急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征动物模型及用途
【专利摘要】本发明涉及一种急性髓细胞白血病(AML)和骨髓增生异常综合征(MDS)的动物模型，以及斑马鱼突变体在制备该动物模型中的用途，其中该动物模型包括斑马鱼Pu.1基因编码的蛋白序列的第242位的甘氨酸被天冬氨酸取代的pu.1G242D突变体；还涉及上述动物模型在筛选对AML和MDS有效的药物中的用途；以及利用上述动物模型筛选对AML和MDS有效的药物的方法。
【专利说明】急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征动物模型及用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征的动物模型，特别是针对Pu.1基因突变所诱导的急性髓细胞白血病和/或人类骨髓增生异常综合征的动物模型，以及该动物模型在筛选药物中的用途。
【背景技术】
[0002]急性髓细胞白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是白血病的一种。具体来说，急性髓细胞白血病是一种急性非淋巴细胞白血病，包括所有非淋巴细胞来源的急性白血病。同时，急性髓细胞白血病是成年人最常见的一种白血病，其特点是骨髓内异常白细胞的快速增生和累积，从而影响了正常造血细胞的产生。急性髓细胞白血病的发病率随着人的年龄而增加。虽然与其他类型的癌症相比，急性骨髓性白血病较为罕见，但在过去的几十年中，当更好的诊断测试、成像技术和治疗方法已经大幅度降低了其他类型癌症的死亡率时，急性髓细胞白血病患者的五年生存率却并没有提高。
[0003]骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes, MDS),是一组血液的异质性疾病，是由于骨髓细胞无效性增生(或不典型增生)所导致的血液病。MDS患者的造血干细胞不能成熟为正常的红细胞、白细胞或者血小板。而不能成熟的血细胞(原始细胞)则不能正常工作，之后在骨髓中凋亡或进入血液中。由于这种不成熟的血细胞对空间的占用导致正常的红细胞、白细胞减少，而后患者会出现感染，贫血，出血症状。在大多数情况下，这种疾病最终会发展成由骨髓的造血功能衰竭所引起的血细胞减少症。大约三分之一的MDS患者，经过几个月到几年的时间，发展成为急性骨髓性白血病。
[0004]因此，在本领域存在着对急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征的研究和治疗进展的迫切需求。
[0005]迄今，本领域的研究人员已经鉴定了一系列涉及急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征的发病机制的基因，例如，Scl、lmo2、Pu.1、gata2、ASXL、Bcl_2等；也证实了这些不同的基因诱导或参与了白血病。例如，PU.1作为Ets转录因子家族中的一员，在早期髓系祖细胞产生过程中起作用[1，2]，是决定髓系向单核细胞还是向粒细胞分化的重要因子[3-5]。在对126个急性髓细胞白血病病人的调查中发现，有7%病人的Pu.1基因发生突变，Pu.1基因的表达水平下调[7-9]。类似地，在成年小鼠体内，PU.1的失活会导致粒细胞系细胞的增多[14]。这些研究结果表明，在人类和小鼠中，PU.1都参与了髓细胞生成过程。
[0006]但是，针对急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征的生理机制和治疗的研究，特别是后者，仍缺乏根本性的进展。主要原因之一是，绝大多数诱导或参与了急性髓细胞白血病或骨髓增生异常综合征的基因的突变体的存活期短，甚至不能发育到成年。这使得对涉及这两种疾病的基因的研究通常仅集中在细胞层面。 [0007]近年来，利用动物模型来研究疾病的发病机理和治疗手段越来越多地引起了研究者的注意。在对各种疾病的研究中，通过疾病的动物模型，研究人员可以进一步研究该疾病的机理(例如，大鼠原发性高血压[22]、小鼠的老年性骨质疏松[23]等)。然而，小鼠/大鼠的生理周期长，饲养成本高，特别是难以直接活体观察药物的药效。
[0008]另一方面，由于斑马鱼独特的优势，例如繁殖能力强、体外受精和发育、胚胎透明、性成熟周期短、个体小易养殖等诸多特点，特别是可以进行大规模的正向基因饱和突变与筛选，在脊椎动物发育机制的研究中起着重要的作用。同时，作为一种在基因层面易操作的生物系统，随着TALEN(transcription activator-like (TAL) effector nucleases)祀向基因敲除等技术的成熟，斑马鱼已经被越来越多地应用于发育生物学和人类疾病包括恶性肿瘤等的研究中[10]。
[0009]本申请的发明人曾经报道过一个发生在斑马鱼的Pu.1基因的点突变(pu.1g242d)，该突变使得PU.1蛋白活性降低；并且实验结果表明斑马鱼的Pu.1基因在胚胎期参与了髓细胞的命运决定[5]。但是，并不清楚该突变体的病理表型以及病理发展过程，更不清楚这样的突变体是否能够作为急性髓细胞白血病和人类骨髓增生异常综合征的动物模型，特别是针对Pu.1基因突变所诱导的急性髓细胞白血病和/或人类骨髓增生异常综合征的动物模型。
【发明内容】
[0010]本发明提供一种动物模型在筛选对急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征有效的药物中的用途，其中所述动物模型包括斑马鱼Pu.1基因编码的蛋白序列的第242位的甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)取代的pu.le242D突变体。在一些优选的实施方案中，所述急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征在阿糖胞苷治疗后症状缓解。在一些优选的实施方案中，所述急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征是由人类Pu.1基因的突变引起。具体来说，所述筛选可以包括以下步骤:(a)以不同浓度的备选药物处理受精后一到三天、优选一天的斑马鱼胚胎，根据胚胎存活情况确定胚胎安全范围内的最高药物浓度；(b)以确定的所述胚胎安全 范围内的最高药物浓度的所述备选药物对受精后一到三天、优选一天的PU.le242D突变体斑马鱼和野生型同胞鱼处理二到四天、优选四天；以及(C)观察比较处理后的所述Pu.1g242d突变体斑马鱼和野生型同胞鱼的血液表型，以确定所述备选药物对急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征的治疗效果，所述处理后的Pu.1g242d突变体斑马鱼和野生型同胞鱼处于受精后三到七天、优选五天的时期。优选地，所述血液表型可以包括髓细胞或粒细胞数目。优选地，所述血液表型可以通过进行苏丹黑染色来观察。
[0011]本发明还提供一种利用动物模型来筛选对急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征有效的药物的方法，其中所述动物模型包括斑马鱼Pu.1基因编码的蛋白序列的第242位的甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)取代的pu.le242D突变体，所述方法包括以下步骤:(a)以不同浓度的备选药物处理受精后一到三天、优选一天的斑马鱼胚胎，根据胚胎存活情况确定胚胎安全范围内的最高药物浓度；(b)以确定的所述胚胎安全范围内的最高药物浓度的所述备选药物对受精后一到三天、优选一天的PU.1g242d突变体斑马鱼和野生型同胞鱼处理二至幌天、优选四天；以及(C)观察比较处理后的所述pu.1g242d突变体斑马鱼和野生型同胞鱼的血液表型，以确定所述备选药物对急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征的治疗效果，所述处理后的Pu.1g242d突变体斑马鱼和野生型同胞鱼处于受精后三到七天、优选五天的时期。在一些优选的实施方案中，所述急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征在阿糖胞苷治疗后症状缓解。在一些优选的实施方案中，所述急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征是由人类Pu.1基因的突变引起。优选地，所述血液表型可以包括髓细胞或粒细胞数目。优选地，所述血液表型可以通过进行苏丹黑染色来观察。
[0012]本发明还提供一种斑马鱼突变体在制备急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征的动物模型中的用途，其中所述斑马鱼突变体是斑马鱼Pu.1基因编码的蛋白序列的第242位的甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)取代的pu.le242D突变体。在一些优选的实施方案中，所述急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征在阿糖胞苷治疗后症状缓解。在一些优选的实施方案中，所述急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征是由人类Pu.1基因的突变引起。
[0013] 本发明还提供一种急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征的动物模型，其中所述动物模型是利用斑马鱼Pu.1基因编码的蛋白序列的第242位的甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)取代的pu.le242D突变体。所述急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征可以是由人类Pu.1基因的突变引起。
[0014]本文所使用的术语“dpf”指受精后的天数。举例来说，“3dpf”指受精后三天，“8dpf”指受精后八天。
[0015]本文所使用的术语“pu.1G242D”指斑马鱼Pu.1基因编码的蛋白序列的第242位的甘氨酸被天冬氨酸取代的突变。举例来说，“pu.1g242d突变体”指斑马鱼Pu.1基因编码的蛋白序列的第242位的甘氨酸被天冬氨酸取代的突变体。
[0016]本文所使用的术语“野生型”或者“WT ”都是指野生型AB系斑马鱼。
[0017]本文所使用的术语“同胞鱼”是指由同一双亲的后代个体。
[0018]本文所使用的术语“安全范围内的最高药物浓度”是指在外来化合物实验中，化学物质不引起受试对象(实验动物,例如斑马鱼)出现死亡的最高剂量。
[0019]本文所使用的术语“增生”是指通过细胞分裂增加细胞数量的过程。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1示出斑马鱼pu.1g242d突变体中从胚胎到成年鱼的不成熟髓系细胞的增生，其中:
[0021]图1A-图1E示出3dpf的野生型(WT，左栏)和突变体(pu.le242D，右栏)斑马鱼胚胎的整体原位杂交的结果:cebp a (A)、cebpl (B)、Iyz (C)、mpx(D)以及mfap4(E);每栏右侧示出左侧图像中长方形小框内的CHT区域放大(20X)之后的细节(Fisher检验，P <0.001)；
[0022]图1F示出3dpf的野生型(WT，左栏)和突变体(pu.1g242d,右栏)斑马鱼胚胎的SB染色结果。分别针对野生型(WT，左栏)和突变体(PU.le242D，右栏)，左侧图像中的长方形小框内的CHT区域在右下区域示出20X放大之后的细节，并且在每栏的右侧区域示出100X放大之后的细节(Fisher检验，P≤0.001)。
[0023]图1G示出用Cy3_tyramide检测3dpf的野生型(WT,左栏)和突变体(pu.1g242d,右栏)斑马鱼胚胎中CHT区域内源性过氧化物酶活力(peroxidase activity),箭头表示具有过氧化物酶活性的中性粒细胞。
[0024]图1H示出Sdpf的野生型(WT，左栏)和突变体(pu.1g242d,右栏)斑马鱼胚胎的SB染色，每栏右侧示出左侧图像中长方形小框内肾脏区域放大(20X)之后的细节(Fisher检验，P ≤ 0.001)。
[0025]图11-图1L示出18个月的野生型(WT，左栏)和突变体(pu.le242D，右栏)斑马鱼的全肾髓(KM)血细胞(图1I)和外周血(PB)细胞(图1K)的MGG染色。短箭头(▲):祖细胞；箭头(丨):髓系细胞；星号(*):淋系细胞。放大倍数是100X。分别对野生型鱼(灰色栏)和Pu.1g242d鱼(黑色栏)的肾髓血细胞(图1J)和外周血细胞(图1L)进行血细胞计数。星号代表统计学差异(t检验，n ^ 9，均数土标准差，*Ρ ( 0.05)。
[0026]图2示出斑马鱼pu.le242D突变体中高度增生的髓系细胞对化学疗法的有效反应。
[0027]图2A-图2B示出细胞周期和细胞凋亡的检测结果。图2A示出TUNEL和Iyz-DsRed双染的细胞，统计分析在CHT区域Iyz+髓系细胞与TUNEL共染的百分比(t检验，η = 10，均数土标准差，P = 0.304，无统计学差异)；图2Β示出统计分析Iyz+髓系细胞的Brdu阳性百分比(t检验，η = 10，均数土标准差，#Ρ ( 0.01)。
[0028]图2C示出5dpf的野生型(WT，左栏)和突变体(pu.1g242d,右栏)斑马鱼的cebpl的整体原位杂交结果(Fisher检验，P^0.001)。
[0029]图2D-图2G示出pu.1g242d突变体对化疗药物的反应。图2D-图2F:分别利用PBS (对照组，图2D)、ara-C(图2E)和DNR(图2F)处理Idpf的野生型(WT，左栏)和突变体(pu.le242D，右栏)斑马鱼，处理4天；随后对处理后的斑马鱼(5dpf)进行SB染色的结果；每张图下方的大方框区为上图中长方形小框内的CHT区域的放大图(放大倍数是20X)。图2G示出对照组与药物处理组的斑马鱼中SB+细胞的平均数量的统计结果。灰色栏代表野生型(WT)，黑色栏代表pu.1g242d突变体(t检验，n ^ 18,均数土标准差，*Ρ < 0.05，**Ρ< 0.01)。
【具体实施方式】
[0030]以下通过对实验工作的实施例，对本发明进行进一步的阐述。应理解，这些实施例仅用于进一步说明本发明，而非用于限定本发明的范围。
[0031]在下述各实施例中，野生型AB系斑马鱼和pu.1g242d斑马鱼的喂养方法皆为本领域的常规喂养方法(参见[12，13]);所使用的PBS是按照如下方法配置:将8g NaCU0.2gKCl、1.44g Na2HP04和0.24g KH2PO4溶于800mL蒸馏水中，然后将pH值用30 %的浓盐酸调整至7.4，加水定容至IL ;所使用的PBST是在上述PBS中加入0.1%的吐温20。
[0032]实施例1:pu.1g242d突变体中粒细胞源性的髓系细胞增加
[0033]如前所述，已知Pu.1参与斑马鱼的髓细胞生成过程。为了进一步研究斑马鱼的PU.1e242D突变体在定向髓系细胞发育过程中的作用，进行了以下实验，其中:整体原位杂交(Who I e-mount in situ hybridization, WISH):地高辛标记的反义 RNA 探针和 WISH 都是在标准的实验操作流程指示下完成[13]，图片是用尼康AZ100显微镜拍摄；苏丹黑(SudanBack B, SB)染色为本领域常规化学染色方法，苏丹黑可将细胞中的脂肪、磷脂及胆固醇等脂类染成棕黑色颗粒。苏丹黑染色的具体方法如下:1)苏丹黑B保存液:苏丹黑B0.15g溶于50mL无水酒精；2)碳酸磷酸缓冲液:石碳酸(phenol)结晶Sg溶于无水酒精15mL，磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H20)0.15g溶于蒸馏水50mL，然后将上述两种溶液混合溶解即为缓冲液；3)苏丹黑B染色液:苏丹黑B保存液30mL，碳酸磷酸缓冲液20mL，混合过滤即可使用。室温避光染色40min，70 %乙醇洗脱，大致2_3h (参见[14])，在本发明中SB+表示SB染色阳性。
[0034]首先，通过WISH检测了 3dpf的野生型和pu.1g242d突变体斑马鱼的胚胎中CCAAT/增强子结合蛋白a (cebp α )的表达。cebp α是早期髓系细胞特异性的标记物，存在于斑马鱼髓系定向造血发生的时期[11]。使用的反义RNA探针的序列是Ensembl IDENSDARG00000052366的cDNA序列的300bp_2126bp。实验结果显示在图1A中，与野生型相比，3dpf 的 pu.1g242d 突变体胚胎的尾部造血组织(caudal hematopoietic tissue (CHT),相当于哺乳动物胎肝的造血器官)[12]中，cebpa的表达明显增加，这表明髓系细胞数量增多。
[0035]在此基础上，通过WISH分别检测3dpf的野生型和pu.1g242d突变体斑马鱼的胚胎中，粒细胞标记基因 cebpl [15] > myeloperoxidase (mpx) [16]和 lysozyme C (lyz [17]的表达情况。检测这三个标记基因所使用的反义RNA探针的序列分别是:cebpl:Ensembl IDENSDARG00000066522 的 cDNA 序列的 3bp_600bp ；mpx =Ensembl ID ENSDARG00000043961的 cDNA 序列的 44bp-2325bp ；lyz =Ensembl ID ENSDARG00000057789 的 cDNA 序列的lbp-569bp。实验结果分别显示在图1B-图1D中，与野生型相比，在3dpf的pu.1g242d突变体的胚胎的CHT区域，上述三种标记基因的表达都增加，这表明了 pu.le242D突变体中粒细胞明显增生。
[0036]与此同时，还通过WISH检测了 3dpf的野生型和pu.1g242d突变体斑马鱼的胚胎中mfap4[18]的表达。mfap4是巨噬细胞的特异性标记基因。使用的反义RNA探针的序列是Ensembl ID ENSDARG00000100199 的 cDNA 序列的 lbp_990bp。实验结果显示在图1E 中，与野生型相比，在3dpf的pu.1g242d突变体的胚胎的CHT区域，mfap4的表达降低，这表明Pu.le242D突变体胚胎中巨噬细胞数目降低。由此进一步证明了 pu.le242D突变体胚胎中增生的髓系细胞是粒细胞源性的。
[0037]同时，还对3dpf的野生型和pu.1g242d突变体斑马鱼进行了 SB染色，并重点观察CHT区的染色结果[19]。如图1F所示，与野生型相比，大多数pu.le242D突变体CHT区域的SB信号小而微弱。结合ce bpl主要在未成熟的粒细胞中表达[5]的事实，SB染色结果表明这些cebpl+SB+的髓细胞是未成熟的粒细胞。
[0038]为了验证这一结论，对中性粒细胞特异性髓过氧化物酶(myloperoxidase, mpx)的活力(peroxidase activity)进行测定,测定过程如下:将斑马鱼用4%甲醒固定约2小时，然后用 PBS 洗漆 4 次，每次 5 分钟；加入 tyramide-f Iuscencin (1:1OOin PBS) >0.001 %H2O2和0.1M咪唑(imdazole)，在黑暗中染色约20min ;然后用PBST洗涤3次，每次10分钟；最后加入2%的H2O2 (在PBST中)终止反应。实验结果显示在图1G中，结果表明，与野生型相比，在pu.le242D突变体中过氧化物酶的活力显著降低，这说明增生的中性粒细胞是不成熟的。
[0039]上述实验结果表明，在pu.1g242d突变体中，血细胞中不成熟的髓系细胞增生与MDS和AML相应的血液表型一致。
[0040]实施例2:斑马鱼pu.1g242d突变体模拟MDS和AML表型
[0041]通过在Sdpf的野生型和pu.1g242d突变体斑马鱼的肾髓中进行SB染色(染色方法参见实施例1)，观察到在定向造血早期，大部分增加的髓系细胞被限制在突变体斑马鱼的肾脏中(参见图1H)。肾髓为成年斑马鱼的造血器官，相当于哺乳动物的骨髓[12]。幸运的是，pu.1g242d突变体可以活到成年并具有相对正常的行为，使得可以检测pu.1g242d突变体斑马鱼从胚胎到成年不同阶段的血液学组分。[0042]对18个月的pu.le242D突变体及其野生型同胞鱼进行肾髓和外周采血，然后通过瑞姬氏(May-Grunwald Giemsa, MGG)染色(默克公司，Merck)来进行细胞学分析,结果示于图11-图1L。肾髓采血是通过在显微镜下用手术镊和手术剪取出斑马鱼的肾脏组织，将其放入含5%胎牛血清的PBS溶液中，随后进行用细胞甩片机(Thermo scientificcytospin4)进行细胞甩片，将肾髓细胞均匀甩至载玻片上。外周血(peripheral blood,PB)采血是用10 μ L肝素化的玻璃微量血细胞比容管通过鳃穿刺(gill puncture)获取成年斑马鱼的外周血。获取的肾髓血或者外周血接着进行MGG染色。MGG染色是使用包括天青和伊红的瑞姬氏染液，胞衆染粉红色，细胞核染紫蓝色。加ImL瑞氏染液(May-grunwaldsolution)(瑞氏染液:甲醇=1: 3)到载玻片上.染色I分钟；用流水彻底冲洗，再加入ImL姬姆萨(Giemsa)染液(姬姆萨:PBS = 1: 20)到载玻片上进行染色15-30分钟后用流水缓慢冲洗，干燥后观察(瑞氏染液，默克公司(Merck)，货号:1.01424;姬姆萨，默克公司(Merck)，货号:1.09204.0500)。
[0043]实验结果表明，在成年pu.le242D突变斑马鱼的肾髓中，增生的髓系细胞聚集，而外周血中并没有这种表型(参见图11-图1L)。
[0044]具体来说，通过血细胞的形态和染色的不同，人工将血细胞分为祖细胞、淋巴细胞、红细胞以及白细胞并且计数。计数结果表明，如图1I和图1J所示，与野生型相比，在18个月的pu.1g242d突变体斑马鱼的肾髓血中，髓系细胞增加了 23%，淋系细胞减少了 20%。同时，染色结果表明18个月的pu.le242D突变体斑马鱼的肾髓血中累积的髓系细胞大多数都是未成熟的髓系细胞(参见图1I)。此外，与野生型相比，在18个月的pu.le242D突变体斑马鱼的外周血中，不成熟的髓系细胞数量也有累积(参见图1K和图1L)。统计结果在表1中示出。
[0045]表1在pulG242D突变体和WT对照组的肾脏血和外周血中细胞系的分布
[0046]
【权利要求】
1.一种动物模型在筛选对急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征有效的药物中的用途，其中所述动物模型包括斑马鱼Pu.1基因编码的蛋白序列的第242位的甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)取代的pu.1g242d突变体。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征在阿糖胞苷治疗后症状缓解。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征是由人类Pu.1基因的突变引起。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述筛选包括以下步骤: (a)以不同浓度的备选药物处理受精后一至三天的pu.1g242d突变体斑马鱼胚胎，根据胚胎存活情况确定胚胎安全范围内的最高药物浓度； (b)以确定的所述胚胎安全范围内的最高药物浓度的所述备选药物对受精后一至三天的pu.1g242d突变体斑马鱼和野生型同胞鱼处理两至四天；以及 (c)观察比较处理后的所述pu.1g242d突变体斑马鱼和野生型同胞鱼的血液表型，以确定所述备选药物对急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征的治疗效果，所述处理后的Pu.1g242d突变体斑马鱼和野生型同胞鱼处于受精后三至七天的时期。
5.如权利要求4所述的用途，其中所述步骤(a)中的所述pu.le242D突变体斑马鱼胚胎是受精后一天的PU.1g242d突变体斑马鱼胚胎。
6.如权利要求5所述的用途，其中所述步骤(b)是以确定的所述胚胎安全范围内的最高药物浓度的所述备选药物对受精后一天的Pu.le242D突变体斑马鱼和野生型同胞鱼处理四天；以及所述步骤(c)中的所述处理后的pu.le242D突变体斑马鱼和野生型同胞鱼处于受精后五天的时期。
7.如权利要求4所述的用途，其中所述血液表型包括髓细胞或粒细胞数目。
8.如权利要求4所述的用途，其中所述血液表型是通过进行苏丹黑染色来观察。
9.一种利用动物模型来筛选对急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征有效的药物的方法，其中所述动物模型包括斑马鱼Pu.1基因编码的蛋白序列的第242位的甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)取代的pu.1g242d突变体，所述方法包括以下步骤: (a)以不同浓度的备选药物处理受精后一至三天的斑马鱼胚胎，根据胚胎存活情况确定胚胎安全范围内的最高药物浓度； (b)以确定的所述胚胎安全范围内的最高药物浓度的所述备选药物对受精后一至三天的pu.1g242d突变体斑马鱼和野生型同胞鱼处理二天至四天；以及 (c)观察比较处理后的所述pu.1g242d突变体斑马鱼和野生型同胞鱼的血液表型，以确定所述备选药物对急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征的治疗效果，所述Pu.le242D突变体斑马鱼和野生型同胞鱼处于受精后三到七天的时期。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述步骤(a)中的所述pu.le242D突变体斑马鱼胚胎是受精后一天的PU.1g242d突变体斑马鱼胚胎。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中所述步骤(b)是以确定的所述胚胎安全范围内的最高药物浓度的所述备选药物对受精后一天的pu.le242D突变体斑马鱼和野生型同胞鱼处理四天；以及所述步骤(c)中的所述处理后的pu.le242D突变体斑马鱼和野生型同胞鱼处于受精后五天的时期。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征在阿糖胞苷治疗后症状缓解。
13.如权利要求9所述的用途，其中所述急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征是由人类Pu.1基因的突变引起。
14.如权利要求9所述的方法，其中所述血液表型包括髓细胞或粒细胞数目。
15.如权利要求10所述的方法，其中所述血液表型是通过进行苏丹黑染色来观察。
16.一种斑马鱼突变体在制备急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征的动物模型中的用途，其中所述斑马鱼突变体是斑马鱼Pu.1基因编码的蛋白序列的第242位的甘氨酸(G)被天冬氨酸(D)取代的pu.1g242d突变体。
17.如权利要求16所述的用途，其中所述急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征在阿糖胞苷治疗后症状缓解。
18.如权利要求16所述的用途，其中所述急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征是由人类Pu.1基因的突变引起。
19.一种急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征的动物模型，其中所述动物模型包括斑马鱼Pu.1基因编 码的蛋白序列的第242位的甘氨酸(G)被天冬氨酸⑶取代的pu.1g242d 突变体。
【文档编号】A01K61/00GK103977424SQ201310050870
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2013年2月8日 优先权日:2013年2月8日
【发明者】张文清, 温子龙, 徐进, 张译月, 刘伟 申请人:南方医科大学