茶树过氧化物酶体生物合成因子CsPEX11基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于茶树基因工程领域，具体涉及一种茶树叶片过氧化物酶体生物合成因子CsPEX11基因及其编码蛋白，同时还涉及利用调节过氧化物酶体生物合成因子CsPEX11基因表达强度在茶树低温防御中的应用。具体而言，本发明给出了一种茶树过氧化物酶体生物合成因子CsPEX11基因，为SEQ?ID?No：1所示的核苷酸序列。本发明还同时给出了上述基因编码的蛋白质，为SEQ?ID?No：2所示的氨基酸序列。本发明还同时给出了上述基因的用途，用于构建转基因植物，所述转基因植物的抵御低温胁迫能力得以增强。
【专利说明】茶树过氧化物酶体生物合成因子CsPEX11基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于茶树基因工程领域，具体涉及一种茶树叶片过氧化物酶体生物合成因子CsPEXII基因及其编码蛋白，同时还涉及利用调节过氧化物酶体生物合成因子CsPEXII基因表达强度在茶树低温防御中的应用。
【背景技术】
[0002]植物正常生长状态下体内活性氧自由基的产生与清除处于动态平衡之中，而在逆境胁迫下，体内自由基(超氧自由基O2._、羟自由基.0Η等)和过氧化氢(H2O2)等大量积累，破坏了动态平衡，导致脂质过氧化，并危及正常生命活动。植物为了保证生命活动的正常进行，常通过各种抗逆代谢途径的调节来抵御胁迫。
[0003]过氧化物酶体(Peroxisome)是一类参与光呼吸调节、脂肪酸β氧化、乙醒酸循环、氮素代谢及植物激素合成等多种重要生化反应的细胞器，普遍存在于真核生物体细胞内。植物体内存在大量过氧化物酶体，其内含有氧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶等多种酶类，是植物解除逆境因子和毒害的重要场所。过氧化物酶体在植物体内呈动态分布且对外界生物及非生物胁迫信号敏感，其数量和大小受到不同的环境、代谢和发育过程的影响。过氧化物酶体生物合成因子(Peroxin, PEX)是一类过氧化物酶体膜蛋白，对过氧化物酶体膜结构组装、膜蛋白定位、基质蛋白输入和过氧化物酶体分裂/增殖等均有重要调节作用，其中PEXll蛋白家族是调节过氧化物酶体增殖及维持稳态的膜延伸因子。
[0004]茶树喜温暖气候，低温不仅限制其生长，如果低温出现的早春茶芽萌动季节，还会导致冷害和冻害的发生，严重时甚至造成春茶的绝收。因此，茶树低温防御研究具有重要意义。茶树低温防御一方面可以采用建防风林、小拱棚和大棚或者烟熏等栽培措施加以控制，另一方面，可通过耐低温茶树品种筛选等育种途径来实现。常规的耐低温品种的选育主要通过杂交、辐射诱变等途径获得，但由于耐低温杂交亲本本身较难获得，而辐射诱变方向存在不确定性，往往使耐低温品种选育效率偏低。如何通过现代分子生物学手段进行耐低温等高抗性茶树种质创新和新品种选育是目前乃至今后一段时间内茶学领域的重要研究方向之一。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种茶树过氧化物酶体生物合成因子CsPEXII基因及其编码蛋白，通过调节该基因表达可提高茶树抵御低温胁迫能力。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明提供一种茶树叶片过氧化物酶体生物合成因子基因CsPEXll，为SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。
[0007]本发明还同时提供了上述茶树过氧化物酶体生物合成因子CsPEXll基因编码的蛋白质，为SEQ ID No:2所不的氣基酸序列。
[0008]本发明还同时提供了上述茶树过氧化物酶体生物合成因子CsPEXll基因的用途，用于构建转基因茶树，所述转基因茶树的抵御低温胁迫能力得以增强。所述植物为茶树、烟草。
[0009]本发明所述基因是应用消减杂交技术从茶树冷诱导叶片与正常叶片中分离的差异基因片段，然后采用RACE技术获得CsPEXl I全长基因。该基因序列全长982bp，其开放阅读框ORF长708bp，位于SEQ ID No:1中5’第61位至768位碱基，编码一个由235个氨基酸残基的蛋白质(766位至768位碱基为开放阅读框的最后三个碱基为终止密码子，不编码氨基酸)JnSEQ ID No:2所示。经与美国生物信息数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)比对证实，SEQ ID No:1所示的核苷酸序列与与蓖麻(登录号为XP_002511795.1)、葡萄(登录号为XP_002273596.1)等的过氧化物酶体生物合成因子PEXll基因序列具有82-85%的同源性。研究表明，PEXll蛋白家族是膜延伸因子，主要控制过氧化物酶体增殖及稳态维持；而且水稻(Oryza sativa L.)中PEXll蛋白家族成员在过氧化氢刺激、盐胁迫和低氮胁迫过程中有不同的表达形式。检索显示，目前也尚未有葡萄和蓖麻过氧化物酶体生物合成因子基因功能及其表达分析等相关文献，茶树中也没有过氧化物酶体生物合成因子相关基因等的公开资料。
[0010]本发明还提供了上述CsPEXll基因编码的蛋白质，由235个氨基酸残基组成，其具有SEQ ID No:2所示的序列。分析显示，该蛋白为脂溶性蛋白，脂溶指数达104.55，属于PEXll过氧化物酶体膜蛋白家族成员之一。该蛋白分子量约为25.93kD，等电点为9.79，其中强碱性氨基酸(Lys，Arg)占14.9%、强酸性氨基酸(Asp，Glu)占8.1%、疏水性氨基酸(Ala, He, Leu, Phe, Trp, Val) 37.9%、极性氛基酸(Asn, Cys, Gin, Ser, Thr, Tyr) 26.5%、其他氨基酸(Met, Gly，Hi s，Pro )12.9%，蛋白结构中含有78.72% α螺旋，0.85% β折叠及20.43%的其他结构。经与美国生物信息数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)比对证实，SEQID No:2所示的氨基酸序列与蓖麻和葡萄等具有86-89%的一致性。此外，检索还显示，目前尚未见茶树中CsPEXll蛋白序列等文献报道。
[0011]本发明提供茶树CsPEXll基因表达强度与冷胁迫关联分析。依据上述获得的茶树CsPEXll基因序列设计表达引物，序列如SEQ ID No:11和SEQ ID No:12所示，设计产物大小为 296bp ;同时以茶树肌动蛋白(Actin,ACT)基因(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/FJ355923)为参比基因设计引物，序列如SEQ ID No:13和SEQ ID No:14，设计产物大小为419bp。在茶树品种园中采集不同品种茶树新梢，实验组以4°C低温处理4h，对照组温度控制为25°C，其它实验条件相同。经总RNA提取、cDNA第一链合成、RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示，不同品种茶树新梢低温处理后CsPEXll基因表达强度均显著高于同品种的对照新梢(图1)。说明CsPEXll基因表达上调是茶树对于低温胁迫的一种应激机制之一，两者之间存在密切因果关联关系。
[0012]本发明进而采用dsRNAi技术验证了 CsPEXll基因表达与茶树耐低温胁迫的关联关系。根据dsRNAi原理设计了用于构建双链干涉表达载体的引物，其中在上游引物的5’端添加了限制性内切酶XbaI与AscI的酶切位点(TCTAGA和GGCGCGCC)和两个保护碱基(AA)，在下游引物 的5’端添加了限制性内切酶BamHI与SwaI的酶切位点(GGATCC和ATTTAAAT)和两个保护碱基(AA)，具体序列如SEQ ID No: 15和SEQ ID No: 16所示，设计产物大小为491bp。以茶树新梢为材料，经RNA提取、cDNA第一链合成、RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳，将目标产物从凝胶中割出，采用DNA凝胶回收试剂盒回收目标条带，并插入T载体，经转化感受态大肠杆菌扩增后，提取重组质粒，经酶切、割胶纯化以及连接反应将目的片段正向和反向插入双链干涉载体PFGC5941，构建包含茶树CsPEXll基因的双链干涉载体pFGC5941-dsCsPEXll。将该载体转化大肠杆菌扩增后，采用冻融法将pFGC5941_dsCsPEXll导入发根农杆菌15834。经发根农杆菌介导转化茶树无菌苗茎段，获得含双链干涉CsPEXll基因的转基因茶树小植株。同时采用野生发根农杆菌侵染茶树无菌苗茎段获得了不含双链干涉CsPEXll基因的野生对照茶树小植株。对上述转基因茶树小植株和野生茶树小植株进行耐低温实验，结果显示，在低温条件下，含双链干涉CsPEXll基因的转基因小植株内源CsPEXll基因表达强度以及对低温的忍耐力均显著低于野生小植株。说明CsPEXll基因表达与茶树的耐低温能力关系十分密切。
[0013]本发明还提供一种利用该基因提高植物耐低温胁迫能力的验证及应用方法。该方法涉及含有所述基因的重组载体以及由所述重组载体转化得到的转基因植物。增强植物耐低温胁迫验证采用转基因烟草进行鉴定，具体做法包括:设计含酶切位点的引物SEQ IDNo:17 (包含Xba I酶切位点TCTAGA和保护碱基AA)和SEQ ID No:18 (包含Sac I酶切位点GAGCTC和保护碱基AA)、RT-PCR扩增茶树CsPEXll基因并插入T载体、经酶切和连接反应构建含茶树CsPEXll的pBI121-CsPEXll表达载体、经农杆菌介导转化获得转基因烟草再生苗。对冷胁迫条件下转基因烟草及野生型对照的生理指标测定及CsPEXll基因表达分析结果显示，转茶树CsPEXll基因烟草，叶片中CsPEXll基因强表达，过氧化物酶体稳定性提高，MDA含量显著低于野生对照，对低温胁迫的忍耐性也显著提高。
[0014]由此可见，茶树CsPEXll基因表达与茶树耐低温能力关系密切，提高CsPEXll基因表达水平可提高茶树对低温胁迫的抵御能力。
[0015]本发明的要点在于提供了 SEQ ID No:1所示的核苷酸序列和SEQ ID No:2所示的开放阅读框氨基酸序列及其在提高植物抗冷胁迫上的应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0017]图1是不同品种茶树冷胁迫叶片与常温对照叶片中CsPEXll基因表达图；
[0018]图中Actin代表茶树肌动蛋白参比基因，该基因表达亮度一致说明该cDNA模板浓度一致；CsPEXll代表茶树叶片过氧化物酶体生物合成因子基因；J1表示“鸠坑”茶树品种低温胁迫处理叶片、J2表示“鸠坑”茶树品种常温对照叶片、LI表示“龙井43”茶树品种低温胁迫处理叶片、L2表示“龙井43”茶树品种常温对照叶片、SI表示“水古”茶树品种低温胁迫处理叶片、S2表示“水古”茶树品种常温对照叶片。
[0019]图2低温胁迫对含双链干涉CsPEXll基因的转基因茶苗内源CsPEXll基因表达及MDA含量的影响图；
[0020]图A为低温胁迫对含双链干涉CsPEXll基因的转基因茶苗内源CsPEXll基因表达的影响。M表示IOObp Marker，并标记出300bp条带；S1、S2表示含双链干涉CsPEXll基因的转基因茶苗(2个重复)的C sPEXll-PCR凝胶泳道；S3、S4表示野生型对照茶苗(2个重复)的CsPEXl 1-PCR凝胶泳道；电泳条带显示在约300bp处，与预计茶树CsPEXl I基因的RT-PCR产物大小(296bp)相符，该图表示茶苗导入双链干涉CsPEXll基因后内源CsPEXll基因表达减弱。
[0021]图B为低温胁迫对含双链干涉CsPEXll基因的转基因茶苗MDA含量的影响。S1、S2表示含双链干涉CsPEXll基因的转基因茶苗(2个重复)；S3、S4表示野生型对照茶苗(2个重复)。该图表明茶苗导入双链干涉CsPEXll基因后叶片MDA含量较对照高75%以上。
[0022]图3是pBI 121-CsPEXl I表达载体构建图；
[0023]图中A表示pBI121载体；
[0024]图中B 表示 Xba I 及 Sac I 酶切 pMD18_T_CsPEXll 后 DNA 片段；
[0025]图中 C 表示酶切 pBI121 载体及 pMD18_T_CsPEXll 经 DNA Ligation Kit Ver.2.1连接后获得的重组pBI 121-CsPEXl I表达载体。[0026]图4是转茶树CsPEXll基因烟草PCR鉴定图；
[0027]图中M表示IOObp Marker,并标记出800bp及700bp条带；B1、B2表示野生对照烟草植株(2个重复)的CsPEXll-PCR凝胶泳道，该泳道无条带表明野生对照植株基因组中未转入重组茶树CsPEXll基因；A1、A2表示转茶树CsPEXll基因烟草(2个重复)的CsPEXll-PCR凝胶泳道，电泳条带显示在700-800bp间，与预计茶树CsPEXll基因的产物大小(744bp)相符，表示该植株成功转化茶树CsPEXll重组基因，即为转茶树CsPEXll基因烟草。
[0028]图5是转茶树CsPEXll基因烟草与野生型烟草冷胁迫生理指标及CsPEXll基因表达对比图；
[0029]图中A表示冷胁迫转基因烟草及野生烟草叶片中CsPEXll基因表达:凝胶检测显示各样品ISsRNA亮度一致，说明各样品RNA模板浓度一致；在该条件下低温胁迫处理后转茶树CsPEXll基因烟草中CsPEXll基因高表达，而野生烟草因未转入茶树CsPEXll，所以没有该基因表达；
[0030]图中B表示冷胁迫转基因烟草及野生烟草叶片中丙二醛(MDA)含量测定；
[0031]图中C显示转基因烟草低温处理后叶片损伤程度；
[0032]从图中可知，在低温胁迫下转茶树CsPEXll基因的烟草相应基因表达强度明显上调，促进了过氧化物酶体生物合成因子合成，提高了过氧化物酶体的稳定性及其对自由基的代谢能力，从而使MDA含量显著低于野生对照，最终使转基因植株表现出较野生对照更高的耐低温能力。
[0033]图6是转茶树、蓖麻和葡萄过氧化物酶体生物合成因子基因烟草叶片丙二醛(MDA)含量对比图。
【具体实施方式】
[0034]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，以便于更好地理解，但并不限定本发明。实施例中的试验方法，如无特殊说明均为常规方法。
[0035]实施例1:茶树过氧化物酶体生物合成因子基因CsPEXll的分离与克隆
[0036]I)利用抑制性消减杂交(SSH)分离茶树过氧化物酶体生物合成因子CsPEXll基因
[0037]选取生长势一致的福鼎大白茶树品种2年生盆栽茶苗，实验前先将盆栽茶苗转移至25°C左右的培养室中，光照强度50ymol/(m2.s)&12h/d，相对湿度80%，预培养7天。试验用茶苗(3盆)转移至培养箱进行4°C处理，光照强度50ymOl/(m2.s)&12h/d，相对湿度80%，对照组仍保持在25°C左右环境中，其他条件与处理组相同，培养5天后采摘处理组和对照嫩叶进行冻存(即，于_80°C冻存3天)。冻存样品经液氮充分研磨后，以TRIzoI法(Invitrogen Life Technologies)分别提取处理组与对照组茶树叶片总RNA,并以01igotexTM-dT30<Super>mRNA Purification Kit(宝生物[大连]有限公司)分别纯化两组mRNAo利用 PCR-Slelect? cDNA Subtraction KitCClontech Laboratories,Lnc., MountainView, USA)进行抑制性消减杂交:分别取处理组和对照组各2 μ g纯化mRNA，以SMARTScribe逆转录酶进行cDNA第一链合成,进而以20 X Second-Strand酶混合物合成cDNA第二链，获得双链cDNA (ds cDNA)。各组ds cDNA经Rsal消化后分成两管，分别与接头Adaptorl(SEQ ID No:3所示)和Adaptor2R (SEQ ID No:4所示)连接成为tester cDNA，未连接接头的为driver cDNA。两次杂交中第一次为过量driver cDNA分别加入两份tester cDNA中变性后退火杂交，使原来有丰度差别的tester单链cDNA均等化，合并两份杂交产物，另加上新的变性driver cDNA再次进行杂交退火，进一步富集差异表达的杂交体分子，并用DNA酶补平末端。进而进行两轮PCR反应，第一次PCR使两端连接有不同接头的双链cDNA片段得以指数扩增，第二次PCR利用巢式引物富集差异表达的基因片段，具体操作参见试剂盒(即PCR-Slelect? cDNA Subtraction Kit试剂盒)使用说明。将差异基因片段PCR产物插入PMD18-T载体(宝生物[大连]有限公司)，并以M13引物组合(分别如SEQ ID No:9和SEQ ID No: 10所示)进行PCR验证，阳性克隆委托Invitrogen公司进行测序。
[0038]序列分析:测得序列利用Vecscreen (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html)除去载体与接头序列得到 EST 片段,经 Blast(http://blast,ncb1.nlm.nih.gov/)序列同源性比对，获得一个与蓖麻(登录号为XP_002511795.1)、葡萄(登录号为XP_002273596.1)等的过氧化物酶体生物合成因子PEXll基因同源性较高的茶树新EST序列。
[0039] 2)茶树过氧化物酶体生物合成因子CsPEXll基因克隆
[0040]依据上述获得的EST序列，比对发现3’端序列已完整,采用Primer Premier5软件(Premier Inc.)设计特异引物(SEQ ID No:5和SEQ ID No:7所示)进行基因5’末端克隆进而获得基因序列全长。
[0041]取福鼎大白茶茶树品种自然常规新梢(I芽2叶)，液氮研磨后以 TRIzol 法(Invitrogen Life Technologies)提取茶树叶片总 RNA,并以01igotexTM-dT30<Super>mRNA Purification Kit (宝生物[大连]有限公司)纯化 mRNA,取I μ g纯化mRNA，以TaKaRa5’ -Full RACE Kit试剂盒(宝生物[大连]有限公司)进行5’端基因序列克隆,mRNA的5’端经Alkaline Phosphatase (CIAP,碱性磷酸酶)的去磷酸化作用和Tobacco Acid Pyrophosphatase (TAP)的“去帽子”反应后，与试剂盒中提供的5’RACE接头连接成为Ligated RNA。Ligated RNA经逆转录酶M-MLV合成第一链cDNA，以第一链cDNA为模板，以特异性引物(SEQ ID No: 5所示)和5’Outer Primer (SEQ ID No:6所示，试剂盒提供)进行Outer-PCR反应，取I μ I Outer-PCR产物，以特异性引物(SEQ IDΝο:7所示)和5’ Inner Primer (SEQ ID No:8所示,试剂盒提供)进行Inner-PCR反应,预计5’END产物长度为650bp-750bp之间，具体操作参见试剂盒使用说明。将上述RACE产物于1.8%琼脂糖凝胶上电泳，并割取目标条带，以TaKaRa Agarose Gel DNA PurificationKit Ver.2.0 (宝生物[大连]有限公司)进行条带回收,插入pMD18_T载体(宝生物[大连]有限公司)，并转化JM109感受态大肠杆菌(全式金[北京]有限公司)，具体操作参见纯化试剂盒、载体及工程菌使用说明。经蓝白斑筛选及通用引物M13 (如SEQ ID No:9和SEQID No: 10所示)PCR检测后，阳性克隆委托Invitrogen公司进行序列分析。
[0042]将成功测序获得的片段序列由SeqMan软件(DNAStar公司)根据重叠区域进行片段拼接，获得CsPEXlI全长序列，该基因长度为982bp，具体如SEQ ID No:1所示。经与美国生物信息数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)比对证实,该序列与蓖麻、番爺和葡萄等具有85%以上的同源性。该序列开放阅读框ORF长708bp，位于SEQ ID No:1中5’端第61位至768位碱基(如SEQ ID No:1划线部分所示)，经SeqBuilder软件推演得到了包含235个氨基酸的蛋白序列，具体如SEQ ID No:2所示，氨基酸序列与蓖麻、番茄和葡萄等具有85%以上的同源性。证明所获得的是编码茶树过氧化物酶体生物合成因子基因CsPEXII的全长基因序列。已有研究表明，PEXll蛋白是调节过氧化物酶体伸长和增殖的关键因子，对过氧化物酶体稳定性有重要贡献；在水稻(Oryza sativa L.)中PEXll蛋白成员在过氧化氢刺激、盐胁迫和低氮胁迫中有不同的表达形式。但目前没有针对蓖麻、葡萄和番茄等过氧化物酶体生物合成因子基因的功能分析。数据库查找显示，茶树中未有发现过氧化物酶体生物合成因子相关基因，证明本发明序列是一种新的茶树基因序列。同时，在其它植物中，尚未有关于该基因表达与抗低温胁迫相关的报道。
[0043]实施例2:茶树过氧化物酶体生物合成因子CsPEXII基因相对基因表达强度与低温胁迫关联分析
[0044]1)不同茶树品种冷胁迫叶片与对照叶片中CsPEXII基因表达
[0045]依据上述获得的茶树过氧化物酶体生物合成因子CsPEXII基因序列，采用PrimerPremier5 软件(Premier Inc.)设计表达引物(序列如 SEQ ID No:ll 和 SEQ ID No: 12 PJf示)，预计产物大小为296bp。同时以茶树肌动蛋白(Actin)基因(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/FJ355923)为参比基因设计引物(序列如 SEQ ID No:13 和 SEQ ID No:14)，预计产物大小为419bp。
[0046]选取3个不同茶树品种(鸠坑、龙井43和水古)2年生盆栽茶苗，每个品种选取生长势相当的6盆用于试验，实验前先将盆栽茶苗转移至25°C左右的培养室中，光照强度50 u mol/(m2 ? s) &12h/d，相对湿度80%，预培养7天。实验组茶苗转移至培养箱进行4°C处理，光照强度50 u mol/(m2 ? s) &12h/d，相对湿度80%，对照组仍保持在25°C左右环境中，其他条件与处理组相同，培养I天后采摘嫩度一致的叶片进行冻存(即，于_80°C冻存3天)。取各样品叶片IOOmg,经液氮研磨后，以TRIzol法(Invitrogen Life Technologies)提取各组茶树叶片总 RNA,以 Takara PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit (宝生物[大连]有限公司)合成cDNA第一链，具体操作参照试剂盒说明书。以第一链cDNA为模板，以CsPEXII特异性引物SEQ ID No: 11和SEQ ID No: 12进行RT-PCR表达验证。RT-PCR采用全式金2XEasy Taq? PCR SuperMix(全式金[北京]有限公司)进行，以肌动蛋白Actin作为参比基因。
[0047]15 ill 反应体系为:ddH204.1 ;2XEasy Taq? PCR SuperMix7.5 U I ；Primer (SEQ ID No:11 和 SEQ ID No:12 或者 SEQ ID No:13 和 SEQ ID No: 14; IOmMeach) 0.6 u I ；cDNA (浓度为 lOOng/u I) 2u 10 PCR 扩增条件为:94°C 预变性 3min ;94°C 变性45s,50°C (CsPEXlI特异性表达引物)或60°C (Actin参比基因引物)退火30s、72°C延伸30s、30个循环；72°C后延伸lOmin。产物以2.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，结果如图1所示。[0048]基因表达结果显示，不同品种低温胁迫处理后，CsPEXll基因表达强度均显著高于同品种的正常温度对照叶片。说明CsPEXll基因表达上调是茶树对于冷胁迫的一种普遍应激响应之一，两者之间存在密切因果关联关系。
[0049]2)茶树CsPEXll基因表达与耐低温能力的关联关系验证
[0050]根据dsRNAi原理设计了用于构建双链干涉表达载体的引物，其中在上游引物的5’端添加了限制性内切酶XbaI与AscI的酶切位点(TCTAGA和GGCGCGCC)和两个保护碱基(AA)，在下游引物的5’端添加了限制性内切酶BamHI与SwaI的酶切位点(GGATCC和ATTTAAAT)和两个保护碱基(AA)，具体上下游引物序列如SEQ ID No:15和SEQ ID No:16所示，设计产物大小为491bp。以福鼎大白茶茶树新梢为材料，以TRIzoI法提取茶树叶片总RNA，以SEQ ID No:15和SEQ ID No:16为引物，采用本实施例步骤I)中的相同方法进行cDNA第一链合成、RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳。将目标产物从凝胶中割出，采用实施例1步骤(2)中相同的方法进行目标条带回收，并插入pMDlS-T载体转化感受态大肠杆菌扩增，获得含茶树CsPEXll基因片段的T载体pMD18-T-pCsPEXll。
[0051]以UNIQ-1O柱式质粒小量抽提试剂盒(生工生物工程[上海]股份有限公司)，提取双链干涉载体质粒 pFGC5941 (Arabidopsis Biological Resource Center)和含茶树 CsPEXll 基因片段的 T 载体 pMD18-T-pCsPEXll,分别以 AscI 和 SwaI (New EnglandBioLabs)进行双酶切，并经过1.5%琼脂糖凝胶电泳，以凝胶DNA纯化试剂盒纯化回收PFGC5941大片段和pCsPEXll目的片段，T4-DNA连接酶16 °C连接过夜，构建含正向CsPEXl I插入序列的重组质粒pFGC5941-CsPEXl I，连接产物转化JM109感受态大肠杆菌。经蓝白斑筛选，将阳性重组克隆于液体LB培养基中扩繁，以UNIQ-1O柱式质粒小量抽提试剂盒提取重组质粒pFGC5941-CsPEXll，同时提取含茶树CsPEXll基因片段的T载体 pMD18-T-pCsPEXll ;分别以 BamHI 和 XbaI(New England BioLabs)进行双酶切，回收阳性重组质粒pFGC5941-CsPEXll的大片段和pCsPEXll目的片段，T4-DNA连接酶16°C连接过夜，将茶树CsPEXll反 向插入pFGC5941-CsPEXll，构建具有双链干涉效果的重组质粒pFGC5941-dsCsPEXll，连接产物转化JM109感受态大肠杆菌。经蓝白斑筛选，将阳性重组克隆于液体LB培养基中扩繁。以UNIQ-1O柱式质粒小量抽提试剂盒提取重组质粒pFGC5941-dsCsPEXl I，采用冻融法将该重组质粒转化感受态发根农杆菌15834。将含重组质粒pFGC5941-dsCsPEXll的农杆菌15834接种于20ml含100mmol/L乙酰丁香酮的液体YMB培养基中，28、0C 250r/min震荡培养至0D600为0.5~0.8 ;将苗龄70天的浙农129茶树无菌苗茎段置于培养后的发根农杆菌菌液中，侵染IOmin后，无菌滤纸吸干多余的菌液，转移于含100mmol/L乙酰丁香酮的固体YMB培养基，黑暗共培养2d后，以1000mg/L头孢噻肟钠(齐鲁制药有限公司)浸泡20min灭活农杆菌，并转移至含500mg/L头孢噻肟钠的MS培养基上，25，1:黑暗培养20d，获得转双链干涉CsPEXll基因的茶树小植株，并转移至12h光照(50 u mol/(m2 ? s) ) /12h黑暗条件下培养(培养温度为25°C)。同时采用相似方法，以野生农杆菌15834侵染浙农129茶树无菌苗茎段，获得不含双链干涉CsPEXll基因对照小植株。将上述两类生长势一致的小植株转移至2°C条件下培养Id后，进行叶片CsPEXll表达情况和丙二醛(MDA)含量分析，同时进行叶片损伤评价。
[0052]丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸显色法测定:称取各处理(2°C条件下培养Id后的转基因植株与野生型植株)叶片0.1gJp 10%三氯乙酸0.2ml，于微量匀浆器中匀浆，并加入0.8mll0%三氯乙酸充分匀衆,匀衆液以4000r/min离心IOmin,取0.2ml上清液,加A 0.2ml0.6%硫代巴比妥酸液,摇匀后沸水浴15min,冷却后4000r/min离心IOmin,取上清作为处理分析液。同时采用相同方法以0.2ml蒸馏水代替匀浆液制备对照分析液。以对照分析液进行调零，分别在532、600和450nm波长下测定吸光度，并按照下式进行MDA含量计算。
[0053]
【权利要求】
1.茶树过氧化物酶体生物合成因子CsPEXII基因，其特征是:为SEQID No:1所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的茶树过氧化物酶体生物合成因子CsPEXII基因编码的蛋白质，其特征是:为SEQ ID No: 2所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的茶树过氧化物酶体生物合成因子CsPEXII基因的用途，其特征是:用于构建转基因植物，所述转基因植物的抵御低温胁迫能力得以增强。
4.根据权利要求3所述的茶树过氧化物酶体生物合成因子CsPEXII基因的用途，其特征是:所述植物为茶树、烟草。`
【文档编号】A01H5/00GK103525826SQ201310428023
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】陆建良, 刘阳, 范方媛, 刘畅, 甘泉, 郑新强, 梁月荣 申请人:浙江大学