一种大菱鲆四倍体鱼苗的批量诱导方法
【专利摘要】本发明涉及染色体操作技术，具体说是一种大菱鲆四倍体鱼苗的批量诱导方法。选择性成熟的大菱鲆亲鱼，分别收集精液和卵，待用；取上述精液与卵子按体积比1:100-200比例进行授精，作为对照组；待对照组人工受精15~25min后，将上述采集的精液与卵子按体积比1:100-200比例进行授精，作为诱导组；以对照组70~80%受精卵出现第一次卵裂痕的时间作为诱导组受精卵出现第一次卵裂痕的时间，在诱导组第一次卵裂痕出现前10~20min，将诱导组受精卵置于静水压机加压容器内，在60~70MPa静水压下进行压力休克处理，处理6~8min后泄压，取出受精卵，置于海水中继续培育；而后在原肠胚期和鱼苗期测定四倍体率。采用本方法得到的四倍体率最高达90%，可高效、稳定地诱导获得大菱鲆四倍体鱼苗。
【专利说明】一种大菱鲆四倍体鱼苗的批量诱导方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及染色体操作技术，具体地说是一种利用静水压力抑制受精卵卵裂的原理，批量诱导大菱鲆四倍体鱼苗的方法。
【背景技术】
[0002]大菱鲆(Scophthalmusmaximus)属于菱鲆科(Scophthalmidae)、菱鲆属(Scophthalmus),其生长快，目前已经成为我国北方主要的海水养殖品种,养殖工艺和产业链也相对完善。但是，近年来大菱鲆养殖业由于累代养殖和近亲交配，造成种质严重退化。因此采取有效方法，对大菱鲆进行遗传改良，从根本上解决大菱鲆养殖产业良种化问题已成当务之急。多倍体因其周期短、见效快和安全性高等特点，一直受到研究者和养殖业者的关注。其中，三倍体鱼具有三套染色体，往往是不育的。不育三倍体生物将用于繁殖的能量转化到生长方面，表现出生长快、个体大、抗逆性强的特点，具有较高的经济价值。所以，三倍体的人工诱导和培育将会是大菱鲆良种培育不可缺少的有效途径。但鱼类三倍体人工诱导一般采用温度休克或者静水压等方法抑制受精卵第二极体排放的方式获得，且每代均需人工受精并进行诱导，操作步骤相对繁琐；人工受精和诱导也对受精卵有刺激作用，造成受精率和孵化率偏低，从而影响了其生产推广。而如果诱导获得了四倍体大菱鲆，则可通过四倍体与二倍体杂交的方式，一劳永逸进行三倍体育种。因此，开展大菱鲆四倍体诱导和培育研究，对于大菱鲆良种培育及其养殖业健康可持续发展是非常必要的；同时，也可以为其他鱼类四倍体人工诱导方法的优化提供有益参考。
[0003]人工诱导海水鱼类四倍体常采用静水压或温度休克抑制卵裂获得，由于温度休克特别是冷休克处理时间较长，对受精卵刺激较大，休克温度也不易保持稳定，诱导四倍体的效率以及成活率往往较低。而静水压法处理时间较短，对受精卵的刺激相对较小，更容易生产应用。静水压法诱导的成功率主要受处理时刻(处理起始的时间)、处理压力和处理时间(处理延续的时间)三个因素的影响，其中处理时刻是起决定作用的因素。因此，准确的确定处理时刻是鱼类四倍体诱导成功与否，以及能否获得较高诱导率的关键。目前，人工诱导四倍体在鱼类尤其是纯海水鱼类中应用还几乎没有。鲆鲽鱼类中仅在半滑舌鳎、牙鲆等中有过一些尝试性的研究，而在大菱鲆中尚未见报道。由于不同鱼种最适的处理条件往往会有很大的差别，因此，对大菱鲆四倍体诱导条件进行优化和明确是十分重要的。
【发明内容】
[0004]针对以往四倍体诱导实验中处理时刻无法准确确定而影响诱导效率的情况，本发明目的在于提供一种大菱鲆四倍体鱼苗的批量诱导方法。
[0005]为实现上述目的，本发明采用技术方案为:
[0006]一种大菱鲆四倍体鱼苗的批量诱导方法，
[0007]I)大菱鲆人工受精:
[0008] 选择性成熟的大菱鲆亲鱼，分别收集精液和卵，待用；[0009]取上述少量精液，用少许新鲜海水激活后，迅速与卵子按体积比1:100-200混合均匀，随后补入卵子体积1-5倍量的新鲜海水进行授精，授精后将受精卵用新鲜海水冲洗干净，置于卵子体积5-10倍量的新鲜海水中培育，培育期间再补入卵子体积10-15倍量的新鲜海水，作为对照组；
[0010]待对照组人工受精15~_25min后，将上述采集的剩余精液，用少许新鲜海水激活后，迅速与卵子按体积比1:100-200混合均匀，随后补入卵子体积1-5倍量的新鲜海水进行授精，授精后将受精卵用新鲜海水冲洗干净，置于卵子体积5-10倍量的新鲜海水中培育，培育期间再补入卵子体积10-15倍量的新鲜海水，作为诱导组；
[0011]2)染色体诱导加倍
[0012]以对照组70-80%受精卵出现第一次卵裂痕的时间作为诱导组受精卵出现第一次卵裂痕的时间，在诱导组第一次卵裂痕出现前10-20min，将步骤I)诱导组受精卵置于静水压机加压容器内，在60-70MPa静水压下进行压力休克处理，处理6_8min后泄压，取出受精卵，置于海水中继续培育；
[0013]3)原肠胚和鱼苗四倍体率的测定:将诱导组的原肠胚进行染色体的倍性鉴定，并对孵化出的鱼苗进行流式细胞仪DNA含量的倍性鉴定，获得大菱鲆原肠胚期和鱼苗期四倍体率。
[0014]所述步骤I)和步骤2)中受精时期、孵育时期以及诱导时期三个时期所用海水的温度为13-18°C之间任意恒定的适宜大菱鲆卵生长所需水温；其中三个时期所用的海水温度应保持一致，且温差在±0.1°C以内。
[0015]所述将步骤I)诱 导组受精卵置于静水压机加压容器内的时间为诱导组处理前Imin左右。
[0016]本发明的优点和积极效果如下:
[0017]1.本发明改进了海水鱼类现有四倍体诱导中处理时刻的确定方法。静水压诱导鱼类四倍体是通过抑制受精卵卵裂使受精卵染色体加倍的，其处理时刻一般在第一次卵裂前，以往处理时刻的确定是根据受精时间计算的。以大菱鲆为例，其受精卵较适培育温度为13-18°C，其中在13-14°C海水培育时，大菱鲆受精卵第一次卵裂时间为130_150min ；在15-16°C时，其第一次卵裂时间为95-110min ;在17-18 °C时，第一次卵裂时间则为60-70min。所以，在培育过程中，即使细微的水温变化，也会使大菱鲆受精卵卵裂时间明显提前或延后。15 ± 0.1°C海水培育时其处理时刻在受精后80-90min ;水温下降1°C，大菱鲆受精卵第一次卵裂痕出现时间会延后IOmin以上，此时处理时刻应该是受精后90-100min，若仍按原来的处理时刻进行处理，则受精卵还未发育到预期程度就开始被处理；同理，若该期间水温升高而处理时刻不变，则受精卵将发育超过预期程度才开始被处理，这都直接影响了诱导效率，并导致诱导组孵化率降低。本发明根据提前15_25min受精的对照组受精卵第一次卵裂痕出现时间来确定诱导组处理时刻，在诱导组受精卵第一次卵裂痕出现前10-20min开始处理，间隔时间只有10_20min，大大短于按照受精时间计算处理时刻时80-90min的间隔时间，受到水温、气温等外界环境变化的影响较小。而且，受精卵的卵裂痕也很容易在解剖镜下观察到。
[0018]2.以往鲆鲽鱼类四倍体诱导方法中，孵育水温常是一个温度范围，如15_17°C，19-23°C等。如前文所述，即使细微的水温变化也会对受精卵的发育时序造成很大的影响，如此进行诱导，则无法准确确定处理时刻，使得诱导效果不稳定，重复性较差。而本发明充分考虑到水温会导致受精卵卵裂时间的变化，根据大菱鲆受精卵较适培育温度(13-18°C )，将处理前的培育水温固定在15±0.TC或其它特定的适宜温度下，使诱导组受精卵卵裂时间基本保持一致，诱导条件更加稳定，使其诱导率具有较好的重复性。
[0019]3.不同的鲆鲽鱼种中，最适的四倍体诱导条件往往会有很大的差别，以往国内外报道中，均未涉及大菱鲆四倍体诱导的相关参数。本发明首次对大菱鲆四倍体诱导的参数进行筛选优化，在保证处理时刻稳定的基础上，对处理压力强度和处理时间进行了优化，确定了最佳的处理参数范围；并按照本发明的操作过程可快速稳定的，得到大批量大菱鲆四倍体鱼苗，进而通过诱导获得的四倍体大菱鲆与二倍体杂交的方式，一劳永逸的进行三倍体育种，由此得到生长快、个体大、抗逆性强等特点的苗种。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1A为本发明实施例提供的原肠胚期大菱鲆四倍体诱导效果染色体中期分裂相的检测结果图，其中左为二倍体，右为四倍体。
[0021]图1B为本发明实施例提供的鱼苗期大菱鲆四倍体诱导效果流式细胞仪检测结果图，其中左为二倍体，右为四倍体。
[0022]图2A、B、C分别为大菱鲆四倍体批量诱导组发育情况图，其中A为原肠胚，B为初孵仔鱼和C为46天鱼苗。
【具体实施方式】
[0023]本发明对目前的海水鱼类四倍体人工诱导方法进行了优化，可更加准确的确定诱导的处理时刻，提高了诱导的稳定性，能够得到高比率的大菱鲆四倍体鱼苗，为生产和进一步的实验研究提供了材料和技术支持。
[0024]下面结合实施例详述本发明。
[0025]实施例1
[0026]本实施例受精时期、孵育时期以及诱导时期，三个时期所用海水温度为恒定的适宜大菱鲆卵受精及孵化的水温，即受精时期、孵育时期以及诱导时期三个时期海水温度均为 14.5±0.10Co
[0027]I)配子的采集
[0028]选取处于产卵产精盛期待产的亲鱼轻轻平放在软垫上，拭去其体表及生殖孔周围的水和污物，然后自后向前缓缓挤压，精卵分别挤入烧杯或者盆中备用。解剖镜下观察其卵呈圆球形，透明、油球集中、卵径适中、大小均一；其精液呈乳白色，浓度适宜，显微镜下加适量海水激活后精子活力高、游动时间长。
[0029]2)人工受精
[0030]对照组人工受精:
[0031]取0.1mL精液，用少许海水激活后，迅速倒入IOmL卵中，轻轻搅动使其混匀，再补充约IOmL海水。受精5min后，用新鲜海水反复冲洗数次以去掉多余精液，而后将受精卵放入盛有约50mL新鲜海水的容器中待用，并在期间补充约IOOmL同温新鲜海水。
[0032]批量诱导组人工受精:[0033]在对照组人工受精25min后，取1.5mL同批采集的精液，用少许海水激活后，迅速倒入150mL同批采集的卵中，轻轻搅动使其混匀。再补充约150mL海水，受精5min后，用新鲜海水反复冲洗数次以去掉多余精液，而后将受精卵放入盛有约800mL新鲜海水的容器中待用，并在期间补充约1500mL同温新鲜海水。
[0034]3)处理时刻的确定
[0035]人工受精后，用解剖镜随时观察对照组及诱导组的受精卵发育情况。发现对照组受精后103min时，70-80%受精卵刚刚开始出现第一次卵裂痕，记录为诱导组的第一次卵裂痕时间，
[0036]此时批量诱导组的处理时刻为第一次卵裂痕出现前20min，即受精后83min。
[0037]4)大菱鲆四倍体的诱导
[0038]在处理前Imin (受精后82min)左右时，将大菱鲆受精卵连海水转移至静水压机加压容器内，即将达到处理时刻时迅速将压力升至60MPa，处理Smin后泄压，取出受精卵，置于同温海水中继续培育。
[0039]5)受精率、孵化率的计算及倍性鉴定
[0040]受精率为发育到囊胚期卵数占全部上浮卵数的百分数；孵化率为初孵仔鱼数占全部上浮卵数的百分数。
[0041]取原肠胚进行染色体制片，计数其染色体数目，通过与二倍体对比确定是否为四倍体，大菱鲆二倍体染色体数2n=44，四倍体染色体数则为4n=88，由此计算四倍体比例；取初孵仔鱼及孵化后不同发育阶段的鱼苗，利用流式细胞仪测定其DNA含量，通过与二倍体对比确定是否为四倍体，并计算其四倍体比例(参见图1)。
[0042]本实施例中，批量诱导组共获得初孵仔鱼约11300尾，受精率为41.7%，孵化率为
11.3%，原肠胚期四倍体率为80%，初孵仔鱼期四倍体率为74%。
[0043]实施例2
[0044]本实施例受精时期、孵育时期以及诱导时期，三个时期所用海水温度为恒定的适宜大菱鲆卵受精及孵化的水温，即受精时期、孵育时期以及诱导时期三个时期海水温度均为 15.0±0.1°C。
[0045]I)配子的采集
[0046]选取处于产卵产精盛期待产的亲鱼轻轻平放在软垫上，拭去其体表及生殖孔周围的水和污物，然后自后向前缓缓挤压，精卵分别挤入烧杯或者盆中备用。解剖镜下观察其卵呈圆球形、透明、油球集中、卵径适中、大小均一；其精液呈乳白色，浓度适宜，显微镜下加适量海水激活后精子活力高、游动时间长。
[0047]2)人工受精
[0048]对照组人工受精:
[0049]取0.1mL精液，用少许海水激活后，迅速倒入15mL卵中，轻轻搅动使其混匀，再补充约30mL海水。受精5m in后，用新鲜海水反复冲洗数次以去掉多余精液，而后将受精卵放入盛有约IOOmL新鲜海水的容器中待用，并在期间补充约200mL同温新鲜海水。
[0050]批量诱导组人工受精:
[0051]在对照组人工受精20min后，取与对照组同批精卵进行受精、洗卵和孵育，精卵比例和方法同对照组。[0052]3)处理时刻的确定
[0053]人工受精后，用解剖镜随时观察对照组及诱导组的受精卵发育情况。发现对照组受精后95min时，70-80%受精卵刚刚开始出现第一次卵裂痕，记录为第一次卵裂时间，
[0054]此时批量诱导组的处理时刻为第一次卵裂痕出现前15min，即受精后80min。
[0055]4)大菱鲆四倍体的诱导
[0056]在处理前Imin (受精后79min)左右时，将大菱鲆受精卵连海水转移至静水压机加压容器内，即将达到处理时刻时迅速将压力升至67.5MPa，处理7min后泄压，取出受精卵，置于同温海水中继续培育。
[0057]5)受精率、孵化率的计算及倍性鉴定
[0058]受精率为发育到囊胚期卵数占全部上浮卵数的百分数；孵化率为初孵仔鱼数占全部上浮卵数的百分数。
[0059]取原肠胚进行染色体制片，计数其染色体数目，通过与二倍体对比确定是否为四倍体，大菱鲆二倍体染色体数2n=44，四倍体染色体数则为4n=88，由此计算四倍体比例；取初孵仔鱼及孵化后不同发育阶段的鱼苗，利用流式细胞仪测定其DNA含量，通过与二倍体对比确定是否为四倍体，并计算其四倍体比例。
[0060]本实施例中，批量诱导组共获得初孵仔鱼约50700尾，受精率为65.0%，孵化率为33.8%，原肠胚期四倍体率为85%，初孵仔鱼期四倍体率为88% (参见图2)。
[0061]实施例3
[0062]本实施例受精时期、孵育时期以及诱导时期，三个时期所用海水温度为恒定的适宜大菱鲆卵受精及孵化的水温，即受精时期、孵育时期以及诱导时期三个时期海水温度均为 15.5±0.1°C。
[0063]I)配子的采集
[0064]选取处于产卵产精盛期待产的亲鱼轻轻平放在软垫上，拭去其体表及生殖孔周围的水和污物，然后自后向前缓缓挤压，精卵分别挤入烧杯或者盆中备用。解剖镜下观察其卵呈圆球形、透明、油球集中、卵径适中、大小均一；其精液呈乳白色，浓度适宜，显微镜下加适量海水激活后精子活力高、游动时间长。
[0065]2)人工受精
[0066]对照组人工受精:
[0067]取0.15mL精液，用少许海水激活后，迅速倒入30mL卵中，轻轻搅动使其混匀，再补充约120mL海水。受精5min后，用新鲜海水反复冲洗数次以去掉多余精液，而后将受精卵放入盛有约300mL新鲜海水的容器中待用，并在期间补充约400mL同温新鲜海水。
[0068]批量诱导组人工受精:
[0069]在对照组人工受精15min后，取与对照组同批精卵进行受精、洗卵和孵育，精卵比例和方法同对照组。
[0070] 3)处理时刻的确定
[0071]人工受精后，用解剖镜随时观察对照组及诱导组的受精卵发育情况。发现对照组受精后88min时，70-80%受精卵刚刚开始出现第一次卵裂痕，记录为第一次卵裂时间。
[0072]此时批量诱导组处理时刻为第一次卵裂痕出现前lOmin，即受精后78min。
[0073]4)大菱鲆四倍体的诱导[0074]在处理前Imin (受精后77min)左右时，将大菱鲆受精卵连海水转移至静水压机加压容器内，即将达到处理时刻时迅速将压力升至70MPa，处理6min后泄压，取出受精卵，置于同温海水中继续培育。
[0075]5)受精率、孵化率的计算及倍性鉴定
[0076]受精率为发育到囊胚期卵数占全部上浮卵数的百分数；孵化率为初孵仔鱼数占全部上浮卵数的百分数。
[0077]取原肠胚进行染色体制片，计数其染色体数目，通过与二倍体对比确定是否为四倍体，大菱鲆二倍体染色体数2n=44，四倍体则为4n=88，由此计算四倍体比例；取初孵仔鱼及孵化后不同发育阶段的鱼苗，利用流式细胞仪测定其DNA含量，通过与二倍体对比确定是否为四倍体，并计算其四倍体比例。
[0078]本实施例中，批量诱导组共获得初孵仔鱼约35000尾，受精率为60.5%，孵化率为
17.5%，原肠胚期四倍体率为90%，初孵仔鱼期四倍体率为88%。
[0079]由上述结果表明，本发明操作过程简单快速，结果稳定、重复性好，可用于大菱鲆四倍体鱼苗的批量化诱导生产。进而通过诱导获得的四倍体大菱鲆与二倍体杂交的方式，一劳永逸的进行 三倍体育种。由此得到生长快、个体大、抗逆性强等特点的苗种。
【权利要求】
1.一种大菱鲆四倍体鱼苗的批量诱导方法，其特征在于: 1)大菱鲆人工受精: 选择性成熟的大菱鲆亲鱼，分别收集精液和卵，待用； 取上述精液与卵子按体积比1:100-200比例进行授精，作为对照组； 待对照组人工受精15~25min后，将上述采集的精液与卵子按体积比1:100-200比例进行授精，作为诱导组； 2)染色体诱导加倍 以对照组70-80%受精卵出现第一次卵裂痕的时间作为诱导组受精卵出现第一次卵裂痕的时间，在诱导组第一次卵裂痕出现前l(T20min，将步骤I)诱导组受精卵置于静水压机加压容器内，在6(T70MPa静水压下进行压力休克处理，处理6~8min后泄压，取出受精卵，置于海水中继续培育；而后在原肠胚期和鱼苗期测定四倍体率。
2.按权利要求1所述的大菱鲆四倍体鱼苗的批量诱导方法，其特征在于:所述步骤I)和步骤2)中受精时期、孵育时期以及诱导时期三个时期所用海水的温度为恒定的适宜大菱鲆卵生长所需水温。
3.按权利要求2所述的大菱鲆四倍体鱼苗的批量诱导方法，其特征在于:所述步骤I)和步骤2)中受精时期、孵育时期以及诱导时期，三个时期之间海水温度的温差在±0.1°C。
4.按权利要求1所述的大菱鲆四倍体鱼苗的批量诱导方法，其特征在于:所述将步骤I)诱导组受精卵置于静水压机加压容器内的时间为诱导组处理前Imin左右。
【文档编号】A01K61/00GK103960175SQ201310039710
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年1月31日 优先权日:2013年1月31日
【发明者】尤锋, 吴志昊, 胡金伟, 马得友, 谭训刚, 张培军 申请人:中国科学院海洋研究所