专利名称：烟草脉带花叶病毒侵染性克隆的构建及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物病毒基因工程领域，具体地，本发明涉及马铃薯Y病毒属的烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus, TVBMV)HN39分离物侵染性克隆的构建方法及应用。
背景技术：
植物病毒侵染性cDNA克隆是研究病毒致病机理的重要工具。获得了侵染性cDNA克隆后，可利用反向遗传学方法分析病毒基因在侵染和致病等过程中的作用，进而可以获得弱毒株系用来保护植物免受强毒株系的危害。植物病毒侵染性cDNA克隆也可以改造为表达载体，用来生产抗病毒蛋白、医用兽用疫苗和抗体。利用病毒载体表达外源蛋白在植物体内表达具有产量高、费用低、无动物病原菌污染的优点，具有重要的应用价值。目前，抗龋齿抗体、新城疫病毒疫苗及葡糖脑苷脂酶等已经利用植物病毒载体成功表达。植物病毒载体一般用17启动子或CaMV35S启动子。17启动子非常小，可以设计到引物上，但需要在体外转录成RNA后再接种。基于CaMV35S启动子构建的侵染性克隆主要有以下优点1.无需体外转录；2.侵染性cDNA克隆易于制备，可直接摩擦接种，也可用基因枪或者农杆菌共浸润的方法接种；3.侵染性cDNA克隆在体外稳定，便于保存。烟草脉带花叶病毒(TVBMV)属于马铃薯Y病毒属，主要侵染烟草等茄科作物。目前TVBMV在山东、安徽、河南、云南等地的发生呈现上升趋势。TVBMV在田间主要由蚜虫以非持久方式传播，并且TVBMV和马铃薯X病毒(PVX)有协生作用，一旦复合侵染会引起严重症状，导致更大损失
发明内容
本发明提供了一种烟草脉带花叶病毒侵染性克隆的构建及应用，通过基因插入重组的方式，将烟草脉带花叶病毒HN39分离物的基因组克隆到35S启动子下游，获得了具有强侵染力的侵染性克隆pCamTVBMV，为研究烟草脉带花叶病毒TVBMV的基因功能奠定了基础。利用侵染性克隆pCamTVBMV可以构建植物表达载体，在烟草、马铃薯等茄科植物体内稳定、高效表达抗病毒蛋白、病毒疫苗或抗体；利用侵染性克隆pCamTVBMV还可以研制弱毒株系，用来保护植株免受强毒株系的侵染。本发明实施的具体技术方案是烟草脉带花叶病毒侵染性克隆的构建，具体步骤如下a.烟草脉带花叶病毒病毒粒子的提取；可采用常规提取方法获得；b.从病毒粒子中提取病毒RNA，设计引物分三段对烟草脉带花叶病毒基因组进行PCR扩增。利用Overlap-PCR方法分别将35S启动子融合到烟草脉带花叶病毒的5'末端。C.用限制性酶切的方法将全长cDNA克隆连接到pCambia0390载体，获得pCamTVBMV ；d.将c中构建的载体通过农杆菌浸润接种寄主植物；
e.观察症状及ELISA检测。上述的方法综合而言，主要提供了构建烟草脉带花叶病毒HN39的侵染性cDNA克隆，该克隆能系统侵染寄主植物。同时提供一种可以在植物体内表达外源蛋白的表达载体，它以烟草脉带花叶病毒基因组为外源蛋白的表达载体，通过构建含有外源蛋白基因的重组cDNA，接种植物表达外源基因。采用本发明所述的技术方案，可以获得如下的技术效果I)烟草脉带花叶病毒不侵染动物和人，对环境安全。2)本发明采用35S启动子，无需体外转录，克服了 RNA酶对体外转录物降解的影响。3)该侵染性克隆可稳定保存，可用农杆菌浸润接种。保藏信息保藏时间2012年I月10日保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 CGMCC保藏编号CGMCCNO. 5710
保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号分类命名大肠埃希氏菌
图1为TVBMV基因组片段扩增示意图；图2为TVBMV表达载体pCamTVBMV基因组结构示意图；图3为TVBMV病毒粒子(wtTVBMV)和侵染性克隆pCamTVBMV接种后第8天在寄主植物上的症状；图4为pCamTVBMV-GFP接种后第14天本氏烟的症状，其中A为在可见光下观察到的本氏烟表现；B为在紫外光下可以观察到绿色荧光蛋白在本氏烟叶片中得到高效表达；图5为挑战接种10天后，不同弱毒株系对烟草植株的保护效果，用DEN、DEN + D198K、DEN + D198K + ART保护接种3天、5和10天后用强毒株系进行挑战接种，症状越重，荧光越強，在用弱毒株系处理的植株中，荧光越弱，说明交叉保护效果越好；图6用DEN、DEN + D198K、DEN + D198K + ART保护接种3天、5和10天后用强毒株系进行挑战接种，挑战接种5天后，不同处理的烟草植株内TVBMV病毒的浓度；
具体实施例方式以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容做进ー步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。本发明所提供的实施例，均按照常规实验条件，其中所采用的引物序列如下表
权利要求
1.一种烟草脉带花叶病毒的侵染性克隆，其序列如Seq ID No: 14所示。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于可通过以下步骤获得 (1)烟草脉带花叶病毒病毒粒子的提取，可采用常规提取方法进行； (2)从病毒粒子中提取病毒RNA，设计引物分三段对烟草脉带花叶病毒基因组进行PCR扩增。利用Overlap-PCR方法分别将35S启动子融合到烟草脉带花叶病毒的5'末端； (3)用限制性酶切的方法将全长cDNA克隆连接到pCambia0390载体，获得pCamTVBMV。
3.如权利要求1所述载体在表达外源蛋白方面的应用。
4.如权利要求1所述载体在保护植物免受病毒强毒株系侵染方面的应用。
全文摘要
本发明涉及植物病毒基因工程领域，提供了一种烟草脉带花叶病毒侵染性克隆的构建及应用。通过基因重组的方式，将烟草脉带花叶病毒HN39分离物的基因组克隆到35S启动子下游，获得了具有强侵染力的侵染性克隆。利用该侵染性克隆可以构建植物表达载体，在寄主植物体内稳定、高效表达外源蛋白，也可以将侵染性克隆改造为弱毒株系，以保护植株免受强毒株系的侵染。
文档编号A01H5/00GK103031325SQ20131000934
公开日2013年4月10日 申请日期2013年1月10日 优先权日2013年1月10日
发明者李向东, 高瑞, 田延平, 刘焕庭 申请人:山东农业大学