专利名称：一种盐芥耐盐性调控miRNA—tsa-miRn1927及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种盐芥耐盐性调控miRNA — tsa-miRnl927及其应用，属于生物技术技术领域。
背景技术：
土壤盐溃化已成为影响农作物生长发育、产量和品质的一个重要因素，是农作物减产的主要原因之一。目前，世界上约有20%的可耕地和至少40%的灌溉田具有不同程度的盐溃化，随着人口的剧增及工业化的高速发展，可耕地面积急剧下降，不合理灌溉、工业污染的加剧和化肥使用不当，造成了大量良田的次生盐溃化，预计到2050年全球将有50%的耕地发生不同程度的盐溃化。自然界中，植物对盐的适应有明显的差异，适应范围非常广泛，既有盐敏感的甜土植物，又有耐盐的盐生植物。由于大多数农作物为盐敏感的甜土植物，盐依然是影响农作物产量的主要限制因素。目前，对植物耐盐机理的研究已有一定的进展，例如拟南芥S0S1、S0S2、S0S3途径的发现及其耐盐机理的阐明(Zhu J.K.Salt and drought stress signal transduction in plants.Annu.Rev.PlantBiol.，2002, 53:247-273.), Blumwald实验室过量表达AtNHXl对于提高植物耐盐性所产生的影响(Apse Μ.P, Blumwald E, etal.Salt Tolerance conferred by Overexpression ofa Vacuolar Na./H+antiporter in Arabidopsis.Science.1999，285:1256-1258.)等。但目前国际上对植物耐盐机理的研究，主要集中于甜土植物，因而对于植物耐盐性机理的了解还存在一定的局限性。盐芥(Thellungiella salsuginea)是与拟南芥近缘的植物耐盐分子遗传学研究的新模式系统，盐芥的基因组测序已由美国农业部在2011年底完成，其基因组序列网站参见:http://www.phytozome.net/thellungiella.php。盐芥和拟南芥同为十字花科植物，在cDNA水平上两者存在90%- 95%的相似性。但相对于甜土植物拟南芥，盐芥为一种典型的盐生植物，能天然适应于盐胁迫的环境，即使短时间暴露于500mM NaCl也可完成其生长史。随着盐芥基因组测序的完成，盐芥功能基因组学尤其是耐盐相关基因的功能已成为其研究工作的重点。miRNA为广泛存在于真核生物中大约21_24nt的非编码RNAs，植物miRNAs大多靶向转录因子等调控蛋白，从而处于植物基因表达调控的中心位置。而逆境胁迫(盐、硫或磷匮乏和氧化胁迫等)不仅会诱导植物蛋白质编码基因的表达，也诱导一些非蛋白质编码基因miRNA的表达。植物miRNAs是目前国际研究的热点，但仅有少数实验室关注耐盐相关miRNAs，且主要是以模式植物拟南芥和水稻等为试材，例如在拟南芥、水稻和杨树等物种中克隆到与盐、磷缺乏、硫缺乏、氧化和力学胁迫等相关的miRNAs ;结果表明miRNAs作为革巴蛋白的负调节因子，其调节功能不仅在于植物发育、也在对盐等逆境胁迫的应答等过程中担任重要的调控作用。鉴于土壤盐溃化已成为限制农业生产的主要因素之一，通过研究植物耐盐胁迫的生理生化和分子生物学机制，挖掘耐盐基因资源，并运用基因工程手段培育耐盐作物，对于提高农作物的产量具有重要的现实意义。因而，以盐芥这一耐盐分子遗传学研究的新模式系统为试材，进行其miRNAs及其与耐盐性关系的研究，具有一定的前瞻性和创新性。另外，在可检索的现有技术中，对盐芥miRNAs的研究还未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足,提供来源于盐芥的miRNA—tsa_miRnl927盐芥耐盐性调控miRNA、其前体序列及其应用。为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下:一种盐芥耐盐性调控miRNA，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。上述盐芥耐盐性调控miRNA的前体，核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。编码上述盐芥耐盐性调控miRNA的前体的DNA片段，核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。上述盐芥耐盐性调控miRNA、盐芥耐盐性调控miRNA的前体在培育耐盐转基因作物中的应用。作为上述应用的一种优选技术方案，步骤如下:在作物中过表达SEQ ID N0.1所示的盐芥耐盐性调控miRNA 或者SEQ ID N0.2所示的盐芥耐盐性调控miRNA的前体，或抑制SEQ ID N0.1所示的盐芥耐盐性调控miRNA或者SEQ ID N0.2所示的盐芥耐盐性调控miRNA的前体，培育出具有高耐盐性的转基因作物。上述作物为小麦、水稻、玉米或棉花。本发明的实验Solexa测序结果证明，tsa-miRnl927受盐胁迫的调节,说明其在盐芥的高盐耐性机制中起重要作用。鉴于此，可利用该基因进行耐盐转基因作物的培育，进而对于提高作物的产量具有潜在的应用价值。有 益效果本发明采用Solexa高通量测序技术及随后的生物信息学分析和实时定量PCR的技术，首次从盐芥中鉴定了 tsa-miRnl927, tsa_miRnl927在盐处理后下调，盐处理小RNAs库中其计数0，而对照中为2363，tsa-miRnl927在盐处理后表达受到严重抑制；经验证，tsa-miRnl927在植物耐逆性尤其是耐盐性中起重要作用，并在耐盐作物培育中具潜在的应用价值。
图ltsa_miRnl927前体序列的二级结构图；其中:阴影部分为成熟miRNA所在位置；图2Solexa测序中tsa_miRnl927在对照和盐处理下的表达丰度的柱状示意图；其中:CL为正常生长盐芥tsa-miRnl927的表达水平，TL为200mM NaCl处理下盐芥tsa_miRnl927的表达水平；图3tsa-miRnl927 对靶基因 Ninja-family 蛋白 AFP4、转录因子 PH0X2/ARIX 和丝氨酸/苏氨酸蛋白质磷酸酶基因的mRNA降解示意图；图4为转基因盐芥与野生盐芥在不同浓度盐胁迫条件下鲜干重的柱状示意图；其中:A图为鲜重的柱状示意图，M3-14为转基因盐芥M3-14、M5-3为转基因盐芥M5-3、WT为野生型盐芥；B图为干重的柱状示意图，M3-14为转基因盐芥M3-14、M5_3为转基因盐芥M5-3、WT为野生型盐芥。
具体实施方案下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。实施例1:盐芥种子采集和种植在山东省东营市黄河三角洲盐碱地收集野生型盐芥(Thellungiellasalsuginea)的种子，晒干,经过表面消毒:体积百分比为70%的酒精,处理lmin, lwt%NaC10溶液，涡旋15min，无菌双蒸水冲洗后播种于MS培养基中，光照培养箱的温度设定:白天25°C，16h，晚间22°C，8h。待长出2片真叶后转移到Hogland液体培养基上，培养5周后，进行分组。NaCl处理组为Hogland营养液中加入NaCl使其终浓度为200mM，培养24小时；对照组为不含NaCl的Hogland营养液，培养24小时。MS培养基组分如下:大量元素50ml/L,韩盐溶液50ml/L,微量元素溶液5ml/L,铁盐溶液10ml/L，维生素溶液10ml/L，蔗糖30g/L，琼脂粉7.5g/L。其中，大量元素为20 倍母液，组分为:KN0338g/L，NH4N0333g/L, MgSO4.7H207.4g/L, KH2P043.4g/L ；钙盐溶液为20倍母液，组分为=CaCl2.2H208.8g/L ；微量元素溶液为200 倍母液，组分为:K10.166g/L，H3BO3L 24g/L，MnSO4.4H204.46g/L, ZnSO4.7H201.72g/L, Na2MoO4.2H200.05g/L, CuSO4.5H200.005g/L, CoCl2
6H200.005g/L ；铁盐溶液为100倍母液组分为:FeS04—EDTA3.67g/L ；维生素溶液为100倍母液，组分为:烟酸0.05g/L,维生素B60.05g/L,维生素BI0.0lg/L,甘氨酸 0.2g/L，肌醇 10g/L。Hogland 营养液每升组分如下:Ca (NO3) 2945mg, KN03607mg, (NH3) 3P03 磷酸铵115mg，MgS04493mg,铁盐溶液IOml，微量元素溶液5ml，调节pH值到6.0。其中铁盐溶液为100倍母液，组分为:FeS04—EDTA3.67g/L ；微量元素溶液为200 倍母液，组分为:K10.166g/L，H3BO3L 24g/L，MnSO4.4H204.46g/L, ZnSO4.7H201.72g/L, Na2MoO4.2H200.05g/L, CuSO4.5H200.005g/L, CoCl2.6H200.005g/Lo实施例2:盐芥miRNA文库的构建和Solexa测序
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将实施例1得到的正常生长条件下-对照组(CL)和200mM NaCl处理下-处理组(TL)的盐芥样品送往深圳华大基因研究所构建miRNA文库，进行Solexa测序。测序后去除3’接头、污染序列、小于18nt序列和polyA序列后，在CLmiRNA文库中总共获得高质量小RNA片段(sRNA) 12010658条，在TL miRNA文库中总共获得高质量小RNA片段(sRNA)12330771条。生物信息学预测结果显示tsa-miRnl927成熟体序列为:CAAGGCAGAAGAAGGCUGUUU (SEQ ID N0.1)。
tsa_miRnl927 前体序列为:GCAAAGUGAUCAAGGCAGAAGAAGGCUGUUUUGGCAAUAGGAUUAGCGCUGAUCCUAUUGCCAAAACAGCCUCUUCUUCCUUGUUUACUUUGA (SEQ ID N0.2),其在基因组中位置为:scaffold_19:2418388:2418480:+。根据tsa_miRnl927的前体和成熟体序列，用RNAstructure软件得到tsa_miRnl927前体的二级结构，如图1所示，阴影部分为成熟miRNA所在位置，其前体序列折叠成一种稳定的茎环结构，能量值为-63.1。属于miRNA前体典型的二级结构，符合miRNA前体的结构特征。测序结果显示tsa_miRnl927在正常条件下的测序丰度为2363，盐处理后的测序丰度为0，表明tsa-miRnl927的表达在受到盐胁迫后被抑制(图2)。预示着tsa_miRnl927在盐芥适应高盐胁迫机制中起重要作用。在农作物(例如玉米、小麦、水稻、油菜、大豆等)中过量或者抑制tsa-miRnl927的表达，将影响作物对盐胁迫的适应能力。实施例3:tsa-miRnl927祀基因的验证和功能分析利用miRNA和靶基因的互补性，通过生物信息学的方法在盐芥全基因组水平预测tsa_miRnl927 的祀基因。按照 Schwab 等的方法(Schwab R et al.,Specific effects ofmicroRNAs on plant transscriptome.Dev.Cell, 2005)使用以下规则:sRNA与祀基因间的错配不得超过4个(G-U配对认为0.5个错配)；在miRNA/靶基因复合体中不得有超过2处发生相邻位点的错配；在miRNA/靶基因复合体中，从miRNA的5’端起第2_12个位点不得有相邻位点都发生错配；miRNA/靶基因复合体的第10-11个位点不得发生错配^miRNA/靶基因复合体中，从miRNA的5’端起第1-12个位点不得有超过2.5个错配;miRNA/靶基因复合体的最低自由能(MFE)应不小于该miRNA与其最佳互补体结合时MFE的75%。用Mireap软件在盐芥全基因组水平预测靶基因。表ltsa_miRnl927 靶基因预测
权利要求
1.一种盐芥耐盐性调控miRNA，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.权利要求1所述盐芥耐盐性调控miRNA的前体，核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
3.编码权利要求2所述盐芥耐盐性调控miRNA的前体的DNA片段，核苷酸序列如SEQIDN0.3 所示。
4.权利要求1所述盐芥耐盐性调控miRNA、权利要求2所述盐芥耐盐性调控miRNA的前体在培育耐盐转基因作物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤如下:在作物中过表达SEQID N0.1所示的盐芥耐盐性调控miRNA或者SEQ ID N0.2所示的盐芥耐盐性调控miRNA的前体,或抑制SEQ ID N0.1所示的盐芥耐盐性调控miRNA或者SEQ ID N0.2所示的盐芥耐盐性调控miRNA的前体，培育出具有高耐盐性的转基因作物。
6.如权利要求5所 述的应用，其特征在于，所述作物为小麦、水稻、玉米或棉花。
全文摘要
本发明涉及一种盐芥耐盐性调控miRNA—tsa-miRn1927及其应用。盐芥耐盐性调控miRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明还涉及盐芥耐盐性调控miRNA的前体、盐芥耐盐性调控miRNA的前体的DNA片段及其在培育耐盐转基因作物中的应用。本发明提供的盐芥耐盐性调控miRNA—tsa-miRn1927在植物耐逆性尤其是耐盐性中起重要作用，并在耐盐作物培育中具潜在的应用价值。
文档编号A01H5/00GK103146701SQ201310039148
公开日2013年6月12日 申请日期2013年1月31日 优先权日2013年1月31日
发明者王兴军, 赵传志, 张荃, 赵术珍, 侯蕾, 夏晗, 李长生, 李爱芹 申请人:山东省农业科学院高新技术研究中心