专利名称：一种规模化繁殖无毒烟蚜的方法
技术领域：
本发明属于植物保护领域蚜虫的生物防治，特别是一种规模化繁殖无毒烟蚜的方法。
背景技术：
烟虫牙苗蜂(Aphidius gifuensis)是专门寄生虫牙虫的ー种内寄生蜂,是烟田烟虫牙的重要寄生性天故。烟蚜茧蜂在蚜虫生物防治方面利用广泛。蚜茧蜂防治蚜虫的主要步骤有种植植物，在植物上饲养蚜虫，利用植物上饲养的蚜虫，饲养蚜茧蜂。通过田间人工释放饲养的蚜茧蜂，寄生田间作物上的蚜虫，达到防治蚜虫的目的。蚜茧蜂饲养包括两个主要阶段1)种蚜和种蜂的越冬；2)商品蚜茧蜂的生产和释放阶段。在规模化饲养蚜茧蜂的小棚或大棚网室或温室中，需要常年种植蚜虫繁殖植物，需要频繁接触植物。 蚜虫与蚜虫传播的病毒病。桃蚜、棉蚜、萝卜蚜、甘蓝蚜是传播烟草病毒病的主要介体。主要通过蚜传的病毒有PVY、黄瓜花叶病毒(CMV)等。蚜虫传播上述病毒为非持久性传播，在毒源物上取食几秒至几分钟即可获毒，获毒后不需要潜伏期即可传毒，持毒时间较短，一般不超过一小吋，脱皮后即丧失传毒能力。蚜虫传毒是烟草苗期和大田移栽期PVY和CMV初侵染的来源之一,也是病毒在田块内和田块间的主要传播途径之一。蚜虫的繁殖寄主常用为烟草或萝卜。蚜虫的规模化饲养，要求繁殖寄主适应于高密度种植，叶面积较大，适应蚜虫快速大量繁殖。在生产上首选为商业化种植的烟草品种或萝卜品种。目前采用烟草品种或萝卜品种，如国内专利或文献报道的烟草品种K326、烟草品种云烟202等，易感TMV和/或PVY病毒。烟苗或萝卜苗感染病毒病之后，表现生长缓慢，植株提前衰老，显著降低蚜虫的繁殖数量。更为重要的是，在感病的寄主上饲养的蚜虫可携带并传播PVY。由于蚜虫和蚜茧蜂个体很小但群体数量很大，繁殖蚜茧蜂的蚜虫一旦携带病毒，现有技术不能保证在释放蚜茧蜂吋，不会释放混杂的带毒蚜虫。因为在蚜茧蜂中难以避免混杂有少量的有翅蚜、或有少量未被蚜茧蜂寄生的若蚜或寄生早期的若蚜。这些有翅蚜、若蚜、寄生蚜随蚜茧蜂释放到田间之后，可能成为田间TMV和PVY的初侵染源之一携帯的病毒可能感染田间作物。降低释放蚜茧蜂伴随的蚜虫和僵蚜载体携帯植物病毒风险的策略主要有1)降低蚜茧蜂中混杂的蚜虫比例。技术手段包括通过改进蚜茧蜂和蚜虫的分选方法、提高若蚜的寄生比例；2)严格隔离和消毒饲养棚体、人员和植物寄主，減少饲养棚体内的植物病毒初侵染源和传播途径。蚜茧蜂规模化生产主要采用以上两种策略。但存在成本较高、步骤繁琐、落实难度较大、难以达到高效等问题。主要问题体现在以下几方面1)蚜茧蜂和蚜虫的个体细小但群体数量巨大，难以分选，蚜茧蜂成蜂和有翅蚜尚能彻底分开的分选方法。2)由于长期进化的结果，规模化的饲养棚中，无法达到百分之百的若蚜寄生率。3)常见的植物病毒病防控难度大。在操作频繁、重复使用的网室或温室内，TMV和PVY等危害重的植物病毒，具有初侵染来源多、易于传播、传播速度快、隐症带毒、药剂防治效果差等特点。一旦某个棚体带毒，彻底消灭成本高、难度大。
发明内容
针对现有蚜茧蜂生物防治中繁殖蚜虫的不足，本发明的目的在于提供一种规模化繁殖无毒烟蚜的方法，该方法高效经济、能有效降低蚜虫携帯病毒。本发明目的通过以下技术方案予以实现采用高抗烟草花叶病毒(TMV)和马铃薯Y病毒(PVY)烟草材料作为蚜虫的繁殖寄主；通过育苗或盆栽或移栽后，在网室或温室内人工繁殖蚜虫，选择双抗且蚜虫繁殖效率高的株系，用于繁殖无毒蚜虫。所述的高抗TMV和PVY的烟草材料，采用常规杂交育种方法获得，同时携带对TMV免疫的N基因和高抗PVY的va基因位点；对TMV和PVY的抗性到达人工接种病毒后，接种植株不表现花叶病症状、且非接种叶片病毒酶联免疫检测为阴性的水平。
通过常规杂交育种的方法，将携带对TMV免疫的N基因烟草材料与携带对PVY高抗的va基因烟草材料杂交，转育整合成双抗TMV和PVY的烟草材料；所述携带对TMV免疫的N基因烟草材料为Cokerl76、CV87、SC71、SC72或Coker86等种质资源之一；所述的携带对PVY高抗的va基因位点的烟草材料为VAM、TN86、TN90、NC55或VSCR等种质资源之一。本发明采用同时高抗TMV和PVY烟草材料作为蚜虫的繁殖寄主，饲养不携带TMV和PVY的蚜虫，确保伴随蚜茧蜂释放的蚜虫和僵蚜载体不携带病毒。本发明的技术原理为采用TMV和PVY不能増殖的烟草材料饲养蚜虫，从源头上杜绝蚜虫及僵蚜载体携帯植物病毒。TMV和PVY两种植物病毒，为专性寄生生物，只能通过寄主植物増殖，主要初侵染源为植物残体和蚜虫。蚜虫只能通过取食感染PVY的植株，才能携带PVY。采用高抗TMV和PVY的双抗烟草材料，烟草整个生育期均不会増殖TMV和PVY，可显著降低烟草的残体成为大田TMV的初侵染源的风险，同时可显著降低烟蚜成为大田PVY的初侵染源的风险。在烟蚜和烟蚜茧蜂繁殖过程中，人、工具、苗棚等物质污染的TMV和PVY，人工操作过程中，也不能系统感染高抗TMV和PVY的烟株。本发明的高抗TMV和PVY的双抗烟草材料，通过以下途径获得。通过常规杂交育种的方法，将对TMV免疫的N基因和对PVY免疫的va基因，转育整合成双抗TMV和PVY的烟草。烟草N基因为显性的单基因，携帯N基因的纯合或杂合烟草，在低于30°C条件下，接种TMV产生枯斑反应，TMV被局限在枯斑内，不能移动到烟草其他组织，保证了非接种叶片无TMV。携带隐性va基因的纯合烟草，由于缺失PVY増殖的植物因子，PVY不能侵染烟草，保证了即使有外来带毒蚜虫取食，也不会被PVY侵染，不会成为PVY的毒源。本发明的高抗TMV和PVY的双抗烟草材料，用于繁殖无毒蚜虫，不作为的生产烟叶的品种使用。本发明与现有技术相比具有如下的优点和有益效果现有繁殖无毒蚜虫的方法，大多采用感TMV和/或感PVY的烟草寄主，通过严格的隔离消毒方法，控制TMV和PVY的初侵染源，切断传播途径，保护易感寄主，来达到繁殖无毒烟蚜的目的。但因为寄主易感病毒，在长达几个月的过程中，大規模下很难保证无ー株烟草感病。本发明根据烟草已有单抗TMV或PVY种质的特点，转育双抗TMV和PVY的烟草材料，替代原有易感寄主，达到高效的多重保险的繁殖无毒蚜虫的目的。具有彻底有效降低寄主带毒风险的优点，在繁殖蚜虫过程中，不增加工效和成本。
本发明的实用性在于双抗TMV和PVY的材料一旦获得，可繁种长期使用，获得的成本低。双抗TMV和PVY的材料，不作为种植的烟草品种使用，不会影响烟草生产上的品种管理。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明，但以下实施例不是对本发明保护范围的限定。实施例1以携带N基因的Cokerl76为抗TMV亲本和携带va基因位点的NC55为抗PVY亲本，常规方法杂交，得到F1代。该F1的基因型为NnVava，表现为抗TMV但感PVY。F1通过常规方法自交，得到F2群体，在F2群体中通过混合接种TMV和PVY，或检测N基因与va基 因的分子标记，筛选双抗TMV和PVY的单株，也就是基因型为NNvava或基因型为Nnvava的单株。通过测交筛选出基因型为NNvava的单株。在基因型为NNvava的单株中，挑选出生长旺盛的单株，自交留种，得到抗性稳定的双抗TMV和PVY烟草材料(RTP)。进一步人工接种TMV和PVY病毒，验证对TMV和PVY的抗性，并通过育苗，繁殖蚜虫，选择双抗且蚜虫繁殖效率高的株系，采用常规方法育苗或盆栽或移栽后，在网室或温室内人工繁殖无毒蚜虫。NNvava基因型烟草材料(RTP)的抗病效果与蚜虫繁殖效果在气温低于30的网室内，RTP材料6片真叶时，人工接种TMV和PVY病叶混合汁液100倍，接种后21天调查，RTP仅在接种叶表现枯斑。非接种叶无TMV花叶症状和PVY花叶症状。非接种叶片采用Agdia酶联免疫检测试纸条检测，为TMV阴性和PVY阴性。对照品种Cokerl76接种后21天，接种叶表现TMV枯斑、非接种叶表现PVY花叶症状；对照品种NC55接种后21天，接种叶和非接种叶表现TMV花叶。表明RTP高抗TMV和PVY。在RTP上，烟蚜的繁殖效率与对照品种无明显差异。实施例2重复实施例1，有以下不同点以携带N基因的CV87为抗TMV亲本，携带va基因位点的NC55为抗PVY亲本。实施例3重复实施例1，有以下不同点以携带N基因的CV87为抗TMV亲本，携带va基因位点的VSCR为抗PVY亲本。实施例4重复实施例1，有以下不同点以携带N基因的Coker 176为抗TMV亲本，携带va基因位点的VSCR为抗PVY亲本。
权利要求
1.一种规模化繁殖无毒烟蚜的方法，其特征在于采用高抗烟草花叶病毒(Tbhcc0 mosaic Firw1S, TMV)和马铃薯Y病毒(Zbia ο virus 7, PVY)烟草材料作为姆虫的繁殖寄主；通过育苗或盆栽或移栽后，在网室或温室内人工繁殖蚜虫，选择双抗且蚜虫繁殖效率高的株系，用于繁殖无毒蚜虫。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于高抗烟草花叶病毒(TbAaccomosaic TMV)和马铃薯Y病毒GdWo virus 7，PVY)烟草材料，采用常规杂交育种方法获得，同时携带对TMV免疫的N基因和高抗PVY的va基因位点；对TMV和PVY的抗性达到人工接种病毒后，接种植株不表现花叶病症状、且非接种叶片病毒酶联免疫检测为阴性的水平。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于通过常规杂交育种的方法，将携带对TMV 免疫的N基因烟草材料与携带对PVY高抗的va基因烟草材料杂交，转育整合成双抗TMV和 PVY的烟草材料；所述的携带对TMV免疫的N基因烟草材料为Cokerl76、CV87、SC71、SC72或 Coker86等种质资源之一；所述的携带对PVY高抗的va基因位点的烟草材料为VAM、TN86、 TN90、NC55或VSCR等种质资源之一。
全文摘要
本发明公开了一种规模化繁殖无毒烟蚜的方法，采用高抗烟草花叶病毒(TMV)和马铃薯Y病毒(PVY)烟草材料作为蚜虫的繁殖寄主；通过育苗或盆栽或移栽后，在网室或温室内人工繁殖蚜虫，选择双抗且蚜虫繁殖效率高的株系，用于繁殖无毒蚜虫，本发明通过采用高抗烟草花叶病毒和马铃薯Y病毒的烟草材料繁殖蚜虫，在不增加现有蚜茧蜂繁殖工序和成本的情况下，能有效降低蚜虫携带病毒病的潜在风险；本发明具有简便易行、经济可靠等特点；可促进蚜茧蜂防治作物蚜虫的应用推广。
文档编号A01H1/02GK103004705SQ20131000361
公开日2013年4月3日 申请日期2013年1月6日 优先权日2013年1月6日
发明者刘勇, 吴兴富, 朱艰, 李梅云, 许美玲, 卢秀萍, 李永平, 杨华兵 申请人:云南省烟草农业科学研究院