一种中药发酵生产灵芝的新方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用中药发酵生产灵芝的新方法，其特征包括以下几个方面：灵芝菌种的筛选、灵芝发酵培养基的制备、灵芝发酵条件的优化、灵芝中活性成分的分析研究。本发明以深层发酵为基础，优化出一种使灵芝生长周期短、活性成分高的新方法，突破了现有常规发酵的途径，丰富了药用灵芝的活性成分及来源。本发明充分利用生物转化技术，得到的灵芝既保留了原来的特性，又提高了灵芝的疗效。
【专利说明】一种中药发酵生产灵芝的新方法
【技术领域】
[0001]本发明属于中药生物转化的应用研究领域。具体为一种利用中药发酵生产灵芝的新方法。
【背景技术】
[0002]灵芝是担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，是一种药用价值极高的真菌类中药，《神农本草经》将其分为赤芝、黑芝、青芝、白芝、黄芝和紫芝。明代著名医学家李时珍在《本草刚目》中对灵芝有比较详尽的阐述，但由于科学条件和灵芝数量的限制，只能通过临床实践对其药用价值做个大致了解，但其中的活性成分、作用机理、药理作用并不清楚。最近几十年，由于人工栽培技术的广泛应用和科学医疗水平的提高，人们对灵芝的成分及作用机理做了大量研究。研究表明，灵芝中主要的活性成分是灵芝多糖，它具有提高人体免疫力、抑制肿瘤、抗血栓、降血糖和抗衰老作用；另外灵芝中还含有甘露醇、麦角固醇、腺嘌呤、尿嘧啶等多种药用有效成分，这些物质对治疗和预防人类的常见疾病有着重大意义。
[0003]灵芝是中药中的瑰宝，在实现人工栽培之前，人们对于灵芝的利用受地域的限制，并且产量很低，无法满足人们日常的需要。随着社会的不断发展和科学技术的不断进步，人们发明了段木栽培生产灵芝，但此方法需要大量的木材，经济上考虑，成本太高；同时也不利于生态环境的保护，故此法很快被淘汰。之后人们又发明了代料栽培，其取材于农林副产品的下脚料，经济成本和环境成本都得到明显降低，但是生产周期比较长，也不利于工业化生产。
[0004]与以上栽培技术不同，利用发酵法生产灵芝菌丝可利用调节发酵培养基和发酵条件等在短时间内生产出大量的灵芝菌丝，所得菌丝与天然灵芝菌丝和人工栽培灵芝菌丝成分相差无几，这种方法的最大优点是易于连续生产、周期短、产量高，切十分易于工业化。但常规的发酵方法所得灵芝菌丝活性成分与天然菌丝相差不大，且菌丝产量不高，本发明筛选出生长周期较短的菌种，之后优化发酵培养基及条件，并在发酵过程中添加一种或者集中中药的混合成分，明显提高的菌丝产量和菌丝中活性成分的含量，除此之外，还使灵芝中含有了所添加中药中的活性成分，进一步提高了灵芝的药用价值。
【发明内容】
[0005]本发明公开了一种利用中药发酵生产灵芝的新方法，其特征包括以下几个方面:灵芝菌种的筛选、灵芝发酵培养基的制备、灵芝发酵条件的优化、灵芝中活性成分的分析研究。本发明以深层发酵为基础，优化出一种使灵芝生长周期短、活性成分高的新方法，突破了现有常规发酵的途径，丰富了药用灵芝的活性成分及来源。本发明充分利用生物转化技术，得到的灵芝既保留了原来的特性，又提高了灵芝的疗效。发明以传统的发酵工艺为基础，利用生物转化技术优化名贵中药才，提高并增加其药效成分，促进名贵中药的合理使用和开发。
[0006]实施方式通过以下实施例对本发明做进一步阐述实施例1
利用8%麦麸粉，5%的黄豆饼粉，0.20%的磷酸二氢钾和0.15 %的硫酸镁做培养基，将菌株的斜面菌种接到液体菌种培养基中，10mL三角瓶装液量30mL，灭菌前调至pH为5.5，于28°C 200rpm转速培养5d得液体菌种。按12%接种量接到深层发酵培养基中，于相同条件下培养6d。发酵液经两层纱布过滤，菌丝体经蒸馏水冲洗数次后，取菌丝于70°C干燥至恒重，电子天平称重菌丝体干重。每个菌株设三次重复，测定结果3次重复的平均值。
[0007]供试菌株包括:灵芝G9、灵芝G8、赤芝、黑芝、紫芝、甜芝；
实施例2
利用I中筛选出的菌株对发酵培养基各成分的浓度进行优化麦麸粉做4%、6%、8%、10%、12%五个浓度；在做麦麸浓度的过程中，其余浓度均按I中培养基浓度。
[0008]黄豆饼粉做1%、3%、5%、7%、9%五个浓度；在做黄豆饼粉浓度时，将确定的8%的麦麸加入到培养基中，其余同I中培养基；
磷酸二氢钾做0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%五个浓度，在做磷酸二氢钾浓度时，将确定的8%的麦麸和5%的黄豆饼粉加入到培养基中，其余同I中培养基；
硫酸镁0.05%,0.10%,0.15%、0.20%,0.25%五个浓度，在做硫酸镁浓度时，将确定的8%的麦麸、5%的黄豆饼粉和0.2%的磷酸二氢钾加入到培养基中。
[0009]在以上液体培养基中加入1%、2%、3%、4%、5%人参粉，看菌丝生长情况及菌丝中活性成分的含量。
[0010]将菌株的斜面菌种接到以上配好的液体菌种培养基中，10mL三角瓶装液量30mL,灭菌前调至pH为5.5，于28V 200rpm转速培养5d得液体菌种。按12%接种量接到深层发酵培养基中，于相同条件下培养6d。发酵液经两层纱布过滤，菌丝体经蒸馏水冲洗数次后，取菌丝于70°C干燥至恒重，电子天平称重菌丝体干重。每个菌株设三次重复，测定结果3次重复的平均值。
[0011]实施例3
利用I中菌种和2中培养基对对培养条件进行优化
培养时间:将菌株的斜面菌种接到以上配好的液体菌种培养基中，10mL三角瓶装液量30mL，灭菌前调至pH为5.5，于28°C 200rpm转速培养5d得液体菌种。按12%接种量接到深层发酵培养基中，于相同条件下分别培养5d、5.5d、6d、6.5d、7d。发酵液经两层纱布过滤，菌丝体经蒸馏水冲洗数次后，取菌丝于70°C干燥至恒重，电子天平称重菌丝体干重。每个菌株设三次重复，测定结果3次重复的平均值。
[0012]培养温度:将菌株的斜面菌种接到以上配好的液体菌种培养基中，10mL三角瓶装液量30mL，灭菌前调至pH为5.5，分别于26 °C、27 V、28 °C、29 V、30 V 200rpm转速培养5d得液体菌种。按12%接种量接到深层发酵培养基中，于相同条件下培养6d。发酵液经两层纱布过滤，菌丝体经蒸馏水冲洗数次后，取菌丝于70°C干燥至恒重，电子天平称重菌丝体干重。每个菌株设三次重复，测定结果3次重复的平均值。
[0013]初始pH:将菌株的斜面菌种接到以上配好的液体菌种培养基中，10mL三角瓶装液量30mL,灭菌前调至pH为4.5,5.0,5.5,6.0,6.5，于28°C 200rpm转速培养5d得液体菌种。按12%接种量接到深层发酵培养基中，于相同条件下培养6d。发酵液经两层纱布过滤，菌丝体经蒸馏水冲洗数次后，取菌丝于70°C干燥至恒重，电子天平称重菌丝体干重。每个菌株设三次重复，测定结果3次重复的平均值。
[0014]搅拌转速:将菌株的斜面菌种接到以上配好的液体菌种培养基中，10mL三角瓶装液量 30mL,灭菌前调至 pH 为 5.5,于 28°C lOOrpm、150rpm、200rpm、250rpm、300rpm转速培养5d得液体菌种。按12%接种量接到深层发酵培养基中，于相同条件下培养6d。发酵液经两层纱布过滤，菌丝体经蒸馏水冲洗数次后，取菌丝于70°C干燥至恒重，电子天平称重菌丝体干重。每个菌株设三次重复，测定结果3次重复的平均值。
[0015]接种量:将菌株的斜面菌种接到以上配好的液体菌种培养基中，10mL三角瓶装液量30mL，灭菌前调至pH为5.5，于28°C 200rpm转速培养5d得液体菌种。按8%、10%、12%、14%、16%接种量接到深层发酵培养基中，于相同条件下培养6d。发酵液经两层纱布过滤，菌丝体经蒸馏水冲洗数次后，取菌丝于70°C干燥至恒重，电子天平称重菌丝体干重。每个菌株设三次重复，测定结果3次重复的平均值。
[0016]实施例4
使用均质机匀浆后，用苯酚硫酸法测定灵芝多糖的含量；用考马斯亮蓝法测定菌丝中总蛋白含量；通过显微鉴别对灵芝菌质检测；薄层色谱法检测灵芝中的人参皂苷Rg3和Rh2 ;用高效液相色谱测定人参皂苷Rg3和Rh的含量。
【权利要求】
1.一种利用中药发酵生产灵芝的新方法，其特征包括以下几个方面: (I)灵芝菌种的筛选:配制液体筛选培养基，将不同供试灵芝菌株斜面接种到筛选液体培养基中，反复筛选3-5次，选出子实体生长最浓密的菌株；所述的液体培养基主要成分为:麦麸粉、豆饼粉、钾盐和镁盐；供试菌株包括:灵芝G9、灵芝G8、赤芝、黑芝、紫芝、甜芝；(2)按照步骤I中所述的培养基配方，对各成分浓度进行优化，之后在发酵液中加入一种或几种中药，并对其浓度优化，按照最优方案配制培养基，灭菌、冷却备用；(3)将步骤I筛选出的菌株接种到步骤2中配好的培养基中，之后对发酵的条件进行优化；优化的发酵条件包括:培养时间、初始pH、培养温度、搅拌转速、接种量；(4)按照步骤2中配置的培养基及3中优化的培养条件对活性成分进行分析。
2.根据权利要求1所述的一种利用中药发酵生产灵芝的新方法，其特征在于，在发酵培养基中加入一种或几种中药，进而促进灵芝活性成分的合成。
3.根据权利要求1所述的一种利用中药发酵生产灵芝的新方法，其特征在于，灵芝的发酵周期相对较短，其周期为6d。
4.根据权利要求1所述的一种利用中药发酵生产灵芝的新方法，其特征在于，灵芝中活性成分含量较野生灵芝中的含量提高50%。
【文档编号】A01G1/04GK104335817SQ201310341006
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年8月7日 优先权日:2013年8月7日
【发明者】张海军, 郭海宏, 赵彦伟 申请人:山东百多安医疗器械有限公司