专利名称：一种新型牡丹快速繁殖培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种培养基的新配方，具体的说是一种新型牡丹快速繁殖培养基(LPM)。
背景技术：
牡丹是我国特产的传统名花，其花色艳美，气味芬芳，具有较高的观赏价值；根皮是贵重的中药材，有清热凉血、活血祛瘀和补血等作用。牡丹传统的繁殖方式包括有性繁殖中的种子繁殖，无性繁殖中的分株繁殖、压条繁殖、嫁接繁殖等。但这些繁殖方式时间长，而且只能在生长季节繁殖，牡丹苗体生长量小、繁殖速度慢，种苗数量不足是限制牡丹大面积扩大生产的重要瓶颈。组织培养是快速繁殖植物种苗的有效方法，筛选合适的牡丹快繁培养基是扩大生产的最有效途径，牡丹组织培养始于1983年，之后国内外进行了大量研究，到目前为止，牡丹组培的一些关键环节还没有彻底攻克，特别是牡丹专用培养基的研究没有报道。而使用现有的MS、B5、N6、WPM培养基来培养牡丹试管苗生长困难，尤其是生根难，而且根的质量细小，移栽困难，从而大大严重限制了牡丹的商品化生产。
发明内容
本发明要解决的技术问题是:提供一种新型牡丹快速繁殖培养基，能够有效的解决牡丹种苗繁殖系数低，种苗生根难，根质量细小和移栽困难的问题，可以为牡丹规模化生产提供大批量的牡丹种苗。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种新型牡丹快速繁殖培养基，包括大量元素、微量元素、铁盐和有机物，
所述大量元素由 300-1200 mg/L NH4NO3^ 1400 mg/L KNO3>150 mg/L CaCl2.2H20、150mg/L MgSO4.7H20 和 400-800 mg/L KH2PO4 组成；
所述微量元素由 0.83 mg/L ΚΙ,6.2 mg/L H3BO3Ul.2 mg/L MnSO4.4Η20、8.6 mg/LZnSO4.7Η20、0.025 mg/L CuSO4.5H20 和 0.025 mg/L CoCl2.6H20 组成；
所述铁盐由 27.85 mg/L FeSO4.7H20 和 37.25 mg/L Na2-EDTA.2H20 组成；
所述有机物由0.5 mg/L烟酸、0.5 mg/L盐酸批B多醇、I mg/L盐酸硫胺素、2 mg/L甘氨酸、60-90 g/L蔗糖和6-7 g/L琼脂组成；
所述培养基余量为蒸馏水。所述培养基的pH值为5.8。本发明带来的有益效果为: 本发明通过对MS培养基进行大幅度的系统改良，得到的LPM培养基特别适合牡丹的组织培养，快繁的牡丹幼苗生长健壮，繁殖系数高，生根粗壮，数量多活力强，移栽成活率高达85%以上。本发明中采用KH2PO4的浓度为400-800 mg/L,优选为650 mg/L,这是因为牡丹组织培养是幼小的外植体快速生长，形成愈伤和幼苗的过程，细胞代谢加强，膜系统功能不断完善，膜磷脂系统扩大需要大量磷酸根的供应，与MS培养基相比，较大幅度提高KH2PO4的浓度对提高牡丹组织培养过程中外植体的生活力，提高代谢活性，加快苗体生长有显著作用。同时，与MS培养基相比，本发明亦大幅降低KNO3浓度，KNO3的浓度为1400 mg/L,主要是降低其中N03_浓度，一方面是由于N03_是液泡膜H+-ATPase的专一抑制剂，高浓度的N03_离子则抑制液泡膜H+-ATPase的活性，导致细胞质碱化作用的抑制，结果不利于细胞的生长过程；另一方面，牡丹组织对硝态氮比较敏感，高浓度的硝态氮对牡丹组织生长不利。本发明LPM培养基中NH4NO3用量为300-1200 mg/L，优选为750-1200 mg/L，这是因为牡丹组培过程中铵态氮对牡丹组织的生长十分有利，浓度过小牡丹试管苗生长慢而且细弱，但浓度过大试管苗不长甚至会死亡，因此这个浓度范围是最合适的。本发明中MgSO4.7H20浓度为150mg/L，MnSO4.4H20浓度为11.2mg/L时牡丹幼苗生长更为健壮。本发明中盐酸硫胺素的浓度为I mg/L，这是因为硫胺素是辅羧化酶的辅酶，低水平的硫胺素会导致辅羧化酶活性下降，糖代谢受阻，从而影响整个组织机体代谢过程。选择盐酸硫胺素的浓度为I mg/L，可提高辅羧化酶水平，从而提高了牡丹组培苗的糖代谢活性，有利于牡丹苗的生长。同时，也是增加牡丹组培过程中光强的加强光合作用的基础。本发明中除去了 MS培养基中的Na2MoO4.2H20，原因是Na2MoO4.2H20是植物细胞酸性磷酸酶的专一抑制剂，牡丹细胞组织再建过程，膜系统功能加强，膜磷脂的代谢加强是膜系统重建和功能稳定的基础，培养基中除去Na2MoO4.2H20后，能够提高磷酸酶活性，有利于牡丹组织细胞快速分裂和细胞体积增大过程中膜系统的重建。本发明中加大培养基中的蔗糖浓度，由MS培养基中的30 g/L升高到60-90 g/L，优选为85 g/L,能够有效的降低培养基的水势，显著地抑制组培苗的玻璃化和褐化现象的发生；同时调节培养基的碳氮比，保障能量的有效供应。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，一种新型牡丹快速繁殖培养基，包括大量元素、微量元素、铁盐和有机物，
所述大量元素由 300-1200 mg/L NH4NO3'1400 mg/L KNO3>150 mg/L CaCl2.2H20、150mg/L MgSO4.7H20 和 400-800 mg/L KH2PO4 组成，KH2PO4 的浓度优选为 650 mg/L, NH4NO3 的浓度优选为750-1200 mg/L ；
所述微量元素由 0.83 mg/L KI,6.2 mg/L H3BO3Ul.2 mg/L MnSO4.4Η20、8.6 mg/LZnSO4.7Η20、0.025 mg/L CuSO4.5Η20 和 0.025 mg/L CoCl2.6H20 组成；
所述铁盐由 27.85 mg/L FeSO4.7H20 和 37.25 mg/L Na2-EDTA.2H20 组成；
所述有机物由0.5 mg/L烟酸、0.5 mg/L盐酸批B多醇、I mg/L盐酸硫胺素、2 mg/L甘氨酸、60-90 g/L蔗糖和6-7 g/L琼脂组成，蔗糖浓度优选为85 g/L ；
所述培养基余量为蒸馏水。所述培养基的pH值为5.8。其用于牡丹组织培养的具体步骤为:
采集牡丹植株的腋芽、嫩叶和叶柄作为外植体，用75%酒精浸泡10秒，在0.1%升汞消毒10分钟，再用无菌水清洗5次后，将外植体放在LPM培养基上(培养基中加入KT 0.1-0.5mg/L, BA 0.2-0.8 mg/L, GA 0-0.4 mg/L)进行无菌培养。培养接种2-3周后，外植体基部周围逐渐愈伤组化，4-5周后，由愈伤组织分化出丛生芽。将丛生芽切割，在LPM培养基上(培养基中加入KT 0.1-0.5 mg/L, BA 0.2-0.8 mg/L，GA 0-0.4 mg/L)进行培养，经1_2个月，又产生愈伤组织及丛生芽。将新长出的丛生芽转移到LPM培养基上(培养基中加入KT 0.2-0.8 mg/L，GA
0.2-0.8 mg/L)，培养I个月左右，将伸长的芽从基部切下放入50-200 mg/L IBA的溶液中处理2-3小时，然后再转入含5 g/L活性炭的LPM培养基中，经25-35天，形成良好的根系，生根率达90%以上，效果明显。当试管苗诱导出2-3条根，并长到3-4cm时可移栽。移栽前，在阳光充足处打开瓶盖通风炼苗3-5天，取出植株后，用40°C温水冲去琼脂，移栽到中性土壤中。先用烧杯覆盖，一周后逐步揭开烧杯通风锻炼，浇水逐渐减少，两周后小苗即可正常生长。移栽后60天存活率达85%以上。
权利要求
1.一种新型牡丹快速繁殖培养基，包括大量元素、微量元素、铁盐和有机物，其特征在于:所述大量元素由 300-1200 mg/L NH4NO3^ 1400 mg/L KNO3>150 mg/L CaCl2.2H20、150mg/L MgSO4.7H20 和 400-800 mg/L KH2PO4 组成； 所述微量元素由 0.83 mg/L ΚΙ,6.2 mg/L H3BO3Ul.2 mg/L MnSO4.4Η20、8.6 mg/LZnSO4.7Η20、0.025 mg/L CuSO4.5H20 和 0.025 mg/L CoCl2.6H20 组成；所述铁盐由 27.85 mg/L FeSO4.7H20 和 37.25 mg/L Na2-EDTA.2H20 组成； 所述有机物由0.5 mg/L烟酸、0.5 mg/L盐酸批B多醇、I mg/L盐酸硫胺素、2 mg/L甘氨酸、60-90 g/L蔗糖和6-7 g/L琼脂组成； 所述培养基余量为蒸馏水。
2.如权利要求1所述的一种新型牡丹快速繁殖培养基，其特征在于:所述培养基的PH值 为5.8。
全文摘要
一种新型牡丹快速繁殖培养基，涉及一种培养基的新配方，该培养基由大量元素、微量元素、铁盐、有机物和蒸馏水组成，是在传统MS培养基的基础上大幅度改良而成，得到的新型牡丹快速繁殖培养基(LPM)特别适合牡丹的组织培养，快繁的牡丹幼苗生长健壮，繁殖系数高，生根粗壮，数量多活力强，移栽成活率高达85%以上。
文档编号A01H4/00GK103168688SQ201310095518
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月25日 优先权日2013年3月25日
发明者史国安, 高双成, 施江, 王世华, 李玉龙 申请人:河南科技大学