核苷酸的一个核苷酸序列；2.所述第二 RNA区包含与所述第一 RNA区的所述19个连续核苷酸互补的一个核苷酸序列；3.所述第一和所述第二 RNA区能够碱基配对以在所述第一和所述第二区的至少所述19个连续核苷酸之间形成一个双链RNA分子。[0076]感兴趣的产物的另一种示例性表达是能够引导从编码目标表达产物(如一种蛋白质或一种RNA)的DNA转录的mRNA的裂解的一种微RNA分子(mirRNA，它可以从一种前微RNA分子加工而来)，该mRNA将被翻译成所述目标表达产物。miRNA分子或前miRNA分子可以通过从如在此所描述的一种嵌合基因表达而被方便地引入植株细胞中，该嵌合基因包含编码一种感兴趣的表达产物(如miRNA、前miRNA或初级miRNA转录物)的一个(第二)核酸序列。
[0077]miRNA是调节植物以及其他真核生物中的基因表达的小型内源性RNA。如在此所使用，一种“miRNA”是长度为约19到22个核苷酸的一种RNA分子，该RNA分子可以被装载到一种RISC复合物中并且引导一种目标RNA分子的裂解，其中目标RNA分子包含与miRNA分子的核苷酸序列基本上互补的一个核苷酸序列。在一个实例中，在miRNA分子的基本上互补的序列中可能出现以下错配中的一项或多项:
[0078]-所述miRNA的5’末端处的核苷酸与目标RNA分子中相对应的核苷酸序列之间的一个错配；
[0079]-所述miRNA的位置I到位置9中的核苷酸中的任一项与目标RNA分子中相对应的核苷酸序列之间的一个错配；
[0080]-所述miRNA的位置12到位置21中的核苷酸中的任一项与目标RNA分子中相对应的核苷酸序列之间的三个错配，其条件是存在不超过两个连续错配；
[0081]-miRNA的位置10和11处不允许有错配(所有miRNA位置均从miRNA分子的5’末端开始来指定)。
[0082]如在此所使用，一种“前miRNA”分子是具有约100到约200个核苷酸、优选地约100到约130个核苷酸的一种RNA分子，该RNA分子可以采用包含一个dsRNA茎干和一个单链RNA环的一个二级结构并且在双链RNA茎干中另外包含miRNA的核苷酸序列和它的miRNA *的互补序列。优选地，miRNA和它的互补序列位于距离miRNA dsRNA茎干的游离末端约10到约20个核苷酸处。单 链环区的长度和序列并不关键并且长度可以例如在30与50nt之间显著变化。优选地，未配对和配对的RNA结构的自由能之间的差异在_20与-60千卡/摩尔之间，尤其为约-40千卡/摩尔。miRNA与miRNA *之间的互补不需要完美并且可以容许未配对的核苷酸的约I到3个突起。一种RNA分子所采用的二级结构可以通过本领域中常规的计算机算法(如mFold、UNAFold以及RNAFold)来预测。通过DCL活动释放并且被装载到RISC复合物上的前miRNA的dsRNA茎干的特定链是由5’末端处的互补程度决定，由此在5’末端处最少参与被裂解的dsRNA茎干的不同链的核苷酸之间的氢键结的链被装载到RISC复合物上并且将决定目标RNA分子降解的序列特异性。然而，如果凭经验来自一个特定合成的前miRNA分子的miRNA分子因为“错误”链被装载到RISC复合物上而不具有功能性，那么将立即明显可见的是这个问题可以通过将miRNA分子和它的互补序列在前miRNA分子的dsRNA莖干的相应链上的位置交换而得以解决。如本领域中已知,涉及两个氢键的A与U或涉及两个氢键的G与U之间的结合与涉及三个氢键的G与C之间的结合相比强度更小。
[0083]miRNA分子可以被包含在它们的天然存在的前miRNA分子内，但它们也可以通过将通常由这种现有的前miRNA分子加工的miRNA分子的核苷酸序列换成另一种感兴趣的miRNA的核苷酸序列而被引入现有的前miRNA分子骨架中。前miRNA的骨架也可以完全是合成的。同样，合成的miRNA分子可以被包含在现有的前miRNA分子骨架或合成的前miRNA骨架内，并且从现有的前miRNA分子骨架或合成的前miRNA骨架加工而来。
[0084]示例性表达产物还可以是催化自身裂解或其他RNA裂解的核酶。
[0085]在披露在此的嵌合基因的一个实例中，调节是增加，并且所述第二核酸序列编码一种RNA，该RNA在被转录时1.产生一种RNA分子，该RNA分子能够例如通过靶向参与使这些蛋白质的表达下调的基因而使对所述棉花植株来说为内源性的一种基因的表达增加，所述基因选自NPTl、PNCl、Los5、NMAl以及NMA2，或者2.产生一种RNA分子，该RNA分子能够例如通过直接靶向此基因而使对所述棉花植株来说为内源性的一种基因的表达降低，所述基因选自 PARP1、PARP2、FTA 以及 FTB。
[0086]在披露在此的嵌合基因的另一个实例中，调节是降低，并且所述第二核酸序列编码一种RNA，该RNA在被转录时1.产生一种RNA分子，该RNA分子能够例如通过靶向参与使这些蛋白质的表达下调的基因而使对所述棉花植株来说为内源性的一种基因的表达增加，所述基因选自PARPl、PARP2、FTA以及FTB，或者2.产生一种RNA分子，该RNA分子能够例如通过直接靶向此基因而使对所述棉花植株来说为内源性的一种基因的表达降低，所述基因选自 NPTl、PNCl、Los5、NMAl 以及 NMA2。
[0087]示例性的基于RNA的表达产物包括抑制性RNA，如miRNA、siRNA、反义RNA或靶向PARP (聚(ADP-核糖)聚合酶)家族的酶的核酶，它们的实例还披露于国际专利申请PCT/EP2010/003438 中。
[0088]当前，已描述两类PARP蛋白。第一类，如在此所定义，包括所谓的经典的包含Zn指的PARP蛋白(ZAP)或由相对应的p arpl基因编码的PARPl蛋白。这些蛋白质的尺寸在从113到120kDa范围内并且特征进一步为存在定位于该蛋白质的N末端域中、特别是定位于该蛋白质的约355到约375个最初的氨基酸内的至少一个、优选地两个Zn指域。Zn指被定义为能够络合一个Zn原子的具有序列CxxCxnHxxC的肽序列(由此η可以从26到30变化)。可以用作用于设计根据本发明的表达产物的基础的来自ZAP类的PARP蛋白质的氨基酸序列的实例包括可以按以下登录号发现于PIR蛋白质数据库中的序列:Ρ18493(牛(Bos taurus))、P26466 (原鸡(Gallus gallus))、P35875 (黑腹果妮(Drosophilamelanogaster))、P09874 (智人(Homo sapiens))、P11103 (小家鼠(Mus musculus))、Q08824(马苏大麻哈鱼(Oncorynchus masou))、P27008 (褐家鼠(Rattus norvegicus))、Q11208 (掠尾别麻蚬(Sarcophaga peregrina))以及 P31669 (非洲爪蟾(Xenopus laevis))。相对应的cDNA的核苷酸序列可以按以下登录号发现于EMBL数据库中:D90073 (牛)、X52690 (原鸡)、D13806 (黑腹果蝇)、M32721 (智人)、X14206 (小家鼠)、D13809 (马苏大麻哈鱼)、X65496(褐家鼠)、D16482 (棕尾别麻蝇)以及D14667 (非洲爪蟾属)。已描述玉米中的PARPl蛋白质(TO00/04173)。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，具有 AGI 号 At2g31320 的一种parpl基因被报导于TAIR8蛋白质数据库中。
[0089]如在此所定义的第二类包括所谓的非经典PARP蛋白(NAP)或由相对应的parp2基因编码的PARP2蛋白。这些蛋白质更小(72-73kDa)并且其特征进一步为在该蛋白质的N-末端不存在一个Zn指域，并且存在包含氨基酸的链段的与DNA结合蛋白具有相似性的一个N末端域。已报导了玉米(W000/04173)和棉花(W02006/045633)中的PARP2蛋白。已在拟南芥的基因组中鉴别出两种parp2基因(At4g02390和At5g22470)。[0090]以下是鉴别以实验方式证实的和假定的植株PARP蛋白序列的数据库条目的一个非限制性清单，这些序列可以被鉴别并且可以被视为用于设计根据本发明的表达产物的一个基础:AAN12901、AAMl3882, CAA10482、AAD20677、BAB09119、CAB80732、CAA88288、AAC19283、Q9ZP54、Q9FK91、Q11207、NP_850165、NP_197639、NP_192148 (拟南芥)；CA070689、CAN75718、CA048763、CA040033、A7QVS5、A5AIW8、A7Q0E8、A5AUF8、A7QFD4 (葡萄(Vitis vinifera)) ;BAF21367、BAC84104、EAZ0360U EAZ39513、BAF08935、EAZ23301、EAY86124、BAD25449、BAD53855、BAD52929、EAZl 1816、BAF04898、BAF04897、EAY73948、EAY73947、EAZl1816、EAZl1815、Q7EYV7、Q0E0Q3、A2YKJ0、A2X5L4、A2WPQ2、A2WPQ1、A3BIX4、A3A7L2、A2ZSW9、Q5Z8Q9、QOJMYU A2ZSW8、ΝΡ_001059453, ΝΡ_00104702 K NP_001042984、NP_001042983 (水稻(Oryza sativa)) ;AAC79704、CAA10889, CAA10888, Q9ZSV1、050017、B4FCJ3 (玉米(Zea mays)) ;EDQ65830、EDQ52960、A9SSX0、A9TUE0、A9S9P7 (小立碗藓(Physcomitre I la patens)) ;AAD51626、Q9SWB4 (大丑(Glycine max))> QlSGFl (蔡黎首猜(Medicago truncatula)) ；ABK93464> A9PAR1 (毛果杨(Populus trichocarpa))。
[0091]清楚的是，编码PARPl或PARP2蛋白或其多个部分的其他基因或cDNA可以从其他真核物种或品种、特别是从其他植物物种或品种分离。此外，一些氨基酸已换成其他化学上类似的氨基酸(所谓的保守取代)的编码PARPl蛋白的parpl或parp2基因或合成的parpl基因(它们基于遗传密码的简并性编码与天然parpl基因类似但具有一个不同核苷酸序列的蛋白质)和其多个部分也适合于本发明的方法。
[0092]在描述在此的嵌合基因和棉花植株细胞的一个实例中，所述第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的核苷酸序列或与其具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%序 列一致性并且赋予所述嵌合基因胁迫诱导性的一个核酸序列。
[0093]在描述在此的嵌合基因和棉花植株的另一个实例中，所述第一核酸序列由SEQ IDNO:1或SEQ ID NO: 2或与其具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%序列一致性并且赋予所述嵌合基因胁迫诱导性的一个核酸序列组成。
[0094]在披露在此的嵌合基因和棉花植株的一个实例中,所述胁迫是水分胁迫、冷胁迫、高盐胁迫或施用ΑΒΑ。
[0095]这些胁迫因素以术语“非生物植物环境胁迫”概述。这些因素不是孤立的，而是相关的并且彼此影响。
[0096]水分胁迫包括对于植物引起缺水的干旱。
[0097]干旱是最严重的世界范围的农业问题之一。世界农业土地中的十分之四位于干旱或半干旱地区中。短暂的干旱可以造成牲畜死亡、饥荒以及社会混乱。其他农业地区具有持续低降雨量并且依赖于灌溉来维持产量。在这两种情况下，可以最有效使用水并且维持可接受的产量的作物将处于优势。
[0098]在本申请的实例中已显示一种转基因或嵌合基因可以在暴露于干旱胁迫时在棉花植株细胞中在rd29启动子的控制下有效表达。这使得通过提供编码表达产物的序列能够减轻干旱条件对植株的作用，这使与其相关的如关于降低PARP的表达的表达产物所描述的缺点减少。
[0099]如本申请中所使用的干旱是指缺少或不存在可供一种植株使用一段指定时间的水。这种缺少或不存在水可以持续仅几天，如至少或至多2天、至少或至多3天、至少或至多4天、至少或至多5天、至少或至多6天、至少或至多7天、至少或至多8天、至少或至多9天、至少或至多10天、至少或至多15天或至少或至多20天。也可以持续一段更长的时间，如至少或至多3周、至少或至多4周、至少或至多5周、至少或至多6周、至少或至多2个月、至少或至多3个月、至少或至多4个月、至少或至多5个月或至少或至多6个月。在世界上的一些地区中，干旱可以甚至持续比6个月更长，如7、8、9、10、11、12、15、18或24个月。
[0100]与本申请结合的术语“冷胁迫”表示小于12° C、小于11° C、小于10° C、小于9° C、小于8° C、小于7° C、小于6° C、小于5° C、小于4° C、小于3° C、小于2° C、小于1° C或甚至小于0° C，如小于-2° C、小于-4° C、小于-6° C、小于-8° C、小于-10° C，如-15° C、-20° C或-25° C的温度持续一段指定的时间，如至少5h、至少或至多6h (与这个方面结合的术语“至多”还包括“至少5h)、至少7h、至少8h、至少9h、至少10h、至少15h、至少20h、至少I天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少10天、至少14天、至少21天或至少28天。以上两个清单的任何组合充分定义冷胁迫。举例来说，冷胁迫是在小于10° C的温度下存在至少6h、至少12h、至少I天、至少2天、至少4天、至少I周或至少2周。
[0101]盐胁迫已被报导在敏感物种中造成生长和发育的抑制；光合成、呼吸作用以及蛋白质合成的减少(波伊尔(Boyer)，1982 ;梅洛尼(Meloni)等人，2003 ;帕耳(Pal)等人，2004)。植株中盐度胁迫的一个重要后果是反应性氧物质(ROS)的过度产生，如过氧化物阴离子(0_2)、过氧化氢(H2O2)以及羟基自由基(0H.)，特别是在叶绿体和线粒体中(米特勒(Mittler), 2002 ;马苏德(Masood)等人，2006)。
[0102]术语“高盐胁迫”表示在围绕一种植株(特别是一种棉花植株)的土壤中至少80mM、至少90mM、至少100mM、至少120mM、至少130mM、至少140mM、至少150mM或至少200mM的盐浓度。盐的种类可以不同，取决于在其中发现的区域和土壤。示例性的盐是NaCl、CaCl2、MgCl2 以及 MgSO4。
[0103]施用ABA可以 在实验设置中使用以模拟非生物环境胁迫，因为ABA触发干旱可诱导的基因的表达。在这点上，可以例如用包含在从至少20 μ M到500 μ M范围内的适当浓度的ABA的溶液喷洒这些植株。也可以使植株在包含50 μ M ABA的固体培养基上生长(刘红霞(Hongxia Liu)，植物细胞 2010)。
[0104]在另一方面，本申请披露了一种包含以下的棉花植株或其种子或棉花植株部分:
(a)—种嵌合基因，该嵌合基因包含a.—个第一核酸序列，该第一核酸序列包含SEQ IDNO:1或SEQ ID NO: 2的至少400个连续核苷酸或与其具有至少80%序列一致性的一个核酸序列，这些序列中的任一项赋予所述嵌合基因胁迫诱导性；b.—个第二核酸序列，该第二核酸序列编码一种感兴趣的表达产物；以及任选地c.一个转录终止和聚腺苷酸化序列；或
(b)在此所描述的棉花植株细胞。(a)中所描述的嵌合基因可以是如在此以上所描述的嵌合基因，包括与其相关的所有变化形式。
[0105]嵌合基因可以通过在可以衍生出胚性愈伤组织的棉花植株中转化而引入，这些棉花植株如珂字棉(Coker) 312、珂字棉310、珂字棉5爱字棉(Acala) SJ-5、GSC25110、大纤维(FIBERMAX) 819、斯欧科拉(Siokra) 1-3、T25、GSA75、爱字棉 SJ2、爱字棉 SJ4、爱字棉SJ5、爱字棉SJ-C1、爱字棉B1644、爱字棉B1654-26、爱字棉B1654-43、爱字棉B3991、爱字棉GC356、爱字棉GC510、爱字棉GAM1、爱字棉Cl、爱字棉罗亚尔(Acala Royale)、爱字棉马克撒(Acala Maxxa)、爱字棉普利玛(Acala Prema)、爱字棉B638、爱字棉B1810、爱字棉B2724、爱字棉B4894、爱字棉B5002、非爱字棉“采棉者(picker)”斯欧科拉、“摘棉者(stripper)” 品种 FC2017、珂字棉 315、斯字棉(STONEVILLE) 506、斯字棉 825、DP50、DP61、DP90、DP77、DESl 19、McN235、HBX87、HBX191、HBX107、FC3027、凯姆布雷德(CHEMBRED) Al、凯姆布雷德A2、凯姆布雷德A3、凯姆布雷德A4、凯姆布雷德B1、凯姆布雷德B2、凯姆布雷德B3、凯姆布雷德Cl、凯姆布雷德C2、凯姆布雷德C3、凯姆布雷德C4、佩字棉(PAYMASTER)145、HS26、HS46、斯卡拉(SICALA)、皮马 S6 欧罗布朗科皮马(PIMA S60R0 BLANCO PIMA)、大纤维FM5013、大纤维FM5015、大纤维FM5017、大纤维FM989、大纤维FM832、大纤维FM966、大纤维FM958、大纤维FM989、大纤维FM958、大纤维FM832、大纤维FM991、大纤维FM819、大纤维FM800、大纤维FM960、大纤维FM966、大纤维FM981、大纤维FM5035、大纤维FM5044、大纤维FM5045、大纤维FM5013、大纤维FM5015、大纤维FM5017或大纤维FM5024以及具有其衍生的基因型的植株。
[0106]种子是由与储存的养分一起被一个种皮密封的一个胚植物形成。种子是裸子植物和被子植物的成熟的胚珠的产物，棉花属于后者，它在受精之后出现并且在母体植株内生长到一定程度。
[0107]在此所披露或通过在此所描述的方法获得的转化的棉花植株细胞和棉花植株除上文所描述的嵌合基因之外还可以包含至少一种其他嵌合基因，该至少一种其他嵌合基因包含编码一种感兴趣的表达产物的一种核酸。这种表达产物的实例包括RNA分子或蛋白质，如对一种除草剂具有抗性的一种酶，如对基于草铵膦的除草剂具有耐受性的bar或pat酶(EP0257542、W087/05629以及EP0257542，怀特(White)等人1990)、对基于草甘膦的除草剂具有耐受性的EPSPS酶(如一种双突变玉米EPSPS酶(US6，566，587和W097/04103))或对HPI3D抑制剂除草剂(如异噁唑)具有耐受性的HPI3D酶(W096/38567)。
[0108]通过在此所描述的方法获得的转化的植株细胞和植株可以进一步用于在本领域中众所周知的育种程序，如杂交、自交以及回交。育种程序可以涉及杂交以产生一个Fl (第一子代)代，随后为自交的若干代(产生F2、F3等)。育种程序还可以涉及回交(BC)步骤，由此后代与称为轮回亲本的亲本 株系中的一项回交。
[0109]因此，在此还披露了一种用于制造植株的方法，这些植株包含在此所披露的嵌合基因，该方法包括以下步骤:使在此所披露的棉花植株与另一种植株或与自身杂交，并且针对包含所述嵌合基因的后代进行选择。
[0110]通过在此所披露的方法获得的转化的植株细胞和植株也可以进一步用于后续转化程序，例如用于引入另一种嵌合基因。
[0111]在此所披露的或通过在此所披露的方法获得的包含嵌合基因的棉花植株或种子可以进一步用以下处理:棉花除草剂，如敌草隆(Diuron)、伏草隆(Fluometuron)、MSMA> 乙氧氟草醚(Oxyfluorfen)、扑草净(Prometryn)、氟乐灵(Trifluralin)、唑草酮(Carfentrazone)、烯草酮(Clethodim)、丁基批氟禾草灵(Fluazifop-butyl )、草甘膦、达草灭(Norf lurazon)、二甲戍乐灵(Pendimethalin)、卩密硫草醚(Pyrithiobac-sodium)、三氟唳磺隆(Trifloxysulfuron)、卩比喃草酮(Tepraloxydim)、草铵膦(Glufosinate)、丙炔氟草胺(Flumioxazin)、噻苯隆(Thidiazuron);棉花杀虫剂，如乙酰甲胺磷(Acephate)、涕灭威(Aldicarb)、毒死蝶(Chlorpyrifos)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、阿巴汀(Abamectin)、卩定虫脉(Acetamiprid)、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(Emamectin Benzoate)、卩比虫啉(Imidacloprid)、却虫威(Indoxacarb)> λ -氯氟氰菊酯(Lambda-Cyhalothrin)、多杀菌素(Spinosad)、硫双威(Thiodicarb)、Y -氯氟氰菊酯(Gamma-Cyhalothrin)、螺甲螨酯(Spiromesifen)、卩定虫丙醚(Pyridalyl )、氟唳虫酰胺(Flonicamid)、氟虫双酰胺(Flubendiamide)、杀铃脲(TrifIumuron)、氯虫苯甲酰胺(Rynaxypyr)、β -氟氯氰菊酯(Beta-Cyfluthrin)、螺虫乙酯(Spirotetramat)、可尼丁(Clothianidin)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、噻虫啉(Thiacloprid)、呋虫胺(Dinetofuran)、氟虫双酰胺、溴氰虫酰胺(Cyazypyr)、多杀霉素、乙基多杀菌素(Spinotoram)、Y氯氟氰菊酯、4_[[(6_氯卩比卩定-3-基)甲基](2，2- 二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)_酮、硫双威、阿维菌素(Avermectin)、氟唳虫酰胺、唳虫丙醚、螺甲螨酯、氟唳虫胺腈(Sulfoxaflor)；以及棉花杀真菌剂，如喃菌酯(Azoxystrobin)、联苯批菌胺(Bixafen)、唳酰菌胺(Boscalid)、多菌灵(Carbendazim)、百菌清(Chlorothalonil)、铜、环丙唑醇(Cyproconazole)、苯醚甲环唑(Difenoconazole)、醚菌胺(Dimoxystrobin)、氟环唑(Epoxiconazole)、咪唑菌酮(Fenamidone)、氟唳胺(Fluazinam)、氟批菌酰胺(Fluopyram)、氟卩密菌酯(Fluoxastrobin)、氟唑菌酰胺(Fluxapyroxad)、异菌脲(Iprodione)、卩比唑萘菌胺(Isopyrazam)> 异噻菌胺(Isotianil)、代森猛锌(Mancozeb)、代森猛(Maneb)、苯氧菌胺(Metominostrobin)、卩比噻菌胺(Penthiopyrad)、卩定氧菌酯(Picoxystrobin)、丙森锋(Propineb)、丙硫菌唑(Prothioconazole)、卩比唑醚菌酯(Pyraclostrobin)、五氯硝基苯(Quintozen e)、戍唑醇(Tebuconazole)、氟醚唑(Tetraconazole)、甲基硫菌灵(Thiophanate-methyl )、月亏菌酉旨(Trifloxystrobin)0
[0112]在另一方面,披露了一种在胁迫条件下在棉花中表达一种转基因的方法,该方法包括:(al)将一种嵌合基因引入或基因渗入一种棉花植株中，该嵌合基因包含:一个第一核酸序列，该第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的至少400个连续核苷酸或与其具有至少80%序列一致性的一个核酸序列，这些序列中的任一项赋予所述嵌合基因胁迫诱导性；一个第二核酸序列，该第二核酸序列编码一种感兴趣的表达产物；以及任选地一个转录终止和聚腺苷酸化序列，并且使该植株生长；或(&2)使在此所描述的棉花植株生长或使来自在此所描述的种子的一种植株生长；(b)使所述植株暴露于胁迫。(al)中所描述的嵌合基因可以是如在此以上所描述的嵌合基因，包括与其相关的所有变化形式。
[0113]与本申请结合的“引入”是指通过人工手段将基因信息置入一种植株细胞或植株中。这可以通过本领域中已知的用于将RNA或DNA引入植株细胞、组织、原生质体或完整植株中的任何方法来实现。
[0114]多种方法可供将DNA转移到植株细胞中使用。棉花的农杆菌介导的转化已在例如美国专利5，004，863、美国专利6，483，013以及W02000/71733中有描述。
[0115]也可以通过粒子轰击来转化植株:用DNA涂布金或钨的粒子并且接着射入年轻植株细胞或植株胚胎中。这种方法还允许植株质体的转化。通过粒子轰击进行的棉花转化在例如W092/15675中有报导。
[0116]可以使用病毒转化(转导)来进行瞬时或稳定的基因表达，这取决于病毒基因组的性质。所希望的基因材料被封装到一个适合的植物病毒中并且使被修饰的病毒感染植株。被感染的植株的子代是无病毒的并且也不含被插入的基因。适合用于病毒转化的方法在例如 TO90/12107、W003/052108 或 W02005/098004 中有描述或进一步详述。
[0117]“基因渗入”意味着通过天然手段(S卩，通过使包含在此所描述的嵌合基因的一种植株与不包含所述嵌合基因的一种植株杂交)将一种基因整合于一种植株基因组中。可以选择后代中那些包含嵌合基因的后代。
[0118]另外的转化和基因渗入方案也可见于美国专利7，172,881中。
[0119]在由在此所披露的嵌合基因编码的所选择的转基因表达的过程中，植株必须暴露于天然或人工产生的胁迫条件。这包括使植株暴露于至少一个种类的非生物环境胁迫，如水分胁迫(尤其是干旱胁迫)、冷胁迫、高盐胁迫或由施用ABA所诱导的胁迫。
[0120]呈干旱胁迫形式的水分胁迫可以仅通过剥夺或减少植株的供水(通过将它们置放在一个天然干旱暴露区域中或通过减少温室或田间的供水)而施加到植株上。举例来说，供水可以减少至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或甚至100%，持续落入上文结合干旱胁迫所描述的那些所希望的时间内的一段所希望的时间。
[0121 ] 冷胁迫可以通过将植株置放在与它习惯的相比一个更低的温度下来施加。举例来说，可以将棉花植株置放在低于12° C、低于10° C、低于7° C或甚至低到4° C或2° C的温度下持续落入上文结合冷胁迫所描述的那些所希望的时间内的一段所希望的时间。
[0122]高盐胁迫可以通过以下方式施加:将植株置放在包含一定总盐浓度的土壤中持续一段所希望的时间，如上文针对高盐胁迫所描述；或用包含一定盐浓度的水对植株进行浇水，引起盐在土壤中的富集。示例性浓度范围在25mM与200mM之间，例如在30与180mM之间、50 与 150mM 之间，包括 60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM 以及 140mM。
[0123]由ABA诱导的胁迫可以通`过用包含浓度在约10 μ M与约200 μ M之间(如在20与150之间或50到100)的ABA的一种溶液喷洒这些植株来施加。
[0124]在另一方面，本申请披露了一种产生棉花植株的方法，该方法包括:引入或基因渗入一种嵌合基因，该嵌合基因包含:一个第一核酸序列，该第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的至少400个连续核苷酸或与其具有至少80%序列一致性的一个核酸序列，这些序列中的任一项赋予所述嵌合基因胁迫诱导性；一个第二核酸序列，该第二核酸序列编码一种感兴趣的表达产物；以及任选地一个转录终止和聚腺苷酸化序列；或使在此所描述的植株生长或使来自在此所披露的种子的一种植株生长。所引入或基因渗入的嵌合基因可以是如在此以上所描述的嵌合基因，包括与其相关的所有变化形式。包含在所述嵌合基因中的由所述第二核酸序列编码的感兴趣的表达产物可能参与棉花植株对如上文所描述的胁迫的响应。
[0125]在此还披露了一种检测转基因在胁迫条件下的表达的方法，该方法包括(a)提供在此所披露的棉花植株细胞或植株，其中所述感兴趣的表达产物是该转基因；(b)使该植株暴露于胁迫；以及(C)检测该转基因的表达。
[0126]术语“一种转基因的表达”是指使用在棉花细胞中起作用的适当的表达控制元件来转录并且任选地翻译在此所披露的嵌合基因。如上文所描述，在此所披露的第一核酸序列具有启动子功能并且是可由非生物植物胁迫诱导的，并且因此适合于在胁迫条件下在棉花中表达一种所选择的表达产物(与第二核酸序列相对应)。
[0127]与这种方法结合的使一种植株暴露于胁迫可以如上文所描述来实现。[0128]“检测转基因的表达”可以按多种方式实现。在转基因是一种报告基因的情况下，所述报告基因的表达取决于使它成为一种报告基因的特征是可容易检测的。举例来说，如果报告基因是能够将一种底物转化成一种可目测侦测的产物的一种酶，那么所述产物可以通过适当的手段来检测，该适当的手段取决于所述产物的颜色或由所述产物发射的光的波长。在转基因不是一种常规的报告基因但具有酶促活性的情况下，可以由知道所述酶促活性的技术人员设计检验以使用适合的方法来对它进行追踪和定量。此外，可以通过以下方式来测量具有已知核酸序列的一种转基因的表达:PCR方法，包括扎诺尼(Zanoni)等人(自然(Nature) 2009,460,第 264-269 页，也参见自然.实验手册(Nature Protocols):通过实时 PCR 进行 mRNA 表达分析(mRNA expression analysis by Real-Time PCR)；ISSN: 1754-2189)和洛根(Logan)，爱德华兹(Edwards)以及桑德斯(Saunders)(编者；实时 PCR:现代技术和应用(Real-Time PCR:Current Technology and Applications),凯斯特学术出版社(Caister Academic Press) 2009，ISBN: 978-1-904455-39-4)中所披露的 PCR 方法；测序技术，包括在 http: //www.1llumina.com/documents/products/datasheets/datasheet_mrn a_expression.pdf 处可供使用的伊路米那数据表(Illuminadatasheet) “mRNA 表达分析(mRNA expression analysis)”(2010)中所披露的测序技术；以及杂交技术，如乔杜里(Chaudhary)等人(进化和发育(EVOLUT10N&DEVEL0PMENT) 2008 ；10:5, 567-582)中所披露的杂交技术。
[0129]在此还披露了一种调节棉花植株对胁迫的抗性的方法，该方法包括:将一种嵌合基因引入或基因渗入一种棉花植株中，该嵌合基因包含:a.—个第一核酸序列，该第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的至少400个连续核苷酸或与其具有至少80%序列一致性的一个核酸序列，这些序列中的任一项赋予所述嵌合基因胁迫诱导性；b.—个第二核酸序列，该第二核酸序列编码一种感兴趣的表达产物，该感兴趣的表达产物任选地参与棉花植株对胁迫的响应；以及任选地c.一个转录终止和聚腺苷酸化序列；以及使所述嵌合基因在胁迫条件下表 达。用于这种方法中的嵌合基因可以是如在此以上所描述的嵌合基因，包括与其相关的所有变化形式。
[0130]如果由所述嵌合基因的第二核酸序列编码的表达产物参与棉花植株对如上文所描述的非生物环境胁迫的响应，那么一种植株对胁迫的抗性可以在描述在此的嵌合基因在胁迫条件下表达时被修改。
[0131]在描述在此的所有方法中，胁迫应如上文结合在此所披露的嵌合基因解释。因此，在披露在此的方法中，所述胁迫是水分胁迫、冷胁迫、高盐胁迫或施用ΑΒΑ。水分胁迫可以是干旱胁迫。
[0132]在用于调节一种棉花植株对胁迫的抗性的方法的一个实例中，调节是增加，并且所述第二核酸序列编码一种RNA，该RNA在被转录时1.产生一种RNA分子，该RNA分子能够例如通过靶向参与使这些蛋白质的表达下调的基因而使所述棉花植株中所包含的一种基因的表达增加，所述基因选自ΝΡΤ1、PNC1、Los5、NMAl以及NMA2 ;或者2.产生一种RNA分子，该RNA分子能够例如通过直接靶向此基因而使所述棉花植株中所包含的一种基因的表达降低，所述基因选自PARP1、PARP2、FTA以及FTB。
[0133]在用于调节一种棉花植株对胁迫的抗性的方法的另一个实例中，调节是降低，并且所述第二核酸序列编码一种RNA，该RNA在被转录时1.产生一种RNA分子，该RNA分子能够例如通过靶向参与使这些蛋白质的表达下调的基因而使所述棉花植株中所包含的一种基因的表达增加，所述基因任选地选自PARP1、PARP2、FTA以及FTB ;或者2.产生一种RNA分子，该RNA分子能够例如通过直接靶向此基因而使所述棉花植株中所包含的一种基因的表达降低，所述基因选自NPTl、PNCl、Los5、NMAl以及NMA2。
[0134]在此还披露了以下用于在胁迫条件下在棉花中表达一种转基因的用途:(a)在此所披露的棉花植株或种子；(b) —种嵌合基因，该嵌合基因包含:一个第一核酸序列，该第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的至少400个连续核苷酸或与其具有至少80%序列一致性的一个核酸序列，这些序列中的任一项赋予所述嵌合基因胁迫诱导性；b.—个第二核酸序列，该第二核酸序列编码一种感兴趣的表达产物；以及任选地c.一个转录终止和聚腺苷酸化序列；或(c)一种核酸序列，该核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少400个连续核苷酸或与其具有至少80%序列一致性的一个核酸序列，这些序列中的任一项赋予与它可操作地连接的一种转基因胁迫诱导性。用于这种用途的嵌合基因可以是如在此以上所描述的嵌合基因，包括与其相关的所有变化形式。另外，定义本发明用途的所有术语具有如在本申请中其他地方所描述的含义。举例来说，术语“胁迫”被定义为并且包括如其他地方所描述的所有变化形式。
[0135]在此还披露了以下用于使一种棉花植株对胁迫的耐受性增加或用于检测棉花纤维中的一种转基因的用途:(a)—种核酸序列，该核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少400个连续核苷酸或与其具有至少80%序列一致性的一个核酸序列，这些序列中的任一项赋予与它可操作地连接的一种转基因胁迫诱导性；或(10 —种嵌合基因，该嵌合基因包含:一个第一核酸序列，该第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:2的至少400个连续核苷酸或与其具有至少80%序列一致性的一个核酸序列，这些序列中的任一项赋予所述嵌合基因胁迫诱导性；b.—个第二核酸序列，该第二核酸序列编码一种感兴趣的表达产物；以及任选地c.一个转录终止和聚腺苷酸化序列。
[0136]一种棉花植株对胁迫的耐受性的增加可以通过一种方法来实现，该方法包括使Ca)的核酸可操作地连接于编码参与棉花植株对胁迫的响应的一种感兴趣的表达产物的一个核酸序列，并且将所得 嵌合基因引入一种棉花植株中。举例来说，如果，包含在此所描述的嵌合基因的一种棉花植株与不包含所述嵌合基因的一种棉花植株相比在如上文所描述的胁迫条件下存活得更久或具有提高的产量，那么存在一种棉花植株的耐受性的增加。
[0137]在此进一步披露的是从在此披露的植株可获得或已获得的棉花纤维和棉花籽油。在此披露的棉花纤维可以通过应用在W02010/015423中披露的检测方法，并且检查纤维中Ca)的核酸或(b)的嵌合基因的存在而与其他纤维区分开来。
[0138]在此还披露的是由在此披露的纤维制成的纱线和纺织品以及包括在此披露的棉籽油或由在此披露的棉籽油组成的食物和饲料。一种用于获得棉籽油的方法包括从在此披露的棉花植株收获棉花籽并且也被披露的是从所述籽中提取所述油。另外，一种用于制造棉花纤维的方法包括使在此披露的棉花植株生长并且也被披露的是从所述棉花植株中收获棉花。
[0139]在此还披露了一种保护棉田不受胁迫影响的方法:包括(a)获得棉花植株，这些棉花植株包含:(i) 一种嵌合基因，该嵌合基因包含
[0140]a.一个第一核酸序列，该第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:2的至少400个连续核苷酸或与其具有至少80%序列一致性的一个核酸序列，这些序列中的任一项赋予所述嵌合基因胁迫诱导性；b.第二核酸序列，该第二核酸序列编码一种感兴趣的表达产物；以及任选地c.一个转录终止和聚腺苷酸化序列此处描述的棉花植株细胞；或其子代；和6)在所述田间种植所述棉花植株。
[0141]图式展示:
[0142]图1:在水分胁迫条件(相对土壤含水量(rswc) 10%)下rd29::⑶S转基因棉花植株和野生型对照的照片。
[0143]图2:与野生型植株相比包含rd29::⑶S的植株的表达特征曲线。在水分胁迫条件下，测定来自指定为8901和6301的两种独立的rd29::⑶S转基因棉花植株以及野生型对照的GUS基因的表达水平。在水分胁迫的过程中，在野生型对照中未检测到GUS基因，而在这两种rd29: AUS棉花植株中检测到表达。在对这两种rd29: AUS棉花植株进行再浇水之后，⑶S表达水平回到O。
[0144]图3:包含rd29a::PNC1构建体的植株的叶子组织在施加干旱胁迫之前和之后的表达分析。
[0145]序列表
[0146]SEQ ID NO:1:具有一个缺失的RD29启动子
[0147]SEQ ID NO:2:RD29 启动子
[0148]SEQ ID NO:3:引物 naste8
[0149]SEQ ID N0:4:引物 naste9
[0150]SEQ ID N0:5:载 体 pGEM-T
[0151]SEQ ID N0:6:载体 pNVSlO
[0152]SEQ ID NO:7:载体 pNVSll
[0153]SEQ ID N0:8:引物 pNVSllFW
[0154]SEQ ID N0:9:引物 pNVSllRV
[0155]SEQ ID NO: 10:载体 pNVS122
[0156]SEQ ID NO: 11:引物 naste79
[0157]SEQ ID NO: 12:载体 pNVS123
[0158]SEQ ID NO: 13:引物 naste75
[0159]SEQ ID NO: 14:引物 naste80
[0160]SEQ ID N0:15:载体 pNVS124
[0161]SEQ ID N0:16:包含了具有一个缺失的RD29启动子的载体pTIBElO
[0162]SEQ ID NO: 17:包含 RD29 启动子的载体 pTIBE28
[0163]SEQ ID NO: 18:具有内含子的⑶S报告基因
[0164]SEQ ID NO: 19:3’ CaMV35S 终止子的核酸序列
[0165]SEQ ID NO:20:编码2mepsps选择标记盒的核酸序列
[0166]SEQ ID N0:21:包含CaMV3’ 35S终止子的具有内含子的⑶S基因的核酸序列
[0167]SEQ ID NO:22:编码PNCl蛋白的核酸序列
[0168]SEQ ID NO:23:编码NMAl蛋白的核酸序列
[0169]SEQ ID NO: 24:编码针对PARPl的一种微RNA的核酸[0170]SEQ ID NO:25:编码针对PARP2的一种发夹RNA的核酸
[0171]SEQ ID NO:26:编码针对法尼基转移酶a (FTA)的一种发夹RNA的核酸
[0172]SEQ ID NO:27:编码针对法尼基转移酶β (FTB)的一种发夹RNA的核酸
[0173]SEQ ID NO:28:编码Los5蛋白的核酸序列
[0174]以下实例说明本发明。应了解，这些实例不限制在此所披露的主题的精神和范围。
[0175]实例
[0176]材料
[0177]除非另外指明，否则这些实例中的化学品和试剂是获自西格玛化学公司(SigmaChemical Company),限制性核酸内切酶是来自富酶泰斯公司(Fermentas)或罗氏-勃林格公司(Roche-Boehringer),而关于生物化学品和分子生物学检验的其他修饰酶或试剂盒是来自凯杰公司(Qiagen)、英杰公司(Invitrogen)以及Q-拜欧基因公司(Q-B10gene)。细菌菌株是来自英杰公司。所进行的克隆步骤，如例如限制性裂解、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段的纯化、连接DNA片段、大肠杆菌细胞的转化、使细菌生长、使噬菌体增殖以及重组DNA的序列分析是如由萨布鲁克(1989)所描述般进行的。重组DNA分子的测序是使用ABI激光荧光DNA测序仪遵循桑格(Sanger)的方法进行的。
[0178]实例1:分别产生具有可操作地连接于⑶S报告基因的来自rd29启动子的933bp区(包含一个缺失)和来自rd29启动子的934bp区的表达构建体
[0179]将使用以下引物从基因组拟南芥DNA扩增的拟南芥(A.thaliana)的rd29a基因的934bp启动子区
[0180]naste85，GCCCGGGCCATAGATGCAATTCAATCAAAC (SEQ ID NO:3)和
[0181]naste95’GCGCTAGCCTCGAGTTAATTAAGATTTTTTTCTTTCCAATA (SEQ ID NO:4)
[0182]克隆到pGEM-T 载体(SEQ ID NO:5)中，产生质粒 pNVSlO (SEQ ID N0:6)。
[0183]这一质粒与Yamaguch1-Shinozaki 和 Shinozaki (1994)相比在 rd29a 启动子区中包含I个缺失:在bp3748处一个A缺失。
[0184]在启动子区(B卩，在5’ UTR中)的3’末端处，将TCTTTGGAAA改变成TCTTAATTAA，从而为了克隆原因建立一个PacI位点。
[0185]将CaMV35S增强子添加到pNVSlO中的启动子区的3’，产生pNVSll(SEQ ID N0:7)。
[0186]为了促进具有Ncol/Nhel的GOI的克隆，将rd29启动子的5’末端处的一个NcoI位点消除，并且在rd29启动子的3’末端处引入一个新的NcoI位点。这是使用以下引物进行的
[0187]包含一个BspHI 位点的 pNVSl IFW (5’ CCTCATGACCATAGATGCAATTCAATCAAAC) (SEQID NO:8)和
[0188]包含一个NcoI 和 NheI 位点的 pNVSl 1RV( 5’ CCGCTAGCGCATCCATGGTCCAAAGATTTTTTTCTTTCAAT AG) (SEQ ID N0:9)，并且 pNVSll 作为一个 PCR 模板。
[0189]用切去rd29a启动子区的Ncol、NheI消化pNVSll。用BspHI (与NcoI相容)和NheI切割rd29PCR产物。将BspHI位点连接到载体的NcoI位点中使原始NcoI位点缺失。由于pNVSllRv引物的序列，在rd29a启动子后方、在3’CaMV35S前方引入一个NcoI和一个NheI 位点。所得质粒是 pNVS122 (SEQ ID N0:10)。
[0190]为了检查在rd29启动子中检测到的缺失是否由TAIR数据库(拟南芥信息资源；http://www.arabidopsis.0rg/)序列中的测序错误所引起或者它是否归因于被引入用
来制备pNVSlO的原始PCR片段中的错误，使用校正聚合酶Phusion?用引物naSte8和
naste9对基因组CTAB (西曲溴铵)DNA进行2次独立的PCR反应。对PCR产物的测序显示
它们并不具有缺失。为了从PNVS122中去除该缺失，将一个新的引物
[0191]naste79 (5'CCGCTAGCGCATCCATGGTCCAAAGATTTTTTTCTTTCCAATAGAAGT) (SEQ ID
N0:11)
[οι92] 用于一个pcr反应中，以代替弓I物pNVSlirv。使用Phusion?聚合酶，使用基因组CTAB DNA作为一个模板,用引物PnvSIIF1Wp naste79产生一种PCR产物。PNVS122和PCR产物两者都用SpeI和NcoI切割，并且将正确的PCR片段引入PNVS122中，产生质粒PNVS123(SEQ ID NO:12)。
[0193]为了促进在T-DNA载体中的进一步克隆，将MCS-接头(多克隆位点)引入rd29a启动子的5’。将引物
[0194]naste75
[0195]5’-CATGCCCGGGCGCGCCTGTACAGCGGCCGCGAATTCGT TAACTCTAGAGCGATCGC-3’(SEQ IDNO:13)
[0196]和
[0197]naste80
[0198]5’-CCGGGCGATCGCTCTAGAGTTAACGAATTCGCGGCCGC TGTACAGGCGCGCCCGGG-3’ (SEQID NO: 14)退火，产生具有粘性末端的接头。在pNVSll的一个Pst1-NcoI片段+粘性末端接头+pNVS123的一个Eag1-PstI片段之间进行3点连接。接头的5’末端处的粘性末端是一个CATG(C)突出端，这个CATG(C)突出端退火到NcoI位点上，但这种连接消除了所得质粒 PNVS124 (SEQ ID NO: 15)中的 NcoI 位点。
[0199]表汰载体的产牛:
[0200]从pNVSll扩增包含一个缺失的rd29a启动子并且进行关于在一个中间载体中的
一步克隆的克隆。
[0201]将具有一个缺失的rd29启动子片段(SEQ ID NO:1)、具有内含子的⑶S基因(SEQID N0:18)以及3’CaMV35S终止子(SEQ ID NO: 19)组装在包含2m印sps选择标记盒的一个骨架载体(SEQ ID N0:20)中，从而产生表达载体pTIBElO (SEQ ID N0:16)。
[0202]表达载体pTIBE28 (SEQ ID NO: 17)包含与具有内含子和CaMV3’35S终止子的Nhe1-NcoI⑶S基因(SEQ ID NO: 21)连接的没有缺失的Spe1-NcoI rd29a启动子(包含SEQ ID N0:2)。将两个片段(即，⑶S-3’35S终止子和Spe1-NcoI rd29a启动子)组装在包含2mepsps选择标记的一个载体中，产生pTIBE28 (SEQ ID NO: 17)。
[0203]实例2:包含rd29_GUS的转基因植株的产生
[0204]在下一个步骤中，使用胚性愈伤组织转化方案，将包含实例I的表达盒的重组载体(即，载体pTIBElO和pTIBE28)用于稳定转化陆地棉珂字棉312。
[0205]对照植株是陆地棉珂字棉312rd29_GUS转基因植株的无效分离子。
[0206]实例3:rd29::⑶S的干旱胁迫诱导性
[0207]在相应的活性检测过程中，用发色底物X_Gluc(5-溴-4-氯_3_吲哚基_ β -D-葡萄糖醛酸)植物原位监测用ΡΤΙΒΕ 28转化的植株的β-葡萄糖醛酸酶活性(杰佛森RA(Jefferson RA)等人(1987)欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.) 20; 6 (13): 3901-7)。为了测定启动子活性，如所描述(例如皮恩S.(Pien S.)等人(2001)美国国家科学院院刊98(20):11812-7)对植株组织进行切割、包埋、染色以及分析。因此，通过因底物X-Gluc的酶促代谢所引起的蓝色的存在而证实在被转化的植株中的β-葡萄糖醛酸酶的活性。
[0208]在使植株在充分供水的情况下生长约30天之后，通过不再对植株进行浇水而使它们经受干旱胁迫。
[0209]监测经过5天的⑶S报告基因的表达，在第5天进行再浇水。
[0210]在干旱胁迫五天之后，受胁迫的植株明显小于未受胁迫的植株(参见图1)。
[0211]图2展示了包含来自ΡΤΙΒΕ28的rd29::⑶S的两个植株株系与野生型植株相比的表达谱。
[0212]如由该图清楚的，在干旱胁迫条件下两个转基因株系在rd29启动子的控制下均表达⑶S报告基因。在对植株进行再浇水后表达被消除。因此，rd29启动子可以用于在胁迫条件下表达基因。
[0213]实例4:包含rd29的嵌合基因的表达不损伤能育力和植株活力
[0214]将PNCl (SEQ ID N0:22)、NMA1 (SEQ ID N0:23)以及 Los5 (SEQ ID NO:28)基因以及编码针对PARPl基因的微RNA (miPARPl)的一种核酸(SEQ ID NO: 24)以及针对PARP2基因的发夹构建体(SEQ ID NO: 25)置于rd29a启动子的控制之下。将所得构建体单独地转化到棉花中并且使植株再生。包含嵌合基因的棉花TO植株是能育的并且产生有活力的Tl种子。用Tl种子的发芽试验给出在90%与100%之间的发芽(播种20个种子并且针对发芽进行评分，所有Tl植株均具有正常活力)。从Tl植株未观测到能育性问题，纯合和不成对的植株每植株产生超过400个T2种子。用T2种子的发芽试验给出在80%与100%之间的发芽(播种15到20个种子并且针对发芽进行评分，所有T2植株均具有正常活力)
[0215]a
[0216]
【权利要求】
1.一种嵌合基因，包含 (a)一个第一核酸序列，该第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:2的至少400个连续核苷酸或与其具有至少80%序列一致性的一个核酸序列，这些序列中的任一项赋予所述嵌合基因胁迫诱导性； (b)一个第二核酸序列，该第二核酸序列编码一种感兴趣的表达产物，该感兴趣的表达产物参与棉花植株对胁迫的响应；以及任选地 (c)一个转录终止和聚腺苷酸化序列。
2.—种包含嵌合基因的棉花植株细胞，该嵌合基因包含 (a)一个第一核酸序列，该第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少400个连续核苷酸或与其具有至少80%序列一致性的一个核酸序列，这些序列中的任一项赋予所述嵌合基因胁迫诱导性； (b)一个第二核酸序列，该第二核酸序列编码一种感兴趣的表达产物；以及任选地· (c)一个转录终止和聚腺苷酸化序列。
3.如权利要求1所述的嵌合基因或如权利要求2所述的棉花植株细胞，其中所述感兴趣的表达产物是 (i)一种蛋白质或肽，该蛋白质或肽当被包含在所述棉花植株细胞中所包含的一种嵌合基因中时任选地参与棉花植株对胁迫的响应或 (ii)一种RNA分子，该RNA分子能够调节被包含在所述棉花植株中的一种基因的表达，其中当所述RNA分子被包含在所述棉花植株细胞中所包含的一种嵌合基因中时，任选地，被包含在所述棉花植株中的所述基因参与所述棉花植株对胁迫的响应。
4.如权利要求1或3所述的嵌合基因或如权利要求2或3所述的棉花植株细胞，其中任选地参与棉花植株对胁迫的响应的所述蛋白质选自NPTl、PNC1、NMA1、NMA2、Los5、以及参与氧化胁迫的多种蛋白质，如胆碱氧化酶、过氧化物歧化酶以及抗坏血酸过氧化物酶。
5.如权利要求3所述的嵌合基因或棉花植株细胞，其中任选地参与棉花植株对胁迫的响应的所述基因选自NPTl、PNCl、NMAl、NMA2、PARPl、PARP2、Los5、FTA、FTB、以及参与氧化胁迫的多种基因，如胆碱氧化酶、过氧化物歧化酶以及抗坏血酸过氧化物酶。
6.如权利要求3或5所述的嵌合基因或棉花植株细胞，其中调节是增加，并且所述第二核酸序列编码一种RNA,该RNA在被转录时1.产生能够使所述棉花植株中所包含的一种基因的表达增加的一种RNA分子，所述基因选自NPTl、PNCl、Los5、NMAl以及NMA2，或者2.产生能够使所述棉花植株中所包含的一种基因的表达减少的一种RNA分子，所述基因选自 PARP1、PARP2、FTA 以及 FTB。
7.如权利要求3或5所述的嵌合基因或棉花植株细胞，其中调节是减少，并且所述第二核酸序列编码一种RNA，该RNA在被转录时1.产生能够使所述棉花植株中所包含的一种基因的表达增加的一种RNA分子，所述基因选自PARP1、PARP2、FTA以及FTB，或者2.产生能够使所述棉花植株中所包含的一种基因的表达减少的一种RNA分子，所述基因选自NPT1、PNCl、Los5、NMAl 以及 NMA2。
8.如权利要求3和5到7中任一项所述的嵌合基因或棉花植株细胞，其中所述RNA分子包含一个第一和第二 RNA区，其中 ·1.所述第一 RNA区包含与所述棉花植株中所包含的所述基因的核苷酸序列具有至少约94%序列一致性的至少19个连续核苷酸的一个核苷酸序列；. 2.所述第二RNA区包含与所述第一 RNA区的所述19个连续核苷酸互补的一个核苷酸序列；并且. 3.所述第一和所述第二RNA区能够碱基配对以在所述第一和所述第二区的至少所述19个连续核苷酸之间形成一个双链RNA分子。
9.如权利要求1和3到8中任一项所述的嵌合基因或如权利要求2到8中任一项所述的棉花植株细胞，其中所述第一核酸序列包含SEQ IDN0:1或SEQ ID N0:2的核苷酸序列。
10.如权利要求1和3到9中任一项所述的嵌合基因或如权利要求2到9中任一项所述的棉花植株细胞，其中所述第一核酸序列由SEQ IDNO:l或SEQ ID NO:2组成。
11.如权利要求1和3到10中任一项所述的嵌合基因或如权利要求2到10中任一项所述的棉花植株细胞，其中所述胁迫是水分胁迫、冷胁迫、高盐胁迫或施用ΑΒΑ。
12.如权利要求11所述的嵌合基因或棉花植株细胞，其中所述水分胁迫是干旱胁迫。
13.一种棉花植株或其种子或棉花植株部分，包含 (a)—种嵌合基因，该嵌合基因包含 a.一个第一核酸序列，该第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少400个连续核苷酸或与其具有至少80%序列一致性的一个核酸序列，这些序列中的任一项赋予所述嵌合基因胁迫诱导性； b.一个第二核酸序列，该第二核酸序列编码一种感兴趣的表达产物；以及任选地 c.一个转录终止和聚腺苷酸化序列；或 (b)根据权利要求2到12中任一项所述的棉花植株细胞。
14.一种棉花纤维,该棉花纤维可由如权利要求13所述的棉花植株或其种子获得。
15.—种在胁迫条件下在棉花中表达一种转基因的方法，包括: (al)将一种嵌合基因引入或基因渗入一种棉花植株中，该嵌合基因包含:一个第一核酸序列，该第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的至少400个连续核苷酸或与其具有至少80%序列一致性的一个核酸序列，这些序列中的任一项赋予所述嵌合基因胁迫诱导性；一个第二核酸序列，该第二核酸序列编码一种感兴趣的表达产物；以及任选地一个转录终止和聚腺苷酸化序列；并且使该植株生长或 (a2)使如权利要求13所述的棉花植株生长或使来自如权利要求13所述的种子的一种植株生长； (b)使所述植株暴露于胁迫。
16.—种产生棉花植株的方法,包括: -将一种嵌合基因引入或基因渗入,该嵌合基因包含:一个第一核酸序列，该第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的至少400个连续核苷酸或与其具有至少80%序列一致性的一个核酸序列，这些序列中的任一项赋予所述嵌合基因胁迫诱导性；一个第二核酸序列，该第二核酸序列编码一种感兴趣的表达产物；以及任选地一个转录终止和聚腺苷酸化序列；或 -使如权利要求13所述的植株生长或使来自如权利要求13所述的种子的一种植株生长。
17.一种检测转基因在胁迫条件下的表达的方法，包括(a)提供如权利要求2到12中任一项所述的棉花植株细胞或如权利要求13所述的植株，其中所述感兴趣的表达产物是该转基因； (b)使该植株暴露于胁迫； (c)检测该转基因的表达。
18.—种调节棉花植株对胁迫的抗性的方法，包括 -将一种嵌合基因引入或基因渗入一种棉花植株中，该嵌合基因包含 a.一个第一核酸序列，该第一核酸序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:2的至少400个连续核苷酸或与其具有至少80%序列一致性的一个核酸序列，这些序列中的任一项赋予所述嵌合基因胁迫诱导性； b.一个第二核酸序列，该第二核酸序列编码一种感兴趣的表达产物，该感兴趣的表达产物任选地参与棉花植株对胁迫的响应；以及任选地 c.一个转录终止和聚腺苷酸化序列； -使所述嵌合基因在胁迫条件下表达。
19.如权利要求1、3到12所述的棉花植株细胞、如权利要求2到12中任一项所述的棉花植株细胞或如权利要求 13所述的棉花植株，其中包含所述嵌合基因的植株与野生型植株相比显示出正常活力和能育性。
【文档编号】A01H5/00GK103443279SQ201280006195
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2012年1月24日 优先权日:2011年1月24日
【发明者】S·皮恩, B·登博尔 申请人:拜尔作物科学公司