专利名称：一株解淀粉芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物防治植物病害领域。具体而言，本发明涉及一株能够高效防治植物病害的解淀粉芽孢杆菌及其用途，以及采用该解淀粉芽孢杆菌制备的生物防治制剂。
背景技术：
葡萄为落叶藤本植物，有“水果之神”的称号，是世界上最古老的的植物之一。葡萄原产于欧洲、西亚和北非一带。在我国主要产地为新疆、甘肃、山西、河北、山东等地。葡萄既可以作为水果直接食用，也可以用作酿造葡萄酒。葡萄食用具有抗病毒杀细菌、防癌抗癌、降低胃酸利胆、抗动脉粥样硬化、补益和兴奋大脑神经、利尿消肿安胎等功效；酿造的葡萄酒可补气益血，滋阴生津，强筋健骨，通利小便。主治气血虚弱，肺虚久咳，肝肾阴虚，心悸盗汗，腰腿酸痛，筋骨无力，风湿痹痛，面肢浮肿，小便不利等病症。因此葡萄市场需求旺盛。但由于葡萄病害的危害，严重影响了葡萄产业的健康发展。葡萄白腐病(Conielladiplodiella)是葡萄产区危害较重的病害之一，每年由该病造成的产量损失达10% 30%，严重地块达50%以上。该病病原菌主要侵染果实、幼茎和花序等，其中以果实危害最为严重，造成果实腐烂和落粒。病害一旦蔓延，对产量、品质、效益影响较大，造成许多果园减产甚至面临毁园的危险。针对该病害的防治，主要以套袋或者化学防治，但往往会带来人力成本过高、用药盲目、超浓度用药等问题。因此以生物药物为主的生物防治技术是葡萄白腐病防治的必然趋势。芽孢杆菌是一 种广泛分布于各种不同生活环境中的腐生细菌，是一群好氧兼厌氧的产芽孢革兰氏阳性杆菌的总称，可以产生内生耐热抗逆的芽孢。芽孢不仅对热有抗逆性，还对紫外线、电磁辐射及一些化学药品有很强的抗逆性，它可以忍受各种不良环境。由于具有如此强的抗逆性，使得它有利于生防菌剂的生产和剂型加工，也利于其在环境中的存活、定殖与繁殖。由于它们生长快、营养简单、能够形成具有较强抗逆性能力的芽孢，在产品开发中较非芽孢杆菌有效活菌数量高、性能稳定等优势而备受瞩目。芽孢杆菌是植物病害生防微生物的重要组成部分，可用于防治多种植物病害。芽孢杆菌作为生防菌防治植物病害的机制主要有:抗生作用、营养竞争、空间竞争、重寄生作用以及诱导植物产生抗性等机制，芽孢杆菌的生防机制主要是以产生拮抗物质抑制有害病菌的生长或杀死病原菌。这些物质绝大多数为肽类抗生素，具有高效、低残留、与环境友好等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于高效防治多种植物病害的新的芽孢杆菌——解淀粉芽孢杆菌RCD-1。该菌株具有生长速度快、产孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。本发明所提供的菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) RCD-1,是从山东省潍坊市潍北地区沿海滩涂地的土壤中分离获得的，已于2013年4月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC N0.7502。其具有以下生物学特性:在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28°C下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株RCD-1的培养方法或繁殖方法包括:(I)普通培养保存采用牛肉膏蛋白胨琼脂(NA)培养基，配方为胰蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂15-20g,蒸馏水IOOOmL, pH调至7.0-7.2 ；(2)实验室液体培养采用牛肉膏蛋白胨液体培养基，配方为胰蛋白胨10g，牛肉膏3g,氯化钠5g，蒸馏水IOOOmL, pH调至7.0-7.2 ；(3)大量发酵培养配方:黄豆粉2.5%，玉米粉3.5%，NaCl0.1%，CaCO30.2%，其余为水。本发明还提供一种用于防治植物土传病害的生物防治制剂，所述生物防治制剂包括所述的解淀粉芽孢杆菌菌株RCD-1。并且，本发明还提供了一种用于防治植物土传病害的生物防治方法，所述生物防治方法包括向具有土传病害的植物施用上述解淀粉芽孢杆菌菌株RCD-1或者上述生物防治制剂。 本发明也提供了上述解淀粉芽孢杆菌菌或者上述生物防治制剂在防治植物土传病害中的用途。就上述生物防治制剂、生物防治方法以及用途而言，所述植物病害可以选自包括葡萄白腐病、黄瓜炭疽病、核桃炭疽病、苹果炭疽病、葡萄炭疽病、西瓜炭疽病、冬枣黑斑病、板栗枝枯病、石槽干腐病等一种或几种。在本发明的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤:(I)将解淀粉芽孢杆菌菌株RCD-1的孢子移植到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28-30°C摇床振荡培养2-3d得到种子液；(2)按3.0%比例(体积比)将种子液接种到大量发酵培养基中，培养温度28_30°C，培养时间30h，通风比1:0.9。发酵完成后得到发酵液，发酵液菌数可达100亿/g。(3)将解淀粉芽孢杆菌发酵液与基质(选自草炭、微粉碳酸钙和膨润土中的一种或多种)进行混合均匀，干燥，经干燥后菌数可达500亿/g。所述发酵液与发酵液基质的质量比为1:1。实验表明，本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产芽孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该解淀粉芽孢杆菌制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治植物土传病害，还能有效提高作物产量，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料，防治多种土传植物病害，包括葡萄白腐病、黄瓜炭疽病、核桃炭疽病、苹果炭疽病、葡萄炭疽病、西瓜炭疽病、冬枣黑斑病、板栗枝枯病、石榴干腐病等一种或几种。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例11、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)菌株RCD-1的分离与纯化本发明的解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens) RCD-1是从土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为:(I)芽孢杆菌的分离:土样的采集，在山东省潍坊市潍北地区沿海滩涂地，采用5点取样法，分别采集地块四周和中央深度在10-20cm范围内的土壤适量，等量混匀。标明采集地点、时间和采集人。称取Ig 土样于IOOmL无菌水中，置于30°C摇床中150rpm震荡lOmin，然后置于60°C水浴锅中孵育30min，取100 μ LlO'10'1(Γ4稀释液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30°C培养2d后挑取牛肉膏蛋白胨培养基上的不同形态的微生物菌落于牛肉膏蛋白胨培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化芽孢杆菌菌株，分别编号保存。⑵葡萄白腐病高效拮抗芽孢杆菌的筛选①初筛:采用对峙培养法，制备PDA平板，用打孔器在葡萄白腐病菌菌丝边缘打取直径为5mm的菌饼，移植在平板中央，四周2cm处接种芽孢杆菌株，置27°C生化培养箱培养。逐日观察芽孢杆菌对病原菌的抑制作用。②复筛:将筛选到的具有高效拮抗活性的芽孢杆菌菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的芽孢杆菌菌株，进行盆栽防治试验和田间试验。本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治多种植物病害的解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)菌株RCD-1。实验证明，该解淀粉芽孢杆菌在防治葡萄白腐病显示出非常高效的防治效果，使得农作物显著增产。因而，本发明的解淀粉芽孢杆菌是具有广泛应用前景的解淀粉芽孢杆菌新菌株，可以用于制备防治多种植物病害的生物防治制剂。2、菌株鉴定(I)微生物学特性:在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28°C下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。(2)分子生物学特性该菌株的16s rDNA 基因序列测定结果如下(SEQ-1):CGCCTGCCTATACTGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTC GTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGAGCCAGCCGCCGAAGGTG实施例21、解淀粉芽孢杆菌菌株RCD-1发酵过程牛肉膏蛋白胨液体培养基，配方为:胰蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水IOOOmL, pH 调至 7.0-7.2。大量液体发酵培养基配方(质量百分含量):黄豆粉2.5%，玉米粉3.5%，NaCl0.1%，CaCO30.2%，其余为水。解淀粉芽孢杆菌菌株RCD-1大量固体发酵过程:(I)将解淀粉芽孢杆菌菌株RCD-1的孢子移植到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28_30°C摇床振荡培养2-3d得到种子液；(2)按3.0%比例(体积比)将种子液接种到大量发酵培养基中，培养温度28_30°C，培养时间30h，通风比1:0.9。发酵完成后得到发酵液，发酵液菌数可达100亿/g。(3)将解淀粉芽孢杆菌发酵液与基质(选自草炭、微粉碳酸钙和膨润土中的一种或多种)进行混合均匀，干燥，经干燥后发酵液菌数可达500亿/g。所述发酵液与发酵液基质的质量比为1:1。实施例3解淀粉芽孢杆菌菌株RCD-1对葡萄白腐病菌室内效果验证1.实验方法采用平板对峙培养法，将供试的葡萄白腐病菌菌饼(9mm)移至平板中央，四周2cm处接种解淀粉芽孢杆菌RCD-1菌株，置27°C生化培养箱培养，每个处理重复3次。待对照菌丝长满平板时，采用十字交叉法测量菌落直径、抑菌带直径，计算平均值和相对抑制率。2.结果由表I可以看出，解淀粉芽孢杆菌菌株RCD-1对葡萄白腐病菌菌丝生长均具有较强的抑制作用，抑菌带直径为15.16mm，菌丝生长抑制率为83.17%。表1.解淀粉芽孢杆 菌菌株RCD-1对葡萄白腐病菌室内抑菌活性测定
权利要求
1.解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens) RCD-1,所述菌株的保藏编号为CGMCC N0.7502。
2.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株RCD-1在防治植物土传病害中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征是，所述植物土传病害为葡萄白腐病、黄瓜炭疽病、核桃炭疽病、苹果炭疽病、葡萄炭疽病、西瓜炭疽病、冬枣黑斑病、板栗枝枯病、石榴干腐病中的一种或几种。
4.一种生物防治制剂，包括权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株 RCD-1。
5.一种制备权利要求4所述的生物防治制剂的方法，其特征是，包括以下步骤: (1)将解淀粉芽孢杆菌菌株RCD-1的孢子移植到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28-30°C摇床振荡培养2-3d得到种子液；所述牛肉膏蛋白胨液体培养基为:胰蛋白胨10g，牛肉膏3g,氯化钠5g，蒸馏水IOOOmL, pH调至7.0-7.2 ； (2)按体积比3.0%的比例将步骤(I)的种子液接种到大量发酵培养基中，培养温度28-30°C，培养时间30h，通风比1:0.9 ;发酵完成后得到发酵液；所述大量发酵培养基为:黄豆粉2.5%,玉米粉3.5%, NaCl 0.1%，CaCO3 0.2%,其余为水； (3)将步骤(2)的发酵液与基质进行混合均匀，干燥；所述发酵液与基质的质量比为I: I ;所述基质选自草炭、微粉碳酸钙和膨润土中的一种或多种。
6.权利要求4所述的生物防治制剂在防治植物土传病害中的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其特征是，所述植物土传病害为葡萄白腐病、黄瓜炭疽病、核桃炭疽病、苹果炭疽病、葡萄炭疽病、西瓜炭疽病、冬枣黑斑病、板栗枝枯病、石榴干腐病中的一种或几种。
8.一种植物土传病害的生物防治方法，其特征是，向具有土传病害的植物施用权利要求I的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株RCD-1或者权利要求4的生物防治制剂。
全文摘要
本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌及其应用，属于生物防治植物病害领域。该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)RCD-1，保藏编号为CGMCC No.7502。本发明还公开了含有上述菌株的生物防治制剂及其制备方法。本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产芽孢量大、作用谱广、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该解淀粉芽孢杆菌制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治植物土传病害，还能有效提高作物产量，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料，防治多种土传植物病害，尤其是葡萄白腐病。
文档编号A01P3/00GK103215209SQ20131014553
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月24日 优先权日2013年4月24日
发明者李鹏, 牛赡光, 王清海, 李泉涌, 刘幸红, 李红梅 申请人:牛赡光, 李鹏