一种热激转录因子基因AtHSFA6a及其编码蛋白与应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于植物分子生物学与转基因相关【技术领域】。具体为拟南芥热激转录因子基因AtHSFA6a抗高温功能的验证，以及该基因在抗高温植物新品种培育中的应用。本发明以模式植物拟南芥为材料，利用AtHSFA6a基因T-DNA插入纯合突变体株系salk_045608研究AtHSFA6a基因在植物抗高温方面的功能。实验结果显示：AtHSFA6a基因敲除突变体在热激胁迫下表现敏感表型，且在根长、地上部鲜重、电导率、渗透压、丙二醛含量和SOD酶活性等生理指标方面均与野生型有显著或极显著差异；说明AtHSFA6a基因在植物应答热激胁迫的信号转导途径中具有重要的作用，预计该基因的过量表达可提高植物的耐热性并在植物抗逆分子育种中具有较大经济价值。
【专利说明】—种热激转录因子基因AtHSFA6a及其编码蛋白与应用
【技术领域】:
[0001]本发明涉及植物分子生物学领域，具体为拟南芥热激转录因子(Heat ShockTranscription Factors, HSFs)家族成员AtHSFA6a抗高温新功能的验证，以及该基因在抗高温植物新品种培育中的应用。
【背景技术】:
[0002]温度的变化对植物生长发育具有重要的影响，适宜的温度能够保证或促进植物正常的生长发育，而不适宜的温度条件则会抑制植物的生长，甚至使植物死亡。自二十世纪以来，随着世界人口的飞速增长及工业化程度的不断加深，温室效应越来越严重，全球温度的逐步升高已成为作物正常生长、发育和获得高产的一个重要限制因素。现代分子生物学和基因工程相关技术的日益成熟，使人们从分子水平上探知植物对高温胁迫的响应及高温诱导相关信号在植物体内的传导途径成为现实，并且为改良作物的抗高温性能开辟了新的途径，在了解植物响应高温的分子机制的基础上，充分利用植物自身的基因资源，发掘植物抗高温相关基因，对培育抗高温性能提高的作物具有重要的指导意义。
[0003]拟南芥(Arabidopsis thaliana)属十字花科，芸薹属植物，它不仅是第一个被测定基因组序列的模式植物(Athanasios Theologis.et al., NATURE.2000, V0L408:816-820)，而且具有基因组规模较小、植株株型矮小、生长周期短、自花授粉而又易于杂交等优点。因此以拟南芥作为分子遗传学和基因工程研究的模式植物，从中鉴定和克隆与热胁迫相关的基因，并结合转基因操作技术是培育耐高温性能增强植物的一条有效途径。
[0004]转录因子(Transcription factors, TFs)又称反式作用因子，是一类和专一性DNA序列特异结合并能激活或抑止相关基因转录的蛋白质分子。热激转录因子(Heatstress transcription factors, HSFs)是一类能够调控不同热激蛋白(Heat shockprotein, HSP)基因表达的专用转录因子。基因组研究发现拟南芥中包含21个HSF基因家族成员。以前的研究证明AtHSFA6a (晁旭，王亚平，巩振辉，梁燕，赵军.西北植物学报，2007，27 (7) =1305-1310)基因在拟南芥热胁迫信号应答链中起到重要作用，ant1-RNA抑制该基因使突变体株系在存活率等方面与野生型有较大差异。但从来没有关于该基因在热胁迫条件下对根部和地上部生长发育以及对植物生理生化影响的报道，从生理生化和分子遗传学角度深入分析该基因的功能或许可以为人们找到一条利用分子育种手段培育耐高温或其它逆境能力增强的作物新品种的有效途径。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一个拟南芥热激转录因子(HSF)基因，以及该基因在应答热激胁迫反应中的功能和在培育耐高温植物中的作用。
[0006]所提供的HSF 基因为 AtHSFA6a (AT5G43840)。
[0007]上述基因具有SEQ ID N0.1的碱基序列。
[0008]上述基因编码的蛋白 质具有SEQ ID N0.2的氨基酸序列。[0009]AtHSFA6a 基因的 T-DNA 插入突变体 salk_045608 是从 ABRC (Arab1-dopsisBiological Resource Center)定购获得。通过PCR鉴定获得纯合插入突变体，通过RT-PCR在mRNA水平上鉴定基因的敲除情况。
[0010]通过上述鉴定，获得AtHSFA6a基因T-DNA插入突变体salk_045608的纯合株系，并以之为材料进行热激处理，观察热胁迫表型并拍照。然后对热胁迫处理后的拟南芥幼苗进行耐高温相关指标的测定，包括:主根长度测量，地上部鲜重测量，相对电导率测定，渗透压测定，相关酶活性测定，丙二醛含量测定。
【专利附图】
【附图说明】:
[0011]图1显示野生型和突变体PCR和RT-PCR检测的电泳结果，结果表明所获AtHSAF6a基因突变株系salk_045608为T-DNA纯合插入株系，其转录本被敲除。
[0012]图2显示野生型和突变体热胁迫12天后的表型图片，结果表明突变体经热胁迫处理后生长受到抑制，表现热敏感表型。
[0013]图3显示热胁迫后野生型和突变体根长和地上部鲜重差异，结果表明突变体根长和地上部鲜重极显著低于野生型(P = 0.01, P = 0.005)，表现为热敏感。
[0014]图4显示热胁迫后野生型和突变体电导率差异，结果表明突变体电导率在缓苗24h左右显著高于野生型(P = 0.012)。
[0015]图5显示热胁迫后野生型和突变体渗透压差异，结果表明热胁迫后突变体渗透压显著高于野生型(P = 0.022)。
[0016]图6显示热胁迫前后野生型和突变体丙二醛(MDA)含量差异，结果表明热胁迫前突变体MDA含量显著低于野生型(P = 0.026)，而热胁迫后突变体MDA含量显著高于野生型(P = 0.011)。
[0017]图7显示热胁迫前后野生型和突变体S0D活性差异，结果表明热胁迫前突变体S0D活性显著高于野生型(P = 0.044)，而热胁迫后突变体S0D活性显著低于野生型(P =
0.016)。
【具体实施方式】:
[0018]下面结合实验方法和数据进一步阐述本发明。
[0019]1.拟南芥幼苗培养:
[0020]野生型和突变体种子分别用0.5%次氯酸钠溶液浸泡消毒lOmin，消毒后的种子放入4°C冰箱春化2天后点布于含1%琼脂的MS(Murashige and Skoog)固体培养基上，置于22°C光照培养箱中萌发生长。
[0021]2.纯合突变体鉴定:
[0022]DNA提取:所用实验药品均购自中科瑞泰生物工程有限公司。取约0.5g拟南芥新鲜叶片，研磨成糊状，加 400 μ 1 SDS 提取液(0.5% SDS(ff/V) ；200mMTris-HCl, pH = 8.0 ；250mM NaCl ；25mM EDTA) ;12，OOOr/min离心3min ;取上清，加等体积异丙醇轻轻摇晃，静置30min ;13，000r/min离心5min ;弃上清，用lml95%酒精冲洗1_2次后，自然风干，加去离子水30μ 1，4°C保存备用。
[0023]RNA提取:所用实验药品均购自中科瑞泰生物工程有限公司。所用研钵、枪头、离心管等一应物品事先用1% DEPC水浸泡过夜后高温高压灭菌备用。取新鲜幼苗约lg左右，于液氮中研磨成粉状，加1ml TRIZOL提取液混匀，静置lOmin ;4°C下12，OOOr/min离心lOmin ;取上清加300 μ 1氯仿混匀，静置lOmin后4°C, 12, OOOr/min离心15min,样品分为3层，RNA位于上层水相中；取500μ 1上层水相转移到新离心管中，加等体积异丙醇沉淀 10-20min ; 12，OOOr/min 离心 lOmin,弃上清;用 75% 酒精洗漆 1-2 次,7，OOOr/min 离心2min,晾干lmin左右，加60 μ 1无RNase水，轻轻震荡使RNA溶解，置于_70°C冰箱保存备用。
[0024]RT-PCR:所用反转录试剂盒(#kl621)购自 Fermentas。First strand cDNAsynthesis:管中加入 RNA1μ 1, oligo(dT) 18primerlμ 1, RNase-free waterlμ 1,65 °C处理5min后迅速冰浴冷却；然后再加5XReaction buffer4 μ 1, Ribolock?RNaseinhibitor (20u/ul)1 μ 1,lOmM dNTP Μ?χ2μ 1, RevertAid? H Minus M-MuLV ReverseTranscriptase (200u/μ 1) 1 μ 1，42°C反应 60min ;70°C终止反应 5min，产物于 _20°C冰箱保存备用。 [0025]PCR检测:所用实验药品均购自中科瑞泰生物工程有限公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。我们设计了 2对引物，1对用于T-DNA插入检测(LP1:5 ' -ATCTCCTCCTCACTCAACACG-3 '，RP1:5 ' -AAACAAACAAACCACGAAACG-3 ')并结合T-DNA左边界通用引物LBbl.3:5, -ATTTTGCCGA TTTCGGAAC-3'，通过PCR鉴定获得纯合插入突变体。另外1对引物用于RT-PCR鉴定(LP2:5 ' -CCTTCCAATTCCATTAGAGGG-3 '；RP2:5 ' -TCACTCAA CACGAAACCCTT-3 ' )。PCR 反应体系如下:10 Xbufferbuffer2 μ 1，dNTP0.8 μ 1，Primer LP/RP 各 1 μ 1，DNA1 μ 1，dH2014 μ 1，Taq 酶 0.2 μ 1。PCR 程序如下:94°C，3min ； (94°C，45sec ；58°C，45sec ；72°C, 60sec) X 30cycles ；72°C, 5min。产物采用 1 %(W/V)琼脂糖凝胶电泳分离，恒压100V电泳20min，用BIO-RAD凝胶成像扫描仪拍照记录检测结果。
[0026]3.热胁迫处理:
[0027]在含1%琼脂的固体MS培养基上生长5天的幼苗，转移到新的培养基中，野生型和突变体各转5-6株，排列整齐以便于观察表型。24h后置于烘箱中热激，热激条件为:38°C，lh30min ;22°C，4h ；47°C, lh30min ;22°C光照培养箱中生长12天后拍照并统计根长和地上部鲜重等指标。
[0028]结果表明突变体根长和地上部鲜重极显著低于野生型(P = 0.01，P = 0.005)，为热敏感表型。
[0029]4.相对电导率测定:
[0030]植物受高温等逆境胁迫后，细胞膜受到伤害，膜透性增大，细胞内的物质(尤其是电解质)大量外渗，从而引起质外体空间的电导率发生变化，通过测定外渗液电导率的变化，就可反映出质膜的伤害程度和所测材料抗逆性的大小。
[0031]热激后的苗分别于Oh、12h、24h和48h取样，野生型和突变体各取10株，用去离子水冲洗后放入干净的10ml离心管中，加入去离子水5ml，室温下静置过夜后用HANNAEC215型电导率仪测定浸泡液的电导率(S1);再于沸水中煮沸lOmin，冷却至室温后再一次测定浸泡液的电导率(S2);相对电导率(L) = S1/S2，每个处理设3次重复。
[0032]结果表明突变体的电导率在缓苗24h后显著地高于野生型(P = 0.012)，说明AtHSFA6a基因敲除后，突变体植株在高温胁迫后细胞膜受到不可逆损害的程度远较野生型的严重。这也是突变体表现热敏感表型的主要原因之一。
[0033]5.渗透压的测定:
[0034]植物受高温等逆境胁迫后，细胞膜受损，细胞内容物大量外渗，从而引起细胞外液的渗透势发生变化，通过测定渗透压的变化，就可反映出质膜受伤害的程度和所测材料抗逆性的大小。
[0035]热激后分别取野生型和突变体幼苗各100株，用去离子水冲洗后放入干净的注射器，用力挤压，挤出细胞外液，取10 μ 1用VAPR05520型渗透压仪测量溶液渗透压，每个处理设3次重复。
[0036]结果表明突变体在热胁迫处理后其渗透压显著地高于野生型(Ρ = 0.022)，说明AtHSFA6a基因敲除后，突变体植株的细胞膜受伤害程度远大于野生型。
[0037]6.丙二醛含量测定:
[0038]植物在高温下产生的超氧阴离子自由基、过氧化物等活性氧，可使膜脂中不饱和脂肪酸过氧化为丙二醛，与酶蛋白发生链式聚合反应，使酶蛋白失去活性而对植物体造成伤害。因此丙二醛含量能够代表植物细胞膜脂质过氧化程度。
[0039]热激后野生型和突变体幼苗分别取鲜样0.15g，提取丙二醛，提取及测定方法参考汤章城等编著《现代植物生理学实验指南》(科学技术出版社)。 [0040]结果表明热胁迫前突变体MDA含量显著低于野生型(P = 0.026)，而热胁迫后突变体MDA含量显著高于野生型(P = 0.011)，说明AtHSFA6a基因敲除后，突变体植株的细胞膜脂质过氧化程度大于野生型。
[0041]7.酶活性测定:
[0042]植物受高温等逆境胁迫后，能够激活或提高植物体内清除活性氧、保护膜系统的抗氧化防御系统的活性。因此以超氧化物歧化酶(S0D)为代表的植物细胞保护酶的活性能够代表植物的高温耐受能力。
[0043]热激后野生型和突变体幼苗分别取鲜样0.15g，提取酶液，分别测量S0D活性，提取及测定方法参考汤章城等编著《现代植物生理学实验指南》(科学技术出版社)。
[0044]结果表明热胁迫前突变体S0D活性显著高于野生型(P = 0.044)，而热胁迫后突变体S0D活性显著低于野生型(P = 0.016)，说明AtHSFA6a基因敲除后，突变体植株的高温耐受能力低于野生型。
【权利要求】
1.拟南芥热激转录因子基因AtHSFA6a，其碱基序列如SEQID N0.1。
2.权利要求1所述的热激转录因子基因AtHSFA6a编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQID N0.2。
3.权利要求1所述的热激转录因子基因AtHSFA6a突变体的热胁迫处理方法及条件。
4.权利要求1所述的热激转录因子基因AtHSFA6a突变体在热胁迫处理下所获得的表型及其相关试验数据。
5.权利要求1所述的热激转录因子基因AtHSFA6a及其同源基因在制备耐热及其它抗性转基因植物中的应用。
【文档编号】A01H5/00GK103642818SQ201310113324
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年4月3日 优先权日:2013年4月3日
【发明者】徐江, 徐小栋, 东方阳, 鲁黎明, 王西瑶, 张少斌, 洪雪, 麻艳超, 迟志海, 丁在松, 付金东, 赵明 申请人:中国农业科学院作物科学研究所