专利名称：一种以胚芽鞘节作为外植体的玉米再生体系的建立方法
技术领域：
本发明所属的技术领域是农业生物技术领域和作物育种领域。
背景技术：
玉米是世界五大作物之一，在我国乃至全世界的粮食生产中都占有举足轻重的地位。在提高玉米单产的诸多因素中，新品种选育的作用约占40%。随着分子生物学技术的长足发展，转基因技术、单倍体技术等开始在玉米新品种选育中发挥重要的作用，它们具有许多不同于传统育种技术的独特优势，因此受到了国内外育种工作者的高度重视。转基因技术是根据育种目标，利用现代生物技术手段从供体生物中分离目的基因，经DNA重组与遗传转化导入受体作物，经过筛选获得稳定表达的转基因株系，结合田间试验与大田选择育成转基因新品种或新种质。转基因育种最大的优点是针对性很强，可以根据目标性状定向选择合适的基因导入需要改良的作物中，以达到预期的目的。通过转基因技术的应用，不仅可以提升传统育种的研发效率，而且提升了育种研发的准确率、减少盲目性和重复浪费，丰富了传统的育种手段，使作物育种的产业发展水平迈向新的台阶。目前，转基因育种在大豆、玉米、棉花和油菜等作物中已经取得了巨大的成功，其中，转基因玉米已经成为仅次于转基因大豆的全球种植面积第二大的转基因作物。
在研发转基因作物新品种时，最重要的技术环节之一就是作物遗传转化技术。玉米常用的遗传转化方法主要是基因枪法和农杆菌介导法，这两种转化方法都需要首先建立玉米再生体系。长期以来，常规的系谱法、回交法、复合杂交和轮回选择等技术是改良玉米自交系的主要手段，已培育了许多能够适应各种生态环境的优良杂交种，但常规遗传改良一直存在育种周期长等缺点。1949年Chase提出了单倍体诱导选系的方法。原理是利用自然发生或人工培育的单倍体植株，经人工或自然加倍获得纯合的二倍体植株，再从中选育自交系。利用单倍体育种技术只需2个世代便可得到纯合的DH系，极大地缩短了育种周期，提高了育种效率。近10年来，美国孟山都公司、德国KWS公司及俄罗斯等国的一些玉米种子公司都在尝试利用单倍体诱发系进行自交系选育，其中以德国KWS公司的技术相对成熟。据不完全统计每年大约可产生1500-2000个纯系。然而，玉米单倍体自然加倍和人工加倍的概率均比较低，一部分优良的基因型由于加倍不成功而丢失。如果将玉米单倍体技术和玉米组织培养再生技术相结合，通过孤雌生殖途径得到单倍体，使用组织培养再生技术对单倍体进行扩繁，这样就可以保证更多的单倍体得到加倍，尽可能减少由于加倍率低所造成育种材料的丢失。从以上陈述可看出，玉米转基因技术和单倍体技术中，组织培养再生体系的建立都是其关键的技术之一。玉米再生体系所用的材料可分为幼胚和非幼胚类型，其中前者还包括直接用幼胚或幼胚诱导的胚性愈伤组织进行再生体系的建立，而后者包括直接用茎尖分生组织和利用成熟胚、叶片、茎尖等诱导的胚性愈伤组织等作为材料进行再生。幼胚和幼胚诱导的胚性愈伤组织操作简单，植株再生比较容易，是玉米转基因中最常用的受体材料。但是转基因所用的受体材料基因型限制严重、幼胚材料易受季节和温室条件限制，不能够持续不断的高通量的进行玉米转化，在产业化应用上具有很大的局限性。非幼胚类型的材料中，直接用茎尖分生组织虽然转化和再生容易，且不受基因型限制，但转化率低，获得的再生植株大多是嵌合体，后代需要做大量的筛选工作。而采用成熟胚、叶片、茎尖等材料较难诱导出胚性愈伤组织，再生较困难。我们基于玉米胚芽鞘节作为材料建立的组织培养再生体系相对与玉米幼胚的转化而言，转化效率略低，但是由于其不受温室条件和生长季节的限制，操作简便，可以实现高通量、持续不断的遗传转化，因而在玉米的商业化转基因研发中，具有相当大的应用潜力。在单倍体应用方面，将玉米单倍体种子发芽后通过胚芽鞘节诱导愈伤组织，进而获得再生植株，可有效对单倍体进行扩繁，为单倍体的加倍提供大量的材料。与成熟胚、叶片、茎尖等再生体系相比，玉米胚芽鞘节诱导胚性愈伤组织的效率较高，因此在玉米单倍体育种中能迅速获得大量的单倍体，为加快育种进程打下坚实的基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以胚芽鞘节为外植体的玉米再生方法，包括以下步骤:I)将灭菌的玉米种子置于发芽培养基中培养，萌发获得幼苗；2)从上述步骤I)中得到的幼苗上切取胚芽鞘节，接种于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织并继代培养；
3)将上述步骤2)中得到的愈伤组织置于胚状体诱导培养基中，得到玉米愈伤组织胚状体；4)将上述步骤3)中得到的愈伤组织胚状体置于再生培养基中，得到再生苗；5)将上述步骤4)中得到的再生苗置于生根培养基中，获得具有3-4条根的玉米再生植株；上述发芽培养基是MS +麦芽糖40g/L +酶水解酪蛋白0.lg/L +谷氨酰胺0.5g/L + 2-吗啉乙磺酸 2g/L + MgCl2*6H20 1.6g/L +抗坏血酸 0.lg/L + 6-BA 3mg/L +毒莠定 0.01g/L ；愈伤诱导培养基是MS +蔗糖30g/L+维生素B10.5mg/L+酶水解酪蛋白0.5g/L + 脯氨酸 1.5g/L + 硝酸银 5mg/L + 2, 4-D 1.5_5mg/L + 毒莠定 0-0.001mg/L ；胚状体诱导培养基是MS +蔗糖30g/L +脯氨酸0.7g/L + 6-BA 2mg/L ；再生培养基是MS +蔗糖20g/L +肌醇0.lg/L。步骤2)中所述的胚芽鞘节是指幼苗凸起的顶端分生组织。步骤2)中所述的继代培养是将所获得的愈伤组织在愈伤组织诱导培养基上培养增殖，得到增殖的愈伤组织。步骤6)获得的再生植株需进行炼苗后再移栽到土壤中。本发明的主要技术效果在于:I)本发明采用的胚芽鞘节可随时由成熟种子发芽获取，不受季节限制，在冬季也无需象幼胚一样在温室或南繁获取，因此在建立再生体系时取材方便、费用低廉；2)发明采用的胚芽鞘节诱导愈伤组织效率比成熟胚、叶片等外植体高，且单个胚芽鞘节可获取2-3次愈伤组织，因此容易实现大规模的植株再生、扩繁效果明显；
3)发明采用胚芽鞘节诱导的I型愈伤组织状态要明显好于由成熟胚、叶片获得的愈伤组织，容易转化成II型愈伤组织，从而分化成苗，再生效率较高，具有很好的应用前景。4)禾本科的种子在胚芽外具有胚芽鞘的特殊结构，种子萌发时其生长迅速对胚芽起先导和保护作用。因此，本发明不仅应用于玉米的再生体系，也可应用于具有胚芽鞘特殊结构的禾本科植物的再生体系，如小麦、水稻等。
图1为玉米萌芽的种子。图2为切取的玉米胚芽鞘节。图3为胚芽鞘节诱导的愈伤组织。图4为愈伤组织的扩繁。图5为愈伤组织诱导的胚状体。图6为分化出的再生苗。
·
图7为再生植株的生根。图8为生根的再生植株移栽到营养钵中。
具体实施例方式下面结合具体实施对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例一玉米种子胚芽鞘节愈伤组织的诱导与植株再生1.种子灭菌处理首先将玉米种子中的杂物清理干净、选取饱满完整的种子，然后将其放于容器中用蒸馏水清洗3遍，期间剧烈震荡以清理附着表面的残余物。于超净台上用75%的酒精浸泡3分钟,然后用浓度5.25%的次氯酸钠浸泡20分钟,最后用灭菌水冲洗5-6次。2.发芽培养将灭菌后的种子置于发芽培养基中，注意要将种子的胚朝上水平接种于发芽培养基中。于培养室(16h/d光照，光强80-100 μ E/m2/s，温度26-28°C )培养7-10天。上述发芽培养基是在MS基本培养基中添加如下物质:麦芽糖40g/L，酶水解酪蛋白 0.lg/L，谷氨酰胺 0.5g/L，MES (2-吗啉乙磺酸)2g/L，MgCl2*6H20 1.6g/L，抗坏血酸0.lg/L, 6-BA 3mg/L,毒赛定 0.01g/L。3.胚芽鞘节的切取将已长出的幼苗切下来，放入一个灭菌的空皿中，用解剖刀切下幼苗胚芽鞘节区域上下各0.5cm。将莖段纵向一分为二。4.愈伤组织的诱导将胚芽鞘节创伤面接触培养基，放于愈伤诱导培养基中，10-16个材料/皿，光照培养室中培养(16h/d光照，光强80-100 μ E/m2/S，温度28°C)。愈伤诱导期间不定期进行胚芽鞘节大芽子的切除，2-4周后，将胚性愈伤组织转至新的愈伤诱导培养基中。28°C暗培养2-4周，即可诱导出愈伤组织。上述愈伤诱导培养基是在MS基本培养基中添加如下物质:蔗糖30g/L、VBi (维生素 B1) 0.5mg/L、酶水解酪蛋白 0.5g/L、脯氨酸 1.5g/L、硝酸银 5mg/L、2，4_D 1.5_5mg/L、毒赛定 0-0.0Olmg/Lo5.植株再生将诱导出的愈伤组织转至胚状体诱导培养基中，28°C暗培养7天。将组织块转至再生培养基中，1-6个愈伤/皿，16h/d光照，光强80-100yE/m2/s，28°C培养4_6周。再生出的丛生苗分成小块放在培养皿(90*25mm)中进行继代培养。再生出的丛生苗分成小块放在生根培养基中进行生根培养，16h/d光照，光强80-100 μ E/m2/s, 28°C培养10天左右，将长出3-4条根的幼苗进行炼苗。上述胚状体诱导培养基是在MS基本培养基中添加如下物质:蔗糖30g/L、脯氨酸
0.7g/L、6_BA 2mg/L。上述再生培养基是在MS基本培养基中添加如下物质:蔗糖20g/L、肌醇0.lg/L。生根培养基为常规的玉米丛生苗培养基。6.数据统计我们选取了 11个玉米品种(系)进行了胚芽鞘节的实验(表1)，这11个玉米品种(系)均能商购获取。共获得了 2310个胚芽鞘节、268个初生愈伤组织、扩繁出了 14588个次级愈伤组织。其中DH382、PH2VK、PH6WC、郑58等4个品种(系)共形成了 509个胚状体，最终获得了 840棵再生植株。这11个玉米品种(系)愈伤组织的平均诱导率为12%，最高的是Hi II A,诱导率能达到52%，但最终未能获得再生植株。 其中能获得再生植株的4个品种(系)的再生平均效率为1.65 (即每个胚状体能形成1.65棵幼苗)。表I不同玉米品种胚芽鞘节诱导愈伤组织的比较
权利要求
1.一种以胚芽鞘节为外植体的玉米再生方法，包括以下步骤: 1)将灭菌的玉米种子置于发芽培养基中培养，萌发获得幼苗； 2)从上述步骤I)中得到的幼苗上切取胚芽鞘节，接种于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织并继代培养； 3)将上述步骤2)中得到的愈伤组织置于胚状体诱导培养基中，得到玉米愈伤组织胚状体； 4)将上述步骤3)中得到的愈伤组织胚状体置于再生培养基中，得到再生苗； 5)将上述步骤4)中得到的再生苗置于生根培养基中，获得具有3-4条根的玉米再生植株; 上述发芽培养基是MS +麦芽糖40g/L +酶水解酪蛋白0.lg/L +谷氨酰胺0.5g/L +2-吗啉乙磺酸 2g/L + MgCl2*6H20 1.6g/L + 抗坏血酸 0.lg/L + 6_BA 3mg/L + 毒莠定0.0lg/L ； 愈伤诱导培养基是MS +蔗糖30g/L +维生素B10.5mg/L +酶水解酪蛋白0.5g/L +脯氨酸 1.5g/L + 硝酸银 5mg/L + 2，4-D 1.5_5mg/L + 毒莠定 0-0.001mg/L ； 胚状体诱导培养基是MS +蔗糖30g/L +脯氨酸0.7g/L + 6-BA 2mg/L ； 再生培养基是MS +蔗糖20g/L +肌醇0.lg/L。
2.如权利要求 1所述的方法，其特征在于步骤2)中所述的胚芽鞘节是指幼苗凸起的顶端分生组织。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤2)中所述的继代培养是将所获得的愈伤组织在愈伤组织诱导培养基上培养增殖，得到增殖的愈伤组织。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤6)获得的再生植株需进行炼苗后再移栽到土壤中。
全文摘要
本发明涉及一种以胚芽鞘节作为外植体的玉米再生体系的建立方法，属于农业生物技术和作物育种领域。主要包括以下步骤(1)将灭菌的玉米种子置于发芽培养基中培养，萌发获得幼苗；(2)从幼苗上切取胚芽鞘节诱导愈伤组织；(3)对愈伤组织进行继代扩繁；(4)对愈伤组织进行胚状体诱导；(5)对胚状体进行分化成苗。本方法取材不受季节限制、扩繁效率高，可应用于玉米大规模遗传转化和单倍体材料的扩繁。
文档编号A01H4/00GK103190346SQ20131014074
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月22日 优先权日2013年4月22日
发明者万向元, 方才臣, 吴锁伟, 肖中华, 张丹凤, 刘艳艳, 徐媛媛, 安学丽, 王超 申请人:北京金冠丰生物技术有限公司