专利名称：一种拟穴青蟹硫氧还原蛋白-2基因序列及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于拟穴青蟹基因序列及其用途领域，特别涉及一种拟穴青蟹硫氧还原蛋白-2基因序列及其用途。
背景技术：
拟穴青蟹是四种青蟹之一，属节肢动物门，甲壳纲，十足目，爬行亚纲，短尾派，梭子蟹科。具有很高的营养价值、药用价值和工业价值，是我国三大经济蟹类之一。硫氧还原蛋白系统，该系统包括硫氧还蛋白还原酶(TrxR)、硫氧还蛋白(Trx)、NADPH，是一个广泛分布的NADPH依赖性二硫化物还原酶系统。硫氧还原蛋白(Trx)是一种低分子量、进化上高度保守的还有二硫键氧化产物活性的蛋白质，它们属进化保守的氧化还原蛋白家族，具有一个相同的保守序列(-Cys-Gly-Pro-Cys-)也即其氧化还原活性中心，其中包含调节氧化还原活性的二硫键/巯基催化位点，被称为“硫氧还蛋白模体”。Trx具有氧化型和还原型两种形式，氧化型含有二硫键(-S2)，还原型含有巯基(-SH)。Trx有两种亚型=Trxl和Trx2，Trxl主要存在于细胞质中，Trx2主要存在于线粒体中。基因Trx2是一种特异存在于线粒体的小分子蛋白，故而又被称为线粒体型硫氧还蛋白。硫氧还原蛋白系统与体内细胞氧化还原反应、核酸代谢、细胞生长及肿瘤发生有关，主要功能是调节细胞包内氧化还原平衡，帮助细胞抵御氧化应激，参与氧应激诱导的细胞凋亡等。Trx2除了具有基本的氧化还原功能，还与线粒体介导的凋亡，细胞生长及某些疾病等密切相关。多种因素通过线粒体有氧呼吸等途径诱导神经元产生更多的活性氧(R0S)，而衰老过程中常伴有ROS清楚系统的减弱，从而导致氧自由基或氧化产物的异常积累，引发疾病。蛋白质是大多数细胞生理活动的物质基础，氧自由基对于功能性蛋白如离子通道、酶以及受体等的氧化修饰，往往会导致蛋白质功能的失活、异常甚至蛋白质的降解加剧，从而介导细胞生理功能的紊乱。蛋白质分子中最容易受到攻击的是含硫氨酸残基，包括半胱氨酸(Cys)和蛋氨酸(Met)残基，Cys的氧化产物包括次磺酸基二硫化物和磺基，通常以二硫化物为主。半胱氨酸残基氧化形成二硫键，同样，体内存在硫氧还原蛋白等还原物质，二硫键易被还原成疏基。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提高拟穴青蟹免疫能力，提供从拟穴青蟹肝胰腺SMARTtmcDNA文库中筛选出的一个硫氧还原蛋白-2 (Trx2)基因的核苷酸序列、氨基酸序列及其时空表达图谱以及在拟穴青蟹抵抗病原微生物入侵产品中的应用。本发明的一种拟穴青蟹硫氧还原蛋白-2基因，所述基因的cDNA长1347bp，自145bp到540bp区段为其开放阅读框，编码131个氨基酸，具有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。所述基因编码的蛋白质具有如SEQ ID N0.2所不的氣基酸序列。
所述基因开放阅读框ORF的克隆方法所涉及的引物序列如下:
上游引物:5，-CCTCACGGGGTGCATCAGGCGGG-3’下游引物:5，-TAACTAGCCTATCAGCAGATCAGA-3，。所述基因转录水平的检测方法为通过使用一对荧光定量PCR引物进行PCR检测，所涉及的引物序列如下:上游引物:5’ -CGGGAGTGGAGGAGGACA-3，，下游引物:5’-ATCATTGCTCTTTCAGTTG-3’。本发明的一种拟穴青蟹硫氧还原蛋白-2基因的应用，用于制备拟穴青蟹抵抗病原微生物入侵产品，提高拟穴青蟹免疫能力。所述的病原微生物包括副溶血性弧菌。本发明利用荧光定量PCR技术检测了 Trx2在拟穴青蟹的血细胞、肝胰腺、心脏、精巢、肌肉、鳃中的转录水平，结果表明:该基因在所检测的六个组织中均有mRNA存在，其中在肝胰腺中的丰度最高，其次在鳃中。另外还检测到经副溶血性弧菌刺激后的血细胞中的Trx2基因表达量呈上升趋势，明显较正常水平高，这显示该基因在拟穴青蟹抵抗病原微生物入侵中具有重要功能。
_7] 有益.效果(I)本发明的Trx2基因能够平衡氧化还原，具有抗衰老，保护细胞、抑制细胞凋亡等功能，治疗氧化应激损伤，清除体内过多氧自由基等作用；(2)本发明Trx2基因的获得不仅可以通过基因序列的表达获得具有生物活性的蛋白产物，为进一步 从蛋白层面对Trx2进行研究提供理论基础，而且还可以在青蟹的免疫与抗逆的生理活动中起到重要作用。
图1是荧光定量检测Trx2在拟穴青蟹六个组织中的表达情况；图2是拟穴青蟹经副溶血性弧菌感染后血细胞中Trx2的时空表达谱。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1RNA的提取和SMART cDNA文库的构建。肝膜腺总RNA 使用 Unizol Reagents (Biostar, Shanghai, China)提取，具体步骤如下:取新鲜肝胰腺组织进行液氮研磨，加入ImL Unizol Reagents,充分勻衆后,加入
0.2mL氯仿剧烈震荡15s,室温静置5min后12000r/min离心15min。取上清,加入等体积的异戊醇，混匀，冰上静置IOmin后12000r/min离心lOmin，弃上清。使用lmL75%乙醇洗漆沉淀，7500r/min离心3min后弃上清。室温放置晾干后加入30 μ L RNase free dH20,溶解。取3 μ L电泳检测总RNA浓度和质量。SMART cDNA 的合成用 SMART cDNA Library Construction Kit (Clontech, PaloAlto, CA, USA)试剂盒。具体步骤如下:取 2 μ gRNA，加入 I μ LSMART IV Oligonucleotide和I μ LCDS 111/3，PCR Primer，加水补足5 μ L，混匀离心后72°C温浴2min后冰浴。离心后加入 2 μ L5X First-Strand Buffer, I μ L DTT (20mM), I μ L dNTP Mix (IOmM)和 I μ LPowerScript Reverse Transcriptase,42°C温浴 Ih合成第一链cDNA。取2μ L第一链cDNA和 80 μ L 去离子水，10 μ LlOX A dvantage 2 PCR Buffer, 2 μ L50X dNTP Mix，2 μ L5’PCRPrimer, 2 μ LCDS 111/3，PCR Primer 和 2 μ L50X Advantage 2 Polymerase Mix 进行如下PCR循环:95°C Imin后，以95°C 15sec、68。C6min反应26个循环。取5μ L进行电泳检测。合成的SMART cDNA和pBluescript II SK ( + )载体连接，并转化入DH5 α感受态细胞中。摇菌后取25(^1^菌液涂布于15011培养皿上(4 1:-1 了6八1&1 LB固体培养基)，37°C过夜。通过蓝白斑鉴定后筛选cDNA插入片段的阳性重组子，分别接种到ImL含氨苄浓度为100 μ g/mL的LB液体培养基中扩大培养后进行菌液测序。对得到的序列进行BLAST比对后，共检测到该基因的一个克隆。该基因cDNA长1347bp，自145bp到540bp区段为其开放阅读框，编码131个氨基酸。实施例2拟穴青蟹硫氧还原蛋白-2 (Trx2)基因ORF序列的高保真克隆。设计了一对特异性引物，以拟穴青蟹血液总cDNA为模板，可快速、准确地克隆出编码拟穴青蟹硫氧还原蛋白-2 (Trx2)基因ORF序列，用于后续基因工程。1、用于扩增编码拟穴青蟹硫氧还原蛋白-2 (Trx2)基因ORF序列的特异性引物:上游引物:5’-CCTCACGGGGTGCATCAGGCGGG-3’ ；下游引物:5，-TAACTAGCCTATCAGCAGATCAGA-3，。2、PCR 反应体系:(TakaRa )
权利要求
1.一种拟穴青蟹硫氧还原蛋白-2基因，其特征在于:所述基因的CDNA长1347bp，自145bp到540bp区段为其开放阅读框，编码131个氨基酸，具有如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹硫氧还原蛋白-2基因，其特征在于:所述基因编码的蛋白质具有如SEQ ID N0.2所不的氣基酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹硫氧还原蛋白-2基因，其特征在于:所述基因开放阅读框ORF的克隆方法所涉及的引物序列如下: 上游引物:5’ -CCTCACGGGGTGCATCAGGCGGG-3’ 下游引物:5’ -TAACTAGCCTATCAGCAGATCAGA-3’。
4.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹硫氧还原蛋白-2基因，其特征在于:所述基因转录水平的检测方法 为通过使用一对荧光定量PCR引物进行PCR检测，所涉及的引物序列如下: 上游引物:5 ’ -CGGGAGTGGAGGAGGACA-3，， 下游引物:5’ -ATCATTGCTCTTTCAGTTG-3’。
5.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹硫氧还原蛋白-2基因的用途，其特征在于:用于制备拟穴青蟹抵抗病原微生物入侵产品，提高拟穴青蟹免疫能力。
6.根据权利要求5所述的一种拟穴青蟹硫氧还原蛋白-2基因的用途，其特征在于，所述的病原微生物包括副溶血性弧菌。
全文摘要
本发明涉及一种拟穴青蟹硫氧还原蛋白-2基因序列及其用途，基因的cDNA长1347bp，自145bp到540bp区段为其开放阅读框，编码131个氨基酸，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。基因用于制备拟穴青蟹抵抗病原微生物入侵产品，提高拟穴青蟹免疫能力。本发明的Trx2基因能够平衡氧化还原，具有抗衰老，保护细胞、抑制细胞凋亡等功能，治疗氧化应激损伤，清除体内过多氧自由基等作用。Trx2基因的获得不仅可以通过基因序列的表达获得具有生物活性的蛋白产物，为进一步从蛋白层面对Trx2进行研究提供理论基础，而且还可以在青蟹的免疫与抗逆的生理活动中起到重要作用。
文档编号A01K67/033GK103074345SQ20131000377
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月6日 优先权日2013年1月6日
发明者胡敬环, 蒋科技, 张凤英, 马凌波, 宋炜, 马春艳, 房娅博 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所