一种潮霉素选择标记载体及应用该载体培育抗纹枯病的水稻的方法
【专利摘要】本发明涉及一种潮霉素选择标记载体及应用该载体培育抗纹枯病的水稻的方法，将重寄生真菌粉红聚端孢(Trichothecium?roseum)中几丁质酶基因sdTrchi1导入粳稻中花11号品种，提高水稻对纹枯病的抗性。通过RT-PCR获得几丁质酶基因sdTrchi1，构建表达重组质粒pU1301/sdtrchi1，电击法转化农杆菌菌株EHA105，利用农杆菌介导法将该表达载体转入粳稻中花11号品种中。本发明获得的水稻对水稻纹枯病具有较高抗性，为植物病害抗病育种提供抗性基因资源奠定基础。
【专利说明】一种潮霉素选择标记载体及应用该载体培育抗纹枯病的水稻的方法
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及植物生物【技术领域】，具体涉及一种重寄生真菌粉红聚端孢(Trichothecium.roseum)几丁质酶基因sdtrchil的DNA片段的分离克隆,利用强启动子驱动的转基因技术，将重组表达载体pU1301/Sdtrchil通过农杆菌介导法转化水稻中花11号品种。该重组表达载体由几丁质酶基因sdtrchil插入到含潮霉素抗性筛选标记的pU1301载体的BamH I位点得到。本发明获得的水稻对纹枯病的抗性得到明显提高。
(二)【背景技术】
[0002]几丁质酶是一种催化几丁质水解生成N-乙酰葡糖胺反应的酶，几丁质是构成大多数真菌细胞壁的主要成分。重寄生真菌产生的几丁质酶不仅可以抑制真菌菌丝生长、孢子萌发、芽管伸长，降解成熟菌丝顶端，还能降解由几丁质组成的真菌细胞壁。菌寄生真菌几丁质酶作为重要的生防资源，有巨大的应用价值。几丁质酶被认为在植物抗病性尤其是抗真菌性病害中起着重要作用[4]。将外源几丁质酶基因导入植物是抗真菌病害育种的有效手段，可以显著提高抗病性。
[0003]水稻是世界上最主要的粮食作物之一，全球约一半以上的人口以稻米作为主食。水稻纹枯病是水稻生产上普遍发生的一种世界性真菌病害，由立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)引起，是水稻的三大病害之一。长期以来，水稻没有较好的纹枯病抗源，用常规育种方法获得抗纹枯病的水稻品种可能性较小。转基因技术的发展为水稻品种改良提供了新途径。
(三)
【发明内容】
[0004]本发明以粉红聚端孢(Trichothecium.roseum)为材料获得一种几丁质酶基因，命名为8(11'1'(*丨1，全长00嫩为152%?，包含一个含有信号肽的由1278bp构成的开放阅读框，编码425个氨基酸。
[0005]构建重组表达质粒载体pU1301/sdtrchil，利用电击法转化农杆菌EHA105，在含有Kan+Rif/Str的YEP培养基上培养，经过PCR鉴定筛选阳性转化子。获得工程菌株pU1301/sdtrchil-SD。利用农杆菌介导法转化水稻愈伤组织，获得的转基因水稻对水稻纹枯病的抗性提高。
(四)【专利附图】
【附图说明】
[0006]图1植物表达载体pU1301/sdtrchil重组质粒图谱
[0007]图2T。部分再生植株PCR产物电泳图谱
[0008]泳道M:Marker-DL5000
[0009]泳道1-7 =Ttl部分转化植株
[0010]泳道WT:野生型植株[0011]图3T。转基因植株RT-PCR检测
[0012]泳道M:Marker-DL2000
[0013]泳道T-2、T-3、T-14、T-15:转基因阳性植株cDNA为模板
[0014]泳道WT:野生型植株cDNA为模板
[0015]图4转基因阳性植株与野生型对照植株的几丁质酶活对比
[0016]图5转基因阳性植株与野生型对照植株抗病性对比
[0017]图6水稻纹枯病抗性检测
(五)【具体实施方式】 [0018]实施例1:几丁质酶基因sdTrchil的克隆
[0019](I)粉红聚端孢总RNA的提取:取几丁质酶诱导培养基上的菌丝，参照Trizol试剂盒说明。
[0020](2)cDNA 第一条链的合成:按照 Takara 公司的 TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3.0试剂盒说明书进行:取I~2 ii g总RNA，加RNase Free ddH20至9.5 y L，将RNA样品在75°C变性5min，立即在冰浴中冷却5min，然后稍微离心一下，在冰浴中依次加入以下各种成分:10mmol/L dNTP Mixture2 u L, 10XRT Buffer (Mg2+) 2 y L，25mmol/L MgCl24 u L, Oligod (T) -Adaptor Primerl U L, RNase Inhibiter0.5 U L, AMV Reverse Transcriptase IuL(Final Volume 20 ii L),将反应液混合后，室温下放IOmin,然后42°C温育60min,再煮沸5min以灭活反转录酶。加入180 ii L DEPC处理的ddH20，稀释至200 y L，混匀，稍微离心，保存于-20°C，备用。
[0021](3)基因片段的分离:根据已知序列设计特异性引物。上有引物为 5 ' -CACTCCCTTCCTTTCTATAACAATC-3 '，下游引物为:5' -CCTCCTTTCATCATCATATTCGT-3'。
[0022](4)基因克隆:取0.5 ill PCR回收产物与pMD18_T载体进行连接，操作步骤按照TaKaRa公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5 a菌株，在表面涂有X_gal和IPTG的含氨卞青霉素(100 u g/mL)的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培
养基中培养过夜。
[0023](5 )质粒DNA的提取:碱法提取质粒DNA。
[0024](6)序列测定:DNA双脱氧法测定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司进行，序列引物为Ml3启动子引物。
[0025]实施例2:植物表达载体的构建
[0026](I)根据分离出的sdTrchil基因的核苷酸序列设计表达引物，在引物的5’
[0027]端分别引入BamH I酶切位点:
[0028]上游引物:5'-CGGGATCCCACTCCCTTCCTTTCTATAACAATC-3'
[0029]下游引物:5'-CGCGGATCCCCTCCTTTCATCATCATATTCGT-3'
[0030](2光0?反应(251^):。0嫩2111，10XBuffer2.5 u L, IOmmoI/L dNTP2 u L, 25mmol/L ]\%(:1221^，上、下游引物各11^，Taq DNA 聚合酶 0.5 ii L (5U/ii L)，ddH2014 ii L。反应条件为 95°C 5min 预变性；94°C lmin, 59°C 50s, 72°C 90s,共 32 个循环，72°C延伸 lOmin，10°C保存。[0031](3)基因克隆:取0.5yL PCR产物与pMD18-T载体进行连接，获得重组质粒pMD18-T/sdtrchil，操作步骤按TaKaRa公司产品说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5 α，在涂有X-gal和IPTG的LB平板上生长过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。[0032](4 )质粒DNA提取:碱法提取质粒DNA。
[0033](5)用BamH I对重组质粒pMD18_T/sdtrchil产物进行单酶切，同时用BamH I单酶切表达质粒pU1301，DNA胶回收试剂盒回收纯化Trchil基因及载体pU1301片断。然后进行体外连接，获得重组质粒pU1301/sdtrchil,重组质粒转化大肠杆菌JM109,在含Km的LB转化平板上挑选单菌落，提取质粒DNA，进行PCR和酶切鉴定，测序确认重组质粒的读码框正确。
[0034]实施例3:电击法农杆菌感受态细胞的制备
[0035](I)挑单菌落于 5mL YEP 液体培养基(含 Rif50mg/L，含 Str50mg/L)中 28°C、200r/min过夜活化。
[0036](2)取2mL过夜培养的菌液接种于不含抗生素50mL YEP培养基中28°C生长至0D_约等于0.6左右(5h)。
[0037](3)培养物冰浴30min。
[0038](4) 4°C、5000r/min 离心 8min,用 dd H2O 悬浮细胞。
[0039](5)重复步骤(4), 4°C、5000r/min离心5min,悬浮细胞于ImL冰预冷的10%甘油中。
[0040](6)分装100 μ L/管，储存于_80°C待用。
[0041 ] 实施例4:重组表达质粒电击法转化农杆菌及重组农杆菌鉴定
[0042](I)取I支感受态细胞，冰浴融化。
[0043](2)加约0.5 μ g质粒DNA于100 μ L感受态细胞中，冰浴30min。
[0044](3)取出细胞与质粒的混合物转入预冷的电击杯中，细胞与质粒的混合物应沿电击杯杯壁慢慢加入电击杯中，避免产生气泡；电击前擦干电击杯外侧。在1800V高压下电击5_6s0
[0045](4)取出电击杯，加入500mL预冷的YEP培养液(不含抗生素)，轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5mL离心管中。
[0046](5)28°C、200r/min 震荡培养 2_4h。
[0047](6)离心lmin，悬浮细胞于100 μ L YEP培养基中。
[0048](7)涂板，28°C 培养 2_3d。
[0049](8)挑取单菌落，接种于含相应抗生素(Kan+Rif/Str)的LB液体培养基中，28°C振荡培养过夜。菌落PCR鉴定及质粒酶切鉴定。
[0050]实施例5:农杆菌介导法转化水稻
[0051]I愈伤诱导
[0052]I)成熟种子脱壳后70%酒精灭菌lmin，0.15%HgCl2处理15min ；
[0053]2)灭菌单蒸水洗5-7次；
[0054]3)将种子接种到诱导培养基上，每瓶接6-8粒；
[0055]4)置黑暗中26±1°C处理约4-7周。[0056]2愈伤继代
[0057]挑取浅黄、致密且相对较干的胚性愈伤接种到继代培养基上26土1°C处理2周，不可接太多。
[0058]3预培养
[0059]挑取致密且相对较干的胚性愈伤接种到预培养基上置黑暗中3至4天。
[0060]4农杆菌准备
[0061]准备浸染的农杆菌扩大培养。在相应抗性平皿中涂菌，28度培养箱中培养2-3天
[0062]5农杆菌悬浮培养准备
[0063]将农杆菌转移到悬浮培养基中28°C摇瓶培养30-60min。一般100ml培养基用接种环刮入3至4环。
[0064]6农杆菌侵染(共培养)
[0065]I)经过预培养的愈伤转移到一个灭菌的三角瓶中；
[0066]2)调整农杆菌悬浮液的OD6tltl值到0.8-1.0之间；
[0067]3)用农杆菌悬浮液浸泡愈伤20_30min ；
[0068]4)倒去菌液，将三角瓶倒立于含滤纸的灭菌小皿中约15min ；
[0069]5)愈伤放在灭菌`的滤纸上晾干后，转移到共培养培养基上去。培养物19_20°C黑暗处理2天。
[0070]7水洗和筛选
[0071]I)经过共培养的愈伤转移到一个灭菌的三角瓶中；
[0072]2)用灭菌单蒸水洗5至7次愈伤；
[0073]3)用含有400ppm Cn (羧节青霉素二钠)的灭菌水浸泡愈伤30min (封好口后,可于 28 度，180 至 200RPM 摇 20_30min)；
[0074]4)倒去含抗生素的灭菌水，将三角瓶倒立于含滤纸的灭菌小皿中约15min ；
[0075]5)在灭菌的滤纸上晾干愈伤；
[0076]6)转移愈伤到相应抗性的筛选培养基筛选2-3个循环(每个循环约2周)
[0077]8预分化与分化
[0078]I)经过筛选得到的抗性愈伤转到带抗性的预分化培养基的培养皿中，黑暗处理5-7 天；
[0079]2)经过预分化的愈伤转移到100ml三角瓶里的分化培养基中，每瓶3粒愈伤，只选亮黄色的抗性愈伤，不必接入太多。；
[0080]3) 26°C光照处理，约需40-60天。
[0081]9 生根
[0082]I)从分化瓶中挑出要做生根的苗子，同一块愈伤所得的苗子只选一棵；
[0083]2)剪掉所有原有的根，注意不要剪掉分生组织；
[0084]3)将苗子转入生根培养基，28°C光照处理7至10天。
[0085]10 移栽
[0086]移去生根管的封口膜，倒入约Icm深的自来水，在光照培养室炼苗3-4天，移栽至准备好的栽种处。
[0087]实施例6:转基因水稻分子生物学检测[0088](I)PCR检测:采用CTAB法提取转基因水稻株系的基因组DNA，利用特异性引物进行PCR扩增反应，反应结束后取10 μ L扩增产物在1.0%琼脂糖凝胶电泳上进行检测。
[0089](2)RT_PCR检测:采用Trizol法提取叶片总RNA，然后以mRNA反转录出的cDNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增。
[0090](3)转基因阳性植株几丁质酶活性测定:取Ig转基因水稻叶片，在液氮中研成粉末，转移至离心管中，加3mL0.05M pH6.5磷酸缓冲液混匀,4°C、13000r/min离心20min。收集上清液做为酶溶液，用于几丁质酶活性的测定，参考Boller等的方法提取酶液并测定酶活。
[0091](4)转基因阳性植株抗病性检测:将火柴棍截成0.5cm左右小段，灭菌后，加少量PDB培养基使之刚浸没火柴棍。接种纹枯病病菌，26°C下培养3天。然后以此带菌小棍做接种，在转基因水稻分蘖盛期或孕穗期接种水稻纹枯病。接种方法参照Pan等报道，小心将倒三叶鞘挤开，迅速嵌入接种体，松开叶鞘使之恢复自然抱合状态，接种后用塑料膜保湿，并作好记号。接种后第4天、9天、1 8天分别调查病情，并记录每分蘖的病斑长度。
【权利要求】
1.重寄生真菌粉红聚端孢(Trichothecium roseum)中几丁质酶基因sdTrchil导入粳稻中花11号获得转基因植株，其特征在于该技术通过RT-PCR从粉红聚端孢(Trichothecium roseum)获得几丁质酶基因sdTrchil,将该基因克隆到植物表达载体PU1301，获得表达重组质粒pU1301/sdtrchil，转化农杆菌菌株EHA105，利用农杆菌介导法转化水稻愈伤组织，获得转基`因植株对纹枯病的抗性明显提高。
【文档编号】A01H5/00GK103525862SQ201310409663
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月10日 优先权日:2013年9月10日
【发明者】李多川, 贺焜 申请人:山东农业大学