一种抗草甘膦转基因水稻的制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种抗草甘膦转基因水稻的制备方法。该方法是将草甘膦抗性基因通过表达载体转化农杆菌，利用该农杆菌侵染水稻愈伤组织，将愈伤组织转移到含草甘膦的选择培养基上进行筛选，挑选抗性愈伤，经分化、生根、炼苗、移栽，得到对草甘膦具有抗性的转基因水稻，分子鉴定结果显示外源基因已稳定地表达。本发明得到的抗草甘膦转基因水稻除了带有抗草甘膦除草剂基因外，不含其它筛选标记基因，可作为商品化抗除草剂水稻品种，减少后期流程，加快育种步伐。本发明方法操作简便、转基因植株拷贝数低，遗传性状稳定，具有良好的市场应用前景。
【专利说明】—种抗草甘膦转基因水稻的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物转基因【技术领域】，具体地，涉及一种抗草甘膦转基因水稻的制备方法。
【背景技术】
[0002]稻田杂草与水稻在水、肥、生长空间上进行竞争，直接影响水稻的产量。近年来直播和抛秧等栽培方法的使用，使得稻田的杂草危害变得日益严重；特别是新型稻田杂草一杂草稻一的出现，给稻田除草提出了难题。另外，随着农村人口往城市迁移速度的加快，水稻种植的规模化和机械化是一个可预见的趋势，这使得传统的人工除草的方法变得不现实。施用除草剂是解决这些新出现的问题的最佳方案之一，因此，抗除草剂水稻将具有非常大的实际需求和市场潜力。
[0003]草甘膦(glyphosate)别名N-(膦羧甲基)甘氨酸；农达(Roundup);镇草宁；膦甘酸，是一种非选择性、无残留、灭生性除草剂，对多年生根杂草非常有效，广泛用于橡胶、桑、茶、果园及甘蔗地。施用草甘膦后，进入植物体内的草甘膦分子与磷酸烯醇丙酮酸竞争性地结合EPSPS (5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶)的活性位点，终止了芳香族氨基酸的合成途径，造成苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等氨基酸的缺乏，最终导致植物死亡。利用源于细菌、植物抗性细胞系的Epsps基因可以大大提高植物对草甘膦的耐受性。在转基因抗除草剂作物的研制中，最负盛名、推广面积最大、经济效益最高的是抗草甘膦作物。现已研制成功的抗草甘膦作物有:大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜、水稻、烟草、花生、番茄、马铃薯、向日葵、胡萝卜、洋葱、春小麦、苜蓿、波菜、南瓜、百脉根等20多种植物。由于抗草甘膦作物在世界各地的推广与大面 积种植，影响了除草剂新品种的筛选与开发、世界除草剂销售市场以及食品工业，还引起了作物栽培方式及耕作制度的深刻变革。可以预见其耐性基因工程的市场前景广阔(Wang X J, Lang Z H, Shan A S，Huang D F.Advances in mechanism ofherbicide inhibiting amino acid biosynthesis and herbicide-tolerant transgenicplants.China Biotechnology，2008，28 (2):110-116.)
[0004]目前的水稻遗传转化方法主要是用以潮霉素为筛选剂的农杆菌介导法。例如HieiY,Ohta S，Komori T.Efficient transformation of rice(0ryza sativa L.)mediatedby Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries ofthe T-DNA.[J]PlantJournal, 1994 (6)，通过潮霉素筛选，获得粳稻“越光”的转基因植株；沈革志，张建军，殷丽青，等.根癌农杆菌介导Ds转座因子的水稻遗传转化[J].上海农业学报.1998 (04)；刘巧泉，等.根癌农杆菌介导的水稻高效转化系统的建立[J].植物生理学报.1998 (03)获得“中花11”的转基因植株；孙建昌，马静，何玉科，等.农杆菌介导法转化宁夏水稻的研究[J].宁夏农林科技.2009 (01)，获得“优育28”的转基因植株。但是利用该筛选方法培育出的转基因水稻会带入多余的筛选标记基因，给未来的品种应用带来麻烦。也有少量转化方法以Bar基因作为筛选标记基因，用除草剂草丁膦作为筛选剂得到抗草丁膦的转基因水稻植株。例如文献【黎垣庆，刘刚，严文贵，等.转bar基因水稻除草剂抗性遗传研究及其应用[J].杂交水稻2000 (01)、查中萍，万丙良，殷得所，等.农杆菌介导的氮高效利用转基因水稻植株的获得[J].湖北农业科学.2011 (24)】。相对于草丁膦，草甘膦具有价格便宜，在土壤中易分解、无残留，对生态环境的潜在影响小等优点，从而成为了世界范围内施用面积最大的除草剂，这也为抗草甘膦除草剂作物的培育提出了更高的要求，迫切需要一种大规模商业化生产抗草甘膦水稻的方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种抗草甘膦转基因水稻的制备方法。
[0006]本发明通过以下技术方案实现:构建包含草甘膦抗性基因Epsps-1和Epsps-2的遗传转化载体，通过农杆菌介导的遗传转化方法、以草甘膦作为筛选剂，成功地将草甘膦抗性基因转入到水稻愈伤组织中，并培育出抗草甘膦除草剂的转基因水稻植株，借助PCR方法分析鉴定阳性转基因植株，Southern Blot方法鉴定外源基因拷贝数,试纸条检测Epsps-1或Epsps-2蛋白表达情况,分子鉴定结果显示外源基因已稳定地表达。
[0007]本发明提供的抗草 甘膦转基因水稻的制备方法，包括以下步骤:
[0008](I)将含草甘膦抗性基因的表达载体转化入农杆菌中；
[0009](2)将步骤(1)的农杆菌菌液侵染水稻的胚性愈伤组织；
[0010](3)将步骤(2)的愈伤组织转移到添加了草甘膦的选择培养基上进行筛选，挑选抗性愈伤组织；
[0011](4)将抗性愈伤组织转入分化培养基分化，将分化形成的再生小苗转入生根培养基中培养，幼苗生根后炼苗、移栽，得到抗草甘膦转基因水稻。
[0012]其中，步骤(1)所述的表达载体为pZZOOOll或pZZOOOl3。
[0013]进一步地，所述pZZOOOll载体的构建方法为:合成Epsps-1基因，序列如SEQID N0.1所示；将Epsps-1基因与PU130载体该载体为pCambia3300的衍生载体，其构建过程是:pCambia3300经XhoI和HindIII酶切处理，用Pubi取代P35s_Bar部分得到PU130。分别用BamHI和SacI酶切，将酶切后的Epsps-1基因与PU130载体连接，得到中间载体 Pub1-Epsps-1-35spolyA,即 pZZ00002 ;分别用 Hind III 和 PmeI 对 pZZ00002 和P35s-gfp-35spolyA进行双酶切，再将酶切后的二者连接，转化大肠杆菌感受态细胞得到遗传转化载体PZZ00011。
[0014]进一步地，所述pZZ00013载体的构建方法为:合成Epsps-2基因，序列如SEQ IDN0.2所示；将Epsps-2基因与PU130载体分别用BamHI和SacI酶切，将酶切后的Epsps-1基因与PU130载体连接，得到中间载体Pub1-Epsps-2-35spolyA，即pZZ00003 ;分别用HindIII和PmeI对pZZ00003和P35s-gfp-35spolyA进行双酶切，再将酶切后的二者连接，转化大肠杆菌感受态细胞得到遗传转化载体PZZ00013。
[0015]在pZZOOOll和pZZ00013载体的构建方法中，所述的P35s-gfp-35spolyA是以pCambial381载体为模板，以SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所示的核苷酸序列为上、下游引物，通过PCR方法扩增得到的。
[0016]PCR 扩增 P35s-gfp_35spolyA 的 50 μ L 反应体系为:10 X La Taq Buffer5 μ L,
2.5mM dNTP4 μ L,上、下游引物各 I μ L，pCambial381 模板 I μ L，LA Taq0.5 μ L,ddH2037.5 μ L0[0017]反应条件为:95°C, 5min ；95 °C，40s，55 °C，40s，72 °C，2min，25 个循环；72 °C,10min，4°C保存。1%琼脂糖凝胶回收P35s-gfp_35spolyA片段。
[0018]Hind ΙΙΙ/PmeI 酶切回收 PCR 片段和质粒 pZZ00002 (Pub1-Epsps-l_35spolyA)或PZZ00003 (Pub1-Epsps-2-35spolyA)，体系为:10XNEB4,10 μ L ； 100XBSAl μ L ；Hind III，
2μ L ；PmeI,2 μ L ；PCR片段或质粒5-10 μ L ;加灭菌ddH20至总体系100 μ L。酶切条件为37°C,3-5h0
[0019]使用QIAGEN PCR Purifcation Kit试剂盒纯化回收目标片段。
[0020]连接上述两个酶切片段(P35s-gfp-35spolyA片段和pZZ00002或pZZ00003)，体系为:10Xligase buffer, 2 μ L ;长片段 I μ L ;短片段 7 μ L ；ligase, I μ L ;加 ddH20 至总体系20 μ L0连接条件为16°C，2-4h。
[0021]热激转化大肠杆菌感受态细胞(DH5 α )得到遗传转化载体ρΖΖΟΟΟΙ 1/ρΖΖ00013，并将遗传转化载体转化入农杆菌中，进行测序分析，结果显示该农杆菌中含有Epsps-1基因或Epsps-2基因。
[0022]本发明方法中，所述的选择培养基以N6为基本培养基，并添加2.5mg/L的2，4_D，250mg/L羧苄青霉素和草甘膦。
[0023]进一步地，选择培养基中草甘膦的终浓度为8(T300mg/L。
[0024]本发明制备抗草甘膦转基因水稻的方法中，应用的农杆菌为EHA105。
[0025]优选地，本发明方法中所述的水稻为粳稻。
[0026]更优选地，所述的粳稻为空育131和/或R187。
[0027]本发明方法利用草甘膦作为筛选剂，培育出的水稻品种除了带有抗草甘膦除草剂的基因外不含有其它的筛选标记基因，可以直接作为抗除草剂的品种进行商业化生产，极大地减少了后期的流程，加快了育种步伐。本发明方法具有效率高、操作简便、转基因植株拷贝数低、遗传性状稳定等优点，为大规模商业化生产抗草甘膦水稻提供了可能。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为遗传转化载体的T-DNA区示意图，其中图1A为Epsps-1基因遗传转化载体(pZZOOOll)的T-DNA区示意图；图1B为Epsps-2基因遗传转化载体(pZZ00013)的T-DNA区示意图。
[0029] 图2转基因植株中外源基因(GFP)在组织中的表达图。图2A为外源基因(GFP)在转化粳稻根部的表达图；图2B为外源基因(GFP)在转化粳稻叶部的表达图。a:含Epsps-1的载体转化空育131得到的苗；b:含Epsps-2的载体转化空育131得到的苗；c:野生型空育131 ；d:含Epsps-1的载体转化R187得到的苗；e:含Epsps-2的载体转化R187得到的苗；f:野生型R187
[0030]图3转基因植株中外源基因(Epsps-1/Epsps-2)PCR扩增结果图。图3A =Epsps-1基因转化粳稻品种空育131所得到的部分转基因植株PCR扩增图；图3B:Epsps-2基因转化粳稻品种空育131所得到的转基因植株PCR扩增图；图30 =Epsps-1基因转化粳稻品种R187所得到的转基因植株PCR扩增图；图3D:Epsps-2基因转化粳稻品种R187所得到的转基因植株PCR扩增图。M:为2KB Marker分子量标准；1_20:本发明制备的转基因植株编号；N:阴性对照；P:阳性对照；图片左侧数字:转化实验编号。[0031]图4转基因植株拷贝数检测图。Epsps-1和Epsps-2转化粳稻品种空育131以及Epsps-1和Epsps-2转化粳稻品种R187植株Southern_blot检测图。每个样品分别来自于独立的转化事件，图上标示出了相应的目标基因和受体品种。
[0032]图5Epsps试纸条检测转基因植株中蛋白(Epsps_l/Epsps_2)表达的结果。图5A:Epsps-1和Epsps-2转化粳稻品种空育131植株蛋白检测图；图5B:Epsps_l和Epsps-2转化梗稻品种R187植株蛋白检测图。
[0033]图6转基因植株喷施草甘膦除草剂后的表型图，草甘膦喷施浓度0.6% (V/V)0【具体实施方式】
[0034]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0035]若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0036]实施例1Epsps-1和Epsps-2基因的合成与遗传转化载体的构建
[0037]1、人工合成草甘膦抗性基因 Epsps-1 (US_RE39247)和 Epsps-2 (CN88103827.X)，其核苷酸序列分别如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。
[0038]2、以PU130载体为骨架(PU130载体的构建过程是:pCambia3300载体经XhoI和HindIII酶切处理，用Pubi取代P35s-Bar部分得到PU130)，构建遗传转化载体，分别命名为pZZOOOll和pZZ00013。两个遗传转化载体的T-DNA区域示意图见图1A，图1B。 [0039](I)把人工合成的基因Epsps-1和Epsps-2经BamHI和SacI酶切，插入经BamHI和SacI酶切处理过的PU130，分别获得中间载体pZZ00002 (Pub1-Epsps-l_35spolyA)、pZZ
00003(Pub1-Epsps-2-35spolyA)。
[0040](2) PCR 扩增 P35s-gfp_35spolyA。
[0041]反应体系:10X La Taq Buffer5 μ L,
[0042]
【权利要求】
1.一种抗草甘膦转基因水稻的制备方法，包括以下步骤: (1)将含草甘膦抗性基因的表达载体转化入农杆菌中； (2)将步骤(1)的农杆菌菌液侵染水稻的胚性愈伤组织； (3 )将步骤(2 )的愈伤组织转移到添加了草甘膦的选择培养基上进行筛选，挑选抗性愈伤组织； (4)将抗性愈伤组织转入分化培养基分化，将分化形成的再生小苗转入生根培养基中培养，幼苗生根后炼苗、移栽，得到抗草甘膦转基因水稻。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的表达载体为pZZOOOll或PZZ00013。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述pZZOOOll载体的构建方法为:合成Epsps-1基因，序列如SEQ ID N0.1所示^fEpsps-1基因与PU130载体分别用BamHI和SacI酶切，将酶切后的Epsps-1基因与PU130载体连接，得到中间载体Pub1-EpSpS-1-35SpolyA，即 pZZ00002 ;分别用 Hind III 和 PmeI 对 pZZ00002 和 P35s-gfp_35spolyA 进行双酶切，再将酶切后的二者连接，转化大肠杆菌感受态细胞得到遗传转化载体pZZOOOll。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述pZZ00013载体的构建方法为:合成Epsps-2基因，序列如SEQ ID N0.2所示^fEpsps_2基因与PU130载体分别用BamHI和SacI酶切，将酶切后的Epsps-1基因与PU130载体连接，得到中间载体Pub1-EpSpS-2-35SpolyA，即 pZZ00003 ;分别用 Hind III 和 PmeI 对 pZZ00003 和 P35s-gfp_35spolyA 进行双酶切，再将酶切后的二者连接，转化大肠杆菌感受态细胞得到遗传转化载体PZZ00013。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述的P35s-gfp-35spolyA是以pCambial381载体为模板，以SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所示的核苷酸序列为上、下游引物，通过PCR方法扩增得到的。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的选择培养基以N6为基本培养基，并添加2.5mg/L的2，4-D，250mg/L羧苄青霉素和草甘膦。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，选择培养基中草甘膦的终浓度为8(T300mg/L0
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的农杆菌为EHA105。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的水稻为粳稻。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的粳稻为空育131和/或R187。
【文档编号】A01H5/00GK104004781SQ201310058935
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2013年2月25日 优先权日:2013年2月25日
【发明者】张琳, 马崇烈, 魏晶, 夏秀云, 王维鹏, 李晨, 章旺根 申请人:中国种子集团有限公司