板栗疫病菌致病力基因P5Cdh及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种影响真菌致病力和产孢的板栗疫病菌致病力基因P5Cdh及其应用。该基因含有3个外显子和2个内含子，DNA全长2270bp，cDNA全长1782bp，编码594个氨基酸，表达的蛋白质如SEQ.ID.No.3所示，该蛋白可用于调控板栗疫病菌的致病机理。实验证明，该基因被潮霉素抗性基因hph置换后得到的缺失突变体在离体板栗树枝上形成致病斑极显著小于野生型产生的致病斑，即基因P5Cdh的缺失导致板栗疫病菌的致病力丧失。本发明涉及的基因P5Cdh及其表达载体、宿主等在植物病害防治药物和板栗疫病控制研究方面具有重要意义。低毒病毒侵染板栗疫病菌后抑制P5Cdh基因转录，该基因编码的蛋白可能是低毒病毒侵染后作用的靶标，本发明涉及的低毒病毒与该基因的相互影响为研究病毒-宿主相互作用的分子机制具有重要的意义。
【专利说明】板栗疫病菌致病力基因P5Cdh及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物基因工程和植物保护领域，尤其涉及一种影响真菌致病カ和产孢的板栗疫病菌致病力基因P5Cdh及其应用。
【背景技术】
[0002]板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)是引起板栗疫病的病原菌,在分类上属于子囊菌中的丝状真菌，现在已成为研究植物病原真菌致病机理的ー个模式菌。
[0003]目前，大约70%-80%植物病害都是由植物病原真菌引起的，研究病原真菌的侵染过程是深入研究病原真菌致病分子机理的基础。根据病原真菌侵染寄主的过程了解到病原真菌致病因子和致病基因主要有:⑴与植物病原真菌粘附寄主表面有关，如酯酶和角质酶，真菌通过释放这些酶来改变宿主表面的特性与植物病原真菌侵染结构有夫，如附着胞和侵染钉，真菌通过产生由特化的菌丝形成的侵染结构来帮助入侵并与宿主建立计生关系与侵入有夫，有些病原真菌穿透是通过自然孔ロ入侵，如气孔或伤ロ，有些病原真菌入侵则可直接穿透植物表面必)侵入宿主的病原真菌相应要对宿主产生的防卫物质进行解毒作用，同时也产生一 系列降解酶和有毒性的代谢产物破坏和分解寄主组织，并从中获得水分和营养成分，达到进一歩在寄主体内定殖的作用，如细胞壁降解酶(果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、木质素降解酶)和细胞膜与细胞内含物降解酶(蛋白酶、淀粉酶、脂酶)。通过分析致病因子、分离与克隆致病基因来深入地研究病原真菌的致病分子机理，对于制订持久、有效的病害治理策略具有重大意义。
[0004]在国内，现有栗疫病的主要防治方法是综合防治，包括选育抗病品种、铲除病源和病斑用药。用药主要依赖化学药剂，但化学农药的大量使用会带来环境污染、生态破坏等负面影响，生物防治已越来越受到重视。鉴定致病基因，深入研究其致病机理，为生物农药设计候选的靶标基因，尤其是环保高效杀菌剂设计用靶标的选定具有重要的指导意义。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种板栗疫病菌致病力基因P5Cdh及其应用，该基因在板栗疫病菌的致病机制中起重要作用，对筛选植物病害防治的靶标药物具有重要意义。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:板栗疫病菌致病力基因P5Cdh，具有序列表SEQ.1D.N0.1的碱基序列，由2270个碱基组成，3个外显子和2个内含子分别位于SEQ ID No:1的自5’端的第1-180位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5’端的第254-361位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5’端的第438-1931位碱基为该基因组基因的第三个外显子，自5’端的第181-253位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5’端的第362-437位碱基为该基因组基因的第二个内含子；自5’端的第1_3位碱基为该基因起始密码子ATG，自5’端的第1929-1931位碱基为该基因组基因的终止密码子TGA ；自3'端的第1932-2270位碱基为该基因组基因的3’非编码区；或者具有编码序列表SEQ.ID.N0.3氨基酸序列的碱基序列。
[0007]与上述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh具有50%以上同源性且编码相同功能蛋白质的碱基序列。
[0008]上述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh或其缺失、突变或修饰后的基因在控制板栗疫病菌致病中的应用。
[0009]以上述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh中任一区域碱基序列设计的引物。
[0010]上述引物通过PCR扩增用于检测在化合物处理状况下P5Cdh基因的表达。
[0011]上述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh的cDNA，具有序列表SEQ.1D.N0.2的碱基序列，由1782个碱基组成；或者具有编码序列表SEQ.1D.N0.3氨基酸序列的碱基序列。
[0012]上述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh编码的蛋白质或其同源蛋白，具有序列表SEQ.1D.N0.3,由594个氨基酸组成；或SEQ.1D.N0.4 (稻痕菌(Manapothia oryzae)同源蛋白，一致性 73%)、SEQ.1D.N0.5 (尖孢铼刀菌(Fusarium oxysporum)同源蛋白，一致性 71%)的氨基酸序列。
[0013]上述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh编码的蛋白质或其同源蛋白，氨基酸序列经过不超过10个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加。
[0014]上述蛋白质或其同源蛋白为靶标在设计和筛选抗真菌药物中的应用。
[0015]以上述蛋白质或与其有40%以上一致性的同源蛋白中任一区域氨基酸序列设计的多肽。
[0016]上述多肽制备抗体用于检测在化合物处理状况下P5Cdh蛋白的表达。
[0017]治疗板栗疫病的方法，阻断或抑制板栗疫病菌的P5Cdh的表达。
[0018]本发明所提供的板栗疫病菌编码5-羧基-A1-吡咯啉脱氢酶(A 1-pyrroline-S-carboxylate dehydrogenase)蛋白，名称为 P5Cdh,来源于板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica) EP155 菌株(ATCC 38755)。
[0019]同源蛋白的聚类分析表明，P5Cdh与植物病原真菌稻瘟菌亲缘关系最近(同源性70.4%)，之后为尖孢铼刀菌(同源性为69.2%)、核盘菌(同源性为69.0%)，烟曲霉与产黄青霉(同源性分别为62.8%和62.0%)(图1)，表明P5Cdh蛋白在致病真菌中可能执行ー些相同的基本功能。为了鉴定P5Cdh蛋白功能，将P5Cdh蛋白进行原核表达和酶活检测，对重组蛋白以P5C为反应底物，NAD为末端电子受体，根据检测一系列的浓度梯度NAD接受P5C传递的电子生成NADH以检测酶的动力学常数。根据双倒数法得出Km值为1.48±0.145mM与Vmax值为 1.69±0.1lOumol.S-kcat=OJTi0.050s—1 (如图 2)。为了研究 P5Cdh 在板栗疫病菌中的功能,通过同源重组方法以高效同源重组系统Aku80为出发菌株构建了 P5Cdh的缺失突变体A P5Cdh并进行了功能互补(图3)，构建的突变体经Southern blot验证基因P5Cdh已被潮霉素抗性基因置換。将突变体△ P5Cdh接种到PDA平板培养观察表型，该菌株表型与EP155和Aku80无显著不同，色素增加(图4);将突变体AP5Cdh接种到板栗树枝进行致病力检测，AP5Cdh产生的致病斑大小显著小于EP155和Aku80的致病斑(图4)，可见基因P5Cdh是板栗疫病菌致病力相关基因。突变体AP5Cdh的产孢量(2.51X107±1.03X106个/mL)与 EP155 (2.08X 107±3.38X 106 f/mL)#PAku80 (1.79 X 107± 1.63 X IO6 个 /mL)无显著差异(图5)。低毒病毒侵染突变体AP5Cdh不但使菌株变白且不产抱，而且菌落生长受抑制显著；且低毒病毒抑制基因P5Cdh的转录(图6)。综合以上結果，证明了 P5Cdh基因的缺失导致板栗疫病菌的致病力显著降低。说明P5Cdh基因是板栗疫病菌致病机制所必需的基因。因此，筛选能够阻止该基因表达与其蛋白质的表达、修饰与定位的化合物，可以有效控制板栗疫病菌的毒力，可以作为新型杀菌剂的候选新药物直接利用。也就是说，本发明所提供的P5Cdh的ー个重要用途是，该基因的表达与其蛋白质的表达、修饰与定位可以作为重要靶位点用于抗真菌药剂(特别是抗板栗疫病菌的药剂)的筛选和设计中。进ー步解析该基因參与的致病机制，从中也可以发现候选靶位点用于抗真菌药剂(特别是抗板栗疫病菌药剂)的筛选和设计中。此外，也可以以该基因核苷酸序列的某一区段作为探针或作为PCR引物设计的基础在板栗疫病菌中再分离该序列，也可以用于筛选、分离其它真菌的与该基因具有一定序列同源性的序列。
[0020]本发明证明了低毒病毒侵染导致P5Cdh基因的转录水平下降。说明P5Cdh基因是低度病毒作用板栗疫病菌使其毒力下降的潜在靶基因。本发明所提供的P5Cdh的ー个重要用途是，该基因的转录与其蛋白质的表达、修饰与定位可以作为重要靶位点用于抗病毒药剂(特别是抗真菌病毒的药剂)的筛选和设计中。进ー步解析该基因參与的致病机制，从中也可以发现真菌病毒用于抗真菌药剂(特别是抗板栗疫病菌药剂)的筛选和设计中。
[0021]应用本发明鉴定或辅助鉴定板栗疫病菌的候选杀菌剂可采用如下方法:以前述蛋白为靶点对检测物质进行筛选，将得到的抑制序列所示蛋白表达的待检测物质作为候选的板栗疫病菌的杀菌剂；或以前述蛋白为靶点对检测物质进行筛选，将得到的抑制序列所示蛋白转录的待检测物质作为候选的板栗疫病菌的杀菌剂；如不能抑制，则待测物质为非候选的板栗疫病菌杀菌剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1是P5Cdh与其它植物病原真菌中同源蛋白的聚类分析图。
[0023]图2是P5Cdh的原核表达和酶活检测实验图。其中，
[0024]A是蛋白电泳图:经GST sepherose resin纯化后获得的蛋白P5Cdh A 45。
`[0025]B是酶活动力学曲线图:Lineweaver - Burk双倒数作图法分析重组蛋白GST-P5Cdh A 45的动力学常数Vmax和Km ；P5Cdh活性检测在30°C以0_5mM NAD为底物，于443nm测量产物NADH的浓度，数据显示为三次重复实验的平均数。
[0026]图3是P5Cdh基因的敲除研究实验图。其中，
[0027]A是基因敲除盒构建示意图:左臂正、反向引物分别为P5Cdh_A(5’ -atttagccgtcgtgacatcttcctc_3，)矛ロ PDCdh_J(5，—tctttctagaggatccccgggtaccggattggatggattgagctgt-3’)，右臂正、反向引物分别为 P5Cdh_2 (5’_atatcatcttctgtcgacctgcaggctatccgagcaatgaggtctg-3’ )和 P5Cdh-B (5，-ggtgtgagagagaaggtggtcgttc-3’ )，扩增模板为 EPl55 总 DNA,扩增目的片段大小分别为974bp和1038bp。潮霉素磷酸转移酶基因(hph)正、反向引物分别为 hph_F(5，-cggtacccggggatcctctag-3，)和 hph_R(5，-gcctgcaggtcgacagaagatg-3，)，扩增模板为质粒PCPXHY2。左、右两臂及Hph的PCR扩增片段通过fusion PCR的方法，左、右两臂按照上下游顺序分别融合到hph的两侧，构成基因置换敲除盒，2145bp的hph置换的是P5Cdh基因的第三个外显子区域1454bp (该区域演绎的氨基酸残基含完整的ALDH_F4-17_P5⑶H的功能域)在离第一个外显子约1.5kb上游和3’UTR处各有ー个Hind III酶切位点。[0028]B是Southern blot验证板栗疫病菌P5Cdh基因缺失突变体的构建电泳图:使用探针probel为引物P5Cdh-A/P5Cdh-3扩增的左臂片段，使用探针probe2为引物hphF/hphR(5，-agtagatggatccatccact-3，)扩增的hph启动子区域。野生型EP155、出发菌株Aku80、突变体AP5Cdh和八？50此-(:0111的总0嫩用把11(1111酶切后，电泳顺序如下:M:GeneRulerlKb Ladder ；1:EP155 ；2: A ku80 ；3: A P5Cdh ；4: A P5Cdh_com。如 A 图所示，基因P5Cdh的第三个外显子区域1454bp被hph2145bp置换后，probe I杂交A P5Cdh条带由杂交 EP155、Aku80 和 AP5Cdh-com 的 3466bp 增大为 4157bp ;probe2 杂交 EP155 和 A ku80无条带，杂交AP5Cdh条带为4157bp。
[0029]图4是P5Cdh基因的缺失株菌落表型和溃疡斑实验图。
[0030]图中，将EP155、Aku80、EP713、AP5Cdh 和 AP5Cdh_com 于 PDA 光照培养 14 天的菌落表型JfEP155、Aku80、EP713、AP5Cdh和A P5Cdh_com接种休眠板栗树枝后，于25°C保湿放置30天，对树枝溃疡斑进行观察。
[0031]图5是P5Cdh基因的缺失株产孢量比较图。
[0032]图中，对光照培养14天的菌落分生孢子进行收集，用血球计数板计数。。
[0033]图6是低毒病毒侵染P5Cdh基因的缺失株表型及低毒病毒抑制P5Cdh基因的转录水平实验图。其中，
[0034]A是菌落表型比较图:将EP713和A P5Cdh菌丝融合后，将远离EP713的AP5Cdh接至PDA光照培养7天的菌落表型。
[0035]B是转录水平比较图:提取EP155和EP713的总RNA，反转录合成cDNA第一链，引物 P5Cdh-qf(Sj -ttctacatcaactgcaagag-3J)和 P5Cdh-qr(5, -actcttccttcatggtcctc-3>)扩增P5Cdh基因的cDNA，通过CP18S rDNA校正后，比较EP155和EP713的P5Cdh基因的相对转录水平。
【具体实施方式】
[0036]以下通过实施例和附图进一歩详细说明本发明，其中，实验方法如无特别说明，均为常规方法；实验材料和试剂如无特别说明，均可通过商业途径获得；百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。
[0037]实施例l、P5Cdh与其它真菌中同源蛋白的聚类分析
[0038]将P5Cdh 的氨基酸序列输入 GenBank (http://www.ncb1.nlm.nih.gov)进行BlastP检索，获得多个物种同源蛋白的氨基酸序列。JGI344979是板栗疫病菌P5Cdh蛋白，P5Cdh蛋白在其它真菌中的同源蛋白为:XP_003718931来自稻痕菌(Magnaportheoryzae), EGU80836 来自尖抱祿刀菌(Fusarium oxysporum), XP_750764 来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus), CAP80517 来自广負青霉(Penicillium chrysogenum),XP_001596907 来自核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)。使用 MEGA4.0 软件的邻接法(Neighbor-joining)构建进化树,建树过程选择bootstrap检验1000次,用TREEVIEW进行展示。如附图1所示，P5Cdh与其它植物病原真菌中同源蛋白的聚类分析了该蛋白进化的保守性和亲缘关系(图1 )，与尖孢铼刀菌亲缘关系最近，同源性为69.2%，与核盘菌亲缘关系较近，同源性为69.0%，与稻瘟菌亲缘关系较远，同源性为70.4%，烟曲霉与产黄青霉聚成ー簇，与板栗疫病菌的亲缘关系最远，同源性分别为62.8%和62.0%。[0039]实施例2、P5Cdh的原核表达及酶活检测
[0040]I )P5Cdh的原核表达:用软件MitoPro II预测P5Cdh信号肽为l_45aa，如实施例4的 I)和 3)制备 EP155 的总 RNA，合成 cDNA 第一链，用引物 P5Cdh-f_Hind III(5’-gcgaagcttatggcttctcgcagggtcagtctcc-3 ノ和 P5Cdh-r-Xba I (b'-gcctctagagacctcattgctcggatactcgac-3’)扩增P5Cdh缺失信号肽(l_45aa)的cDNA序列克隆至含GST标签的原核表达载体PGEX-4T-1的Hind III/Sal I的克隆位点内，获得重组表达质粒pGEX-4T_P5Cdh A 45。将重组质粒通过化学转化法导入到大肠杆菌表达宿主BL21的感受态细胞，涂布于含1OOμ g/mL ampicillin的LA平板上进行重组子筛选。获得的转化子经电泳分析及酶切鉴定后，对携带pGEX-4T-P5Cdh A 45的BL21进行诱导表达:将活化的过夜培养物按1%的接种量扩大培养于含50 u g/mL ampicillin的LB培养基中，37°C 200rpm培养至OD600达到0.4 ;加入IPTG至终浓度为0.3mM，将培养物转至20°C 200rpm继续培养6个小时后，即可离心收集菌体。按Ig菌体加入IOml binding buffer重悬菌体,加入Iysozyme至终浓度为0.2mg/ml进行4°C缓慢振荡30min酶解反应，于4°C IOOOOrpm离心20分钟去细胞碎片。将上清液缓慢加入到Glutathione Sepharose resin预装柱内，流速控制在lml/min,再次加入IOmlbinding buffer漂洗杂蛋白后，加入1-2倍柱床体积elution buffer进行洗脱。目的蛋白预测分子量约64KD，GST标签蛋白约26KD，则融合蛋白大小预计为90KD。将洗脱蛋白进行SDS-PAGE电泳分析显示目的条带略大于90KD，与预期大小一致(附图2A)。不需要切除GST标签，直接进行酶活检測。
[0041]2) P5Cdh的酶活检测:向目的蛋白加入10倍体积酶液保存buffer进行稀释，用AmiconlOKD超滤管浓缩后，用Bradford方法定量蛋白浓度约为198 y g/ y I,即2.2 y M。酶活反应以P5C为反应底物，NAD为末端电子受体，根据检测一系列的浓度梯度NAD接受P5C传递的电子生成NADH，测OD33tl值。以标准品NADH制备标准曲线测得吸光系数为6.22cm-1mM-1.取反应速率V倒数I/V为纵坐标，以底物proline浓度[S]倒数1/[S]为横坐标作图，根据双倒数法得出Km值为1.48 + 0.145mM与Vmax值为1.69±0.1lOumol ? s—1，kcat=0.77 ±0.050s-1 (如附图 2B)。
[0042]实施例3、P5Cdh基因在板栗疫病菌中的功能研究
[0043]I)敲除盒的构建
[0044]基因敲除采用同源重组的方法，用潮霉素磷酸转移酶基因替换板栗疫病菌高效同源重组系统中P5Cdh基因的编码区，具体策略见附图2A。左臂正、反向引物分别为P5Cdh_A(5，-atttagccgtcgtgacatcttcctc-3，)矛ロ P5Cdh_3 (5，—tctttctagaggatccccgggtaccggattggatggattgagctgt-3’)，右臂正、反向引物分别为 P5Cdh_2 (5’-atatcatcttctgtcgacctgcaggctatccgagcaatgaggtctg-3，)和 P5Cdh_B (5，-ggtgtgagagagaaggtggtcgttc-3，), f厂增模板为EP155总DNA，扩增目的片段大小分别为929bp和1058bp。潮霉素磷酸转移酶基因(hph)正、反向引物分别为 hph_F(5’ -cggtacccggggatcctctag-3’ )和 hph_R(5’ -gcctgcaggtcgacagaagatg-3’)，扩增模板为质粒pCPXHY2。通过fusion PCR的方法将左、右两臂按照上下游顺序分别融合到hph的两侧，构成基因置换敲除盒，2145bp的hph置换的是P5Cdh基因的第三个外显子区域1454bp (该区域演绎的氨基酸残基含完整的ALDH_F4-17_P5⑶H的功能域)。
[0045]本发明中采用的Fusion PCR方法如下:[0046]分别回收上下游片段及抗性基因并按摩尔比1: 3: I的比例进行融合PCR反应。融合PCR反应条件为:94°C预变性2min ;94°C变性30sec，58°C退火10min，72°C延伸4min，共进行15个循环；最后72°C反应lOmin。以稀释10倍后的融合PCR产物I y I为模板，用引物P5Cdh-A/P5Cdh-B按照常规PCR方法大量扩增。获得的PCR产物为4132bp，经こ醇沉淀浓缩至浓度为l_2y g/y L，可直接用于真菌转化。
[0047]2)互补重组质粒的构建用引物 P5Cdh_F(5’-tgctcaccttgctgctcttggaagt-3’)和P5Cdh_B(5’ -ggtgtgagagagaaggtggtcgttc-3’ )扩增包括启动子区域1.5kb和终止子区域Ikb的基因全长4343bp，并克隆到含有G418抗性基因的互补载体的平端位点Sma I处。
[0048]3)板栗疫病菌的的转化
[0049]在本发明中，板栗疫病菌的的转化采用CaCl2/PEG介导的转化真菌原生质体的方法，原生质体的制备和转化方法具体如下:
[0050]a.原生质体的制备
[0051]配备溶液 0.6M MgSO4UM Sorbitol、OM soluiton (1.2M MgSO4, IOmM NaH2PO4,pH5.8)、Trapping Buffer (0.4M Sorbitol,0.1M Tris-HCl, pH7.0)、STC (IM Sorbitol,0.1M Tris-HCl pH8.0,0.1M CaCl2),PTC(40%PEG3350,0.1M Tris-HCl,0.1M CaCl2,pH8.0)高压灭菌后保存于4°C。
[0052]将保存菌种接种至PDA平板，室温光照培养数天至菌落半径2cm，刮取少量菌丝至100ml EP完全培养基中，25°C静置培养3d后可用于制备原生质体。此时配备酶解液，于50mL OM soluiton加入纤维素酶0.5g、蜗牛酶0.3g及溶菌酶0.2g，过滤灭菌后待用。离心收集菌体，加入30mL0.6M MgSO4漂洗菌体两次，加入50mL酶解液消化菌体细胞壁，于280C 200rpm反应3_4h至镜检观察到菌丝体形成原生质体后，按每管12.5ml酶解反应液分装到50ml corning管中，在液面上缓慢加2倍体积的Trapping Buffer, 3500g4°C离心30分钟后，用巴氏吸管小心地从两层液面交界处吸取原生质体，并转移至新的corning管中，置冰上；加入2倍体积IM Sorbitol漂洗原生质体；重复一次；用15ml STC漂洗原生质体一次；用血球计数板对原生质体进行计数，用STC:PTC按4:1的比例重悬原生质体，同时加入DMSO至终浓度为1%，使原生质体浓度为8 X IO7-1 X IO8个/ml以上；按每管100 U I分装至EP管，置于_80°C保存备用。
[0053]b.板栗疫病菌的转化
[0054]配备再生培养基:200ml再生培养基中含有Casein enzymatic hydrolysate0.2g>yeast extracts0.2g、surcose68.4g、Bacto? Agar3.2g,加热溶解后高压灭菌，于转化前 3h加热溶解，冷却至50°C后放于46°C温育待用。
[0055]取2-5 ii g 纯化的 DNA 与 I ii I spermidine (IOOmM)混勻后,加入 100 ii I 原生质体中，轻轻混匀，冰浴30min ;再加入Iml PTC混匀，室温放置25分钟；7000g4°C离心5min ；弃上清，加入500 ill STC轻轻悬浮沉淀，5000g4°C离心Imin ;弃上清，再次加入500 STC轻轻悬浮沉淀，按170 iil/皿均匀点在洁净无菌的培养皿中，取12ml再生培养基覆盖，并轻轻摇匀；于28°C培养18-24小时后，加入12ml含抗生素的再生培养基覆盖上层，室温培养3-4天至菌落长出。
[0056]c.抗性转化株的纯化
[0057]从再生培养基中挑取的转化株首先要经过2-3轮的抗性筛选，使其具有稳定的抗生素抗性，然后通过单孢分离或原生质体再生进行菌株的纯化。单孢分离的基本过程是:首先将转化株接种于无抗生素的PDA平板上，光照培养14-21天左右使其产孢，用无菌水或
0.02%Tween80洗下孢子，稀释不同的浓度后涂于含有抗生素的PDA培养基上，室温培养3天，挑取单菌落进行检測。
[0058]d.总DNA的提取
[0059]称取Ig菌体放入研钵中，加足量的液氮充分冷却，将菌体研磨成粉末，依次加入 5ml 总 DNA extraction buffer (0.1M Tris-Cl[pH8.0], 0.2M NaCI, 4mMEDTA[pH8.0]，2%SDS)和5ml Tris饱和酚，在融化的过程中用研磨杵不断搅拌使其充分作用。将融化的混合物转入30mL Corning管中，3000g离心40min。吸出上清，加入等体积的苯酚/氯仿、等体积的氯仿各抽提一次。将上清液转至EP管中，加0.7倍体积的异丙醇，混匀后室温IOOOOg离心8分钟，倒掉上清液，用预冷75%こ醇洗沉淀2-3次，自然晾干，カロIOOu IddH2O 或 TE 溶解。
[0060]e.Southern blot
[0061 ] 板栗疫病菌总DNA的酶切、电泳及转膜
[0062]取30-50 u g的基因组DNA，加入Hind III和RNaseA，反应总体积400 U 1，37°C酶切8-16h至电泳检测完全酶切后，こ醇沉淀，溶于50 u I ddH20中；上样于1.0%的琼脂糖凝胶在0.5XTBE的缓冲体系中分离酶切产物。倒入脱嘌呤溶液(0.25N HCl)至没过凝胶，缓慢震荡15min至溴酚兰变黄，ddH20漂洗2次；倒入变性液(0.5M NaOH, 1.5M NaCl)至没过凝胶，缓慢震荡15min至溴酚兰变蓝，倒去变性液后重复一次，ddH20漂洗2次；倒入中和液(1M Tris-Cl, 1.5M NaCl, pH8.0)至没过凝胶，缓慢震荡15min后换新的中和液再次缓慢震荡15min，倒去中和液，加入20XSSC (0.3M柠檬酸钠，3M NaCl)至没过凝胶，缓慢震荡IOmin以上。
[0063]准备与凝胶同样大小的尼龙膜I张及滤纸3张，用铅笔在膜的正面做好标记。
[0064]取大于凝胶的容器装入20XSSC，上边放ー玻璃板，取一张长的滤纸放在玻璃板上，吸水纸两端从玻璃板上垂下浸入20XSSC中并完全湿润，即为盐桥，在盐桥上依次铺放凝胶、尼龙膜、滤纸、吸水纸塔、约Ikg重物，凝胶DNA通过毛细管作用向上转移至尼龙膜用时约8h，取下尼龙膜，DNA面朝上放入紫外交联仪，以1200J、3min紫外照射固定DNA，尼龙膜晾干待用。如立即进行杂交可不用等晾干可直接使用。
[0065]探针的制备
[0066]取15 U I 待标记模板 DNA (0.3-1 U g)及 I U 150ng/ U I 的 Ikb ladder marker 至
1.5mLEP管中，沸水浴IOmin使DNA变性，迅速在冰上冷却；加入4 u I DIG-High prime至变性DNA中，充分混合，37°C温浴Ih，时间越长标记效率越高，但是不要超过20h。65°C温育IOmin停止反应。
[0067]预杂交:将尼龙膜DNA面朝上放入杂交筒中，按每IOOcm2尼龙膜加入42°C预热的IOmL,42°C转动至少 30min。
[0068]杂交:将DIG 标记的 I ii I DNA 探针(约 25ng/mL DIG Easy Hyb)加至 49 U I ddH20中，沸水浴5min变性后迅速放到冰水浴中冷却；将冷却的探针加入42°C预热的DIG EasyHyb (3.5mL/100cm2尼龙膜)中并混匀；倒掉预杂交液并加入探针/杂交液混合液，杂交炉中轻轻转动，42 °C杂交6-20h。[0069]洗膜:在25°C不断转动条件下(杂交炉)，用足量的2XSSC、0.1%SDS洗涤2次，每次5min。在68°C不断转动条件下(杂交炉)，用预热到68°C的0.5XSSC、0.1%SDS洗涤2次，每次 15min。
[0070]免疫显色:下面为IOOcm2杂交膜的免疫检测过程，所有过程在25°C进行，轻轻转动。加入 IOOmLwashing buffer,摇动 l_5min ;倒去 washing buffer,加入 IOOmL Blockingsolution,摇动 30min ;倒去 Blocking solution,加入 2OmL Antibody solution,摇动30min ;弃去 Antibody solution,加入 IOOmL Washing buffer 摇动 15min,重复一次；加入2OmL Detection buffer摇动2_5min ;将膜放入杂交袋，加入ImL CPSD,室温反应5min,吸去多余的CPSD，封ロ，放入37°C IOmin激活显影反应，在暗室中进行X胶片压片，30min后显影液显影，定影液定影。扫描图片保存。
[0071]4)野生型菌株与P5Cdh基因的缺失株生长的比较
[0072]将EP155、A ku80、EP713、A P5Cdh 和 A P5Cdh_com 接到 PDA 平皿上，每个菌株接种3-5份，于25°C光照培养14天后观察表型(图4)，A P5Cdh表型与EP155和A ku80无显
著差异，色素増加。
[0073]5)野生型菌株与P5Cdh基因的缺失株致病カ检测实验
[0074]于每年的1-2月取直径为5cm左右的板栗树干，将其余细枝出去并用蜡封住切ロ，用内径直径为5mm打孔器与树枝上打孔，孔深约l-2mm，每孔间隔约10-12cm ;将板栗疫病菌于PDA平板上光照培养2-3d至菌落直径约为2-3cm，用打孔器取出菌块转接于板栗树枝新孔处，每个菌株接种五份，用封ロ膜封好，保持湿度，将树干室温放置30天后，小心将打孔处周围的树皮削去，即可观察到菌块产生的溃疡斑，測量溃疡斑的长短直径并计算面积，病斑面积=3.14X病斑长轴半径X病斑短轴半径。AP5Cdh的致病斑大小显著小于EP155和Aku80产生的致病斑(图4)。
[0075]6)野生型菌株与P5Cdh基因的缺失株产孢量的比较
[0076]将EP155、A ku80、EP713、A P5Cdh 和 A P5Cdh_com 接到 PDA 平皿上，每个菌株接种3-5份，于25°C光照培养14天后，每皿用IOml0.02%Tween80将分生孢子冲洗下来，于显微镜下计数。每个菌株分析数值至少三个重复。所获得的分手孢子数量除以菌落面积即为该菌落的单位面积产孢量。突变体AP5Cdh的产孢量(2.51X107±1.03X 106个/mL)与EP155 (2.08X 107±3.38X 106 f/mL)Δ ku80 (1.79 X 107± 1.63 X IO6 个/mL)无显著差异(图5)。
[0077]实施例4、低毒病毒抑制P5Cdh基因的转录
[0078]I)总RNA的提取:将接种于PDA光照培养7d的菌体从培养基上刮下，用吸水纸吸去过多水分。称取0.5g菌体加足量的液氮研磨成粉末，立即加入准备好的5ml总DNAextraction buffer和5ml Tris饱和酹的等体积混合物,在溶解的过程中用研磨件不断搅拌使其充分作用。将融化的混合物转入Corning管中，3500g离心40min。弃上清,加入等体积的苯酚/氯仿、等体积的氯仿各抽提一次。将上清液转至EP管中，加0.7倍体积的异丙醇，混匀后室温IOOOOg离心8分钟，倒掉上清液，用预冷75%乙醇洗沉淀2-3次，自然晾干，加100 ill DEPC处理的ddH20溶解。电泳检测所得总RNA的质量和浓度。
[0079]2) dsRNA 的纯化:用 RNase-Free DNase I (Roche)在 25_37°C 消化 15_20min 去除小量残余总DNA，DNase I的用量是lu/iig DNA，经酚/氯仿抽提和乙醇沉淀后，溶于适量的DEPC-H2O中，分光光度计测定RNA的浓度。用1.0%的琼脂糖凝胶在IXTAE (40mMTris-HAc, ImM EDTA, pH8.0)的条件下电泳检测消化后RNA的质量。
[0080]3) cDNA 第一链的合成:反应体系:0.2-2 y g 总 RNA、I u IlOmM primer、加入DEPC-处理水定容至12 Ul ;温和混匀后短暂离心，置于70°C水浴5min后，立即返回冰浴冷却，短暂离心后继续加入 4u 15Xreaction buffer>2 u IlOmM dNTP> I u I RiboLock?RNaseInhibitor (20U)，温和混勻后短暂离心，置于37°C水浴5min后，加入Iul RiboLock?HMinus Reverse Transcriptase (200U)并轻轻混勻，42°C温育 60min, 70°C水浴 5min 终止反应。反应液置于_20°C保存。
[0081]4)荧光定量PCR反应体系如下:稀释合适倍数的第一链cDNA2iil、10XEx TaqBuffer2.5 u 1>2.5mM dNTPl u l>25mM MgCl20.8 u 1> Primerl (5uM) I u 1> Primer2 (5uM)I ill、20 X SYBG Il ill、Ex Taq0.1 yl，加ddH20至总体积25 yl。将反应体系置于荧光定量PCR仪(MJ Opticon II)进行PCR反应，反应条件设置为:94°C预变性，5min ;按照以下參数进行40-50个PCR循环:94°C 20sec ;退火20sec ；72°C 20sec ;读取荧光信号(Plateread)。72°C，5min,从65°C升至95°C，每升温0.2°C读取一次荧光信号，从而进行熔解曲线分析(Melting curve analysis)。所有反应重复三次，以C(t)平均值计算结果,在扩增效率处于80-105%范围内，使用2_AAG(t)方法验证相对基因表达差异。经过三次重复实验，结果表明EP713中P 5Cdh基因表达量仅为EP155的8.5%，下调了 10倍多(图6)。
【权利要求】
1.一种板栗疫病菌致病力基因P5Cdh，其特征在于具有序列表SEQ.1D.N0.1的碱基序列，或者具有编码序列表SEQ.1D.N0.3氨基酸序列的碱基序列。
2.与权利要求1所述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh具有50%以上同源性且编码相同功能蛋白质的喊基序列。
3.权利要求1所述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh或其缺失、突变或修饰后的基因在控制板栗疫病菌致病中的应用。
4.权利要求1所述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh中任一区域碱基序列设计的引物通过PCR扩增用于检测在化合物处理状况下P5Cdh基因的表达。
5.权利要求1所述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh的cDNA，其特征在于具有序列表SEQ.1D.N0.2的碱基序列，或者具有编码序列表SEQ.1D.N0.3氨基酸序列的碱基序列。
6.权利要求1所述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh编码的蛋白质或其同源蛋白，其特征在于具有序列表SEQ.1D.N0.3或SEQ.1D.N0.4、SEQ.1D.N0.5的氨基酸序列。
7.权利要求6所述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh编码的蛋白质或与其有40%以上一致性的同源蛋白，其特征在于:所述氨基酸序列经过不超过10个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加。
8.权利要求6所述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh编码的蛋白质或与其有40%以上一致性的同源蛋白为靶标在设计和筛选抗真菌药物中的应用。
9.权利要求6所述板栗疫病菌致病力基因P5Cdh编码的蛋白质或与其有40%以上一致性的同源蛋白中任一区域氨基酸序列设计的多肽制备抗体用于检测在化合物处理状况下P5Cdh蛋白的表达。
10.一种治疗板栗疫病的方法，其特征在于阻断或抑制板栗疫病菌的P5Cdh的表达。
【文档编号】A01P3/00GK103451204SQ201310233261
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年6月13日 优先权日:2013年6月13日
【发明者】陈保善, 姚姿婷, 邹承武, 周辉, 王金子, 卢立丹, 李洋 申请人:广西大学