纤维素酶在饲料原料中的最适添加量配方的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种纤维素酶在饲料原料中的最适添加量配方。本发明公开的一种饲料，由饲料原料和纤维素酶组成。本发明的选择纤维素酶在饲料原料中最适添加量的方法和得到的最适添加量配方在饲料酶制剂的添加中具有指导意义。
【专利说明】纤维素酶在饲料原料中的最适添加量配方
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种纤维素酶在饲料原料中的最适添加量配方。
【背景技术】
[0002]新陈代谢是生命活动的基础，而构成新陈代谢的许多复杂而有规律的物质变化和能量变化，都是在酶的催化下进行的，可以说，没有酶的参与，生命活动一刻也不能进行。
[0003]20世纪20年代开始有报道，在饲粮中添加酶制剂可提高动物生长速度和饲料转化效率，但是直到20世纪80年代人们才开始懂得如何在饲料工业中发挥酶的力量。饲用酶制剂一般来源于微生物，由木霉、曲霉、酵母和真菌等微生物发酵生产，它是集动物营养学、饲料学、动物生理生化、微生物发酵与酶工程、基因工程等诸学科于一体的应用于现代饲料工业中的一种绿色饲料添加剂，对提高饲料的转化率、拓宽饲料原料的应用范围和比例、节约饲料资源、降低饲料成本和养殖成本，改善饲养环境等起着重要作用。从1984年欧洲在全球首次将酶制剂商品化应用于大麦日粮上开始，到20世纪90年代中期，酶制剂在饲料工业中的应用得到了普遍认可。90年代初，我国开始自行生产销售饲用酶制剂，2000年我国饲用酶制剂的销售量已达到6000t。1998?2008年，动物饲料酶制剂在全球市场每年都以平均13%的速度增长。尤其是2008年后，由于无机磷源的成本高涨，促进了植酸酶在饲料中的普及应用，大大提高了人们对酶制剂的认识和接收程度，也推动了其它酶制剂在饲料工业和养殖领域的应用。
[0004]在动物生产上复合酶制剂的作用显然要大于单体酶，但单体酶作用效果的研究毫无疑问将直接对复合酶的研究起指导作用，复合酶制剂在生产上的应用效果基本上已经得到肯定，但为进一步提高其性价比，更清楚地了解单体酶的作用机理和作用效果是很有必要的。不同的单酶都有其相对应的降解底物，酶的降解作用具有高度的选择性和专一性，目前用在饲料工业上的单酶制剂约有20多种。
[0005]饲用单酶制剂可以根据是否在动物体内大量分泌而分为外源酶和内源酶两种，夕卜源酶主要包括植酸酶和非淀粉多糖酶，其中非淀粉多糖酶又包括木聚糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、果胶酶、纤维素酶等，而内源酶则主要包括蛋白酶、淀粉酶、糖化酶和脂肪酶等。
[0006]纤维素酶(Cellulase)是由多种水解酶组成的一个复杂酶系，其主要由葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶以及β -葡萄糖苷酶等组成，这类酶能将纤维二糖、三糖和纤维糊精等水解成单个葡萄糖。由于纤维素存在天然的特异性，纤维素酶必须用不同酶系协同作用才能完全将其分解，其中内切葡萄糖酶进入纤维素的非结晶区，形成外切纤维素酶所需的游离末端，然后外切纤维素酶从多糖链的非还原末端切下纤维二糖单位被β-葡萄糖苷酶水解形成葡萄糖。
[0007]纤维素酶作为饲料添加剂使用，其功能主要有以下几点:①摧毁植物细胞壁，促进营养物质吸收。纤维素酶可在木聚糖酶、半乳糖苷酶等半纤维素酶的协同作用下破坏植物细胞壁，使细胞内容物释放出来，以利于动物进一步降解吸收，同时也增加了非淀粉多糖的消化，进而改善高纤维饲料原料的利用率；②补充动物内源消化酶的不足，剌激动物内源酶的分泌。纤维素酶可以改善动物消化道酶系的组成、酶分泌量及活性，尤其对幼龄动物及病态和应激状态下的成年畜禽；③改善动物胃肠道中微生态环境，促进小肠对营养物质的消化吸收。纤维素、半纤维素和果胶等会增加动物胃肠道内溶物的粘度，阻碍动物体内消化酶与营养物质的接触，导致动物对饲料消化吸收利用率降低，黏稠的消化道食糜还会引起有害微生物滋生。而纤维素酶可降低食糜黏度，加强动物胃肠道内容物流动性，降低有害微生物在动物肠道附着可能性。纤维素酶还可促进肠道有益微生物生长，提高微生物对饲料的分解；纤维素酶同时具有维持动物小肠绒毛形态完整，提高营养物质吸收率的功能。
[0008]要在饲料中发挥酶制剂的最佳效果，必须有精确的应用体系。在一定日粮中如何精确的使用酶制剂，一是要考虑原料中酶的底物的种类，针对性地添加；二是要考虑其含量，确保有足够的底物与酶作用才能发挥效果；三是要根据动物的特异性来设计。目前，对于饲用酶制剂在饲料中的添加量研究，多以动物养殖试验为主，市场上对于饲用酶制剂的添加量，主要通过在动物试验的基础上再结合实际生产成本确定，很少有人从酶制剂作用关系入手，进行系统的研究。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种纤维素酶在饲料原料中的最适添加量配方。
[0010]本发明提供的一种确定纤维素酶在饲料原料中最适添加量的方法，包括如下步骤:
[0011](I)得出每千克饲料原料中纤维素的量；
[0012](2)测量纤维素酶的酶活，所述纤维素酶的酶活定义为在37°C pH为5.5的条件下，每分钟内从过量底物中降解释放I μ mol还原糖所需的酶量定义为I个酶活力单位，IU ；
[0013]所述底物为步骤(I)所述的饲料原料；
[0014](3)根据步骤(2)所得的酶活，及下述公式，计算出每克步骤(I)中所述饲料原料所需纤维素酶的量，即为理论添加量；
[0015]Q= (CXI UX Imin) / (I μ mol XMX 120min)
[0016]式中:
[0017]Q——酶的理论添加量，U/g ；
[0018]C——每千克所述饲料原料中纤维素的量，g/kg ；
[0019]M——葡萄糖的摩尔质量，180g/mol ;
[0020]120min-酶的作用时间；
[0021]1U, Imin, I μ mol-酶活定义参数；
[0022](4)以步骤(3)所得酶的理论添加量为基数，记作Q ;n为Q的倍数，以nXQ组成该酶的梯度添加量，其中 η 为 1/2、1/4、1/6、1/8、1/10、1/20、1、2、4、6、8、10、20 ；
[0023]所述梯度添加量是针对饲料原料来说的，即每克饲料原料中应添加多少U的酶；
[0024](5)进行体外酶解实验，体外酶解实验的体系如下:
[0025]I)将2g饲料原料加入15.0mL pH3.0的0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，再加入0.5mL浓度为70mg/mL的胃蛋白酶溶液，混匀，得食糜液；胃蛋白酶溶液中溶剂为0.01mol/L盐酸水溶液；[0026]2)用1.0mol/L盐酸水溶液调节食糜液的pH值至3.0 ;
[0027]3)将食糜液混合均匀后置于40°C振荡消化，消化75分钟；
[0028]4)用1.0mol/L氢氧化钠水溶液调整步骤3)所得消化液的pH值至6.3,然后加入50mg胰酶；
[0029]5)实验分两组，第一组称作加酶组，即向步骤4)所得体系中加入纤维素酶，所述酶的添加量为步骤(4)所设的梯度添加量；第二组称作不加酶组，即向步骤4)所得体系中加入2.0mL 0.2mol/L pH6.3的乙酸-乙酸钠缓冲溶液；然后，第一组和第二组均置于40°C振荡消化，消化时间为120min ；
[0030](6)还原糖测定，分别检测加酶组和不加酶组的还原糖的浓度，分别记作Ye和\，单位为mg/mL ；
[0031](7)按照如下公式计算纤维素酶酶解产生的还原糖占饲料原料的质量百分含量:
[0032]ΔΜ=(( (Ye-Y0) X D X V) /m) X 100
[0033]ΔΜ——酶解产生的还原糖占所加饲料原料的质量百分含量，% ；
[0034]D—测定液稀释倍数，等于ImL除以还原糖测定时离心上清液吸取量；
[0035]V-消化反应体系总体积,27mL ;
[0036]m-消化反应称取饲料原料样品的质量，2000mg ；
[0037]100——百分比换算系数；
[0038](8)以η为横坐标，以对应的ΛΜ为纵坐标作图，得到曲线的拐点，并取拐点前两组和拐点后两组的η值；
[0039](9)将步骤(8)得到的η对应的组之间进行ΛM差异分析，按照步骤(8)的η由小到大的顺序，得到与步骤(8)的η最小的一组有显著差异的第一组，纤维素酶在该组饲料中的添加量就是纤维素酶在所述饲料原料中的最适添加量；
[0040]所述酶为纤维素酶；
[0041]所述还原糖为葡萄糖。
[0042]上述方法中，所述还原糖测定步骤如下:
[0043](I)取出透析管，将消化液离心5min (5000r/min)，取一定量上清液，用水定容至
2.0mLjP 3.0mL DNS煮沸显色，以水为空白调零，540nm测量加酶组和不加酶组的吸光值，分别记作Xe和X。；
[0044](2)用DNS法绘制葡萄糖标准曲线，以葡萄糖含量(mg)为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线，得到公式Y=aX+b ；
[0045](3)分别将Xe和Xtl代入(2)的公式，计算加酶组和不加酶组的还原糖的浓度，分别记作Ye和Y0,单位换算为mg/mL ；
[0046]所述还原糖为葡萄糖。
[0047]上述任一所述的方法中，所述饲料原料为玉米、豆柏、小麦、麸皮、米糠柏、菜柏、棉柏和DDGS中任意一种。
[0048]一种饲料也属于本发明的保护范围，该饲料由饲料原料和纤维素酶组成。
[0049]上述饲料中，所述饲料原料为玉米、豆柏、小麦、麸皮、米糠柏、菜柏、棉柏和DDGS中任意一种。
[0050]上述任一所述的饲料中，所述玉米与所述纤维素酶的比例为lg:4.98U;所述豆柏与所述纤维素酶的比例为Ig:28.62U;所述小麦与所述纤维素酶的比例为Ig:8.88U；所述麸皮与所述纤维素酶的比例为Ig:19.44U ;所述米糠柏与所述纤维素酶的比例为Ig:
22.8U ;所述菜柏与所述纤维素酶的比例为Ig:27.78U ;所述棉柏与所述纤维素酶的比例为Ig:44.48U ;所述DDGS与所述纤维素酶的比例为Ig:9.72U ；
[0051]所述U的定义为:纤维素酶在37°C、pH为5.5的条件下，每分钟从过量底物中降解释放I μ mol还原糖所需的酶量定义为IU ；
[0052]所述底物为所述饲料原料；
[0053]所述还原糖为葡萄糖。
[0054]与理论添加量对比表明，各饲料原料对纤维素酶的需要量都高于理论添加量，要想完全发挥酶制剂在饲料中的酶解效果，必须添加足量的酶。本发明的选择纤维素酶在饲料原料中最适添加量的方法和得到的最适添加量配方在饲料酶制剂的添加中具有指导意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0055]图1为不同浓度的纤维素酶酶解不同饲料原料生成产物量的曲线图。
【具体实施方式】
[0056]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0057]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0058]纤维素酶购自北京挑战生物技术有限公司，产品目录号为YL-156。
[0059]DDGS (酒糟蛋白饲料)购自吉林省新天龙实业股份有限公司。
[0060]胃蛋白酶购自Sigma，货号为P7000。
[0061]胰蛋白酶购自Sigma，货号为P7545。
[0062]氢氧化钠溶液(200g/L)按照如下方法配制:称取氢氧化鈉20.0g，加水溶解，定容至 IOOml ο
[0063]乙酸溶液(0.lmol/L)按照如下方法配制:吸取冰乙酸0.60ml,加水溶解,定容至IOOml。
[0064]乙酸钠溶液(0.lmol/L)按照如下方法配制:称取三水乙酸钠1.36g,加水溶解,定容至100ml。
[0065]乙酸-乙酸钠缓冲溶液(0.lmol/L, pH5.5)按照如下方法配制:称取三水乙酸钠
23.14g，加入冰乙酸1.35ml，再加水溶解，定容至2000ml，测定溶液的pH值，如果pH值偏离
5.5，再用乙酸溶液(0.lmol/L)或乙酸钠溶液(0.lmol/L)调节至ρΗ5.5。
[0066]10.0mg/ml葡糖糖溶液按照如下方法配制:
[0067]称取无水葡萄糖1.000g，加乙酸-乙酸钠缓冲液(0.lmol/L, pH5.5)溶解，定容至IOOml。
[0068]羧甲基纤维素钠购自Sigma,货号为C5678。
[0069]8.0g/Ι羧甲基纤维素钠溶液按照如下方法配制:
[0070]称取羧甲基纤维素钠0.80g,加入80ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液(0.lmol/L,PH5.5)。磁力搅拌，同时缓慢加热，直至羧甲基纤维素钠完全溶解(注:在搅拌加热的过程中可以补加适量的缓冲液，但是溶液的总体积不能超过100ml)。然后停止加热，继续搅拌30min，用乙酸-乙酸钠缓冲溶液(0.lmol/L,pH5.5)定容至100ml。羧甲基纤维素钠溶液能立即使用，使用前适当摇匀。4°C避光保存，有效期为3天。
[0071]DNS试剂按照如下方法配制:称取3，5-二硝基水杨酸3.15g(分析纯)，加水500ml，搅拌5s，水浴至45°C。然后逐步加入IOOml氢氧化钠溶液(200g/L)，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明(注意:在加入氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48°C)。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45°C水浴加热，同时补加水300ml,不断搅拌,直到加入的物质完全溶解。停止加热,冷却至室温后,用水定容至1000ml。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7天后可以使用，有效期6个月。
[0072]下述实施例中纤维素酶活力的测定方法如下:
[0073](一)标准曲线的绘制
[0074]吸取乙酸一乙酸钠缓冲溶液(0.lmol/L, pH5.5) 4.0mL，加入DNS试剂5.0mL，沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温,用水定容至25.0mL,制成标准空白样。
[0075]分别吸取葡萄糖溶液(10.0mg/ml) 0、0.10,0.20,0.30,0.40,0.50,0.60 和0.70ml,分别用乙酸-乙酸钠缓冲溶液(0.lmol/L, ρΗ5.5)定容至10ml,配制成浓度为0.10mg/ml-0.70mg/ml葡萄糖标准溶液。
[0076]分别吸取上述浓度系列的葡萄糖标准溶液各2.0Oml (做两个平行)，分别加入到刻度试管中，再分别加入2ml乙酸-乙酸钠缓冲溶液(0.lmol/L,pH5.5)和5ml DNS试剂。电磁振荡3s，沸水浴加热5min。然后用自来水冷却到室温，再用水定容至25mL。以标准空白样调零，在540nm处测定吸光度OD值。
[0077]以葡萄糖浓度mg为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线。每次新配制DNS试剂均需要重新绘制标准曲线。
[0078](二)酶活的测定
[0079]1、吸取10.0mL羧甲基纤维素钠溶液(8.0g/l)，37°C平衡IOmin。
[0080]2、吸取10.0mL经过适当稀释的酶液，37°C平衡lOmin。
[0081]3、吸取2.0OmL经过适当稀释的酶液(已经过37°C平衡)，加入到刻度试管中，再加入5mL DNS试剂，电磁振荡3s。然后加入2.0mL羧甲基纤维素钠溶液(8.0g/l )，37°C保温30min,沸水浴加热5min。用自来水冷却至室温,加水定容至25mL,电磁振荡3s。以标准空白样调零，检测在540nm处吸光度，记作Ab。
[0082]4、吸取2.0OmL经过适当稀释的酶液(已经过37°C平衡)，加入到刻度试管中，再加入2.0mL羧甲基纤维素钠(8.0g/l)(已经过37°C平衡)，电磁振荡3s，37°C精确保温30min。加入5.0mL DNS试剂，电磁振荡3s，以终止酶解反应。沸水浴加热5min，用自来水冷却至室温，加水定容至25mL，电磁振荡3s。以标准空白样调零，检测在540nm处吸光度，记作AE。
[0083]5、根据各试样的吸光度值以及步骤(一)得到的标准曲线回归方程，计算各试样中的还原糖(葡萄糖)的量。
[0084]按照公式I和2计算试样在对应温度及pH条件下的酶活力。
[0085]
【权利要求】
1.一种确定纤维素酶在饲料原料中最适添加量的方法，包括如下步骤: (1)得出每千克饲料原料中纤维素的量； (2)测量纤维素酶的酶活，所述纤维素酶的酶活定义为在37°CpH为5.5的条件下，每分钟内从过量底物中降解释放I μ mol还原糖所需的酶量定义为I个酶活力单位，IU ； 所述底物为步骤(1)所述的饲料原料； (3)根据步骤(2)所得的酶活，及下述公式，计算出每克步骤(1)中所述饲料原料所需纤维素酶的量，即为理论添加量；
Q= (CXI UX Imin) / (I μ mol XMX 120min) 式中: Q——酶的理论添加量，U/g ； C—每千克步骤(1)所述饲料原料中纤维素的量，g/kg ； M——葡萄糖的摩尔质量，180g/mol ； 120min——酶的作用时间； 1U, Imin, I μ mol-酶活定义参数； (4)以步骤(3)所得酶的理论添加量为基数，记作Q;n为Q的倍数，以nXQ组成该酶的梯度添加量，其中 η 为 1/2、1/4、1/6、1/8、1/10、1/20、1、2、4、6、8、10、20 ； (5)进行体外酶解实验，体外酶解实验的体系如下: 1)将2g饲料原料加入15.0mL pH3.0的0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，再加入·0.5mL浓度为70mg/mL的胃蛋白酶溶液，混匀，得食糜液；胃蛋白酶溶液中溶剂为0.01mol/L盐酸水溶液； 2)用1.0mol/L盐酸水溶液调节食糜液的pH值至3.0 ; 3)将食糜液混合均匀后置于40°C振荡消化，消化75分钟； 4)用1.0mol/L氢氧化钠水溶液调整步骤3)所得消化液的pH值至6.3，然后加入50mg胰酶； 5)实验分两组，第一组称作加酶组，即向步骤4)所得体系中加入纤维素酶，所述酶的添加量为步骤(4)所设的梯度添加量；第二组称作不加酶组，即向步骤4)所得体系中加入·2.0mL 0.2mol/L pH6.3的乙酸-乙酸钠缓冲溶液；然后，第一组和第二组均置于40°C振荡消化，消化时间为120min ； (6)还原糖测定，分别检测加酶组和不加酶组的还原糖的浓度，分别记作Ye和\，单位为 mg/mL ； (7)按照如下公式计算纤维素酶酶解产生的还原糖占饲料原料的质量百分含量: ΔΜ=(( (Ye-Y0) X D X V) /m) X 100 ΔΜ——酶解产生的还原糖占所加饲料原料的质量百分含量，% ； D——测定液稀释倍数，等于ImL除以还原糖测定时离心上清液吸取量； V-消化反应体系总体积，27mL ； m-消化反应称取饲料原料样品的质量，2000mg ； 100—百分比换算系数； (8)以η为横坐标，以对应的AM为纵坐标作图，得到曲线的拐点，并取拐点前两组和拐点后两组的η值；(9)将步骤(8)得到的η对应的组之间进行AM差异分析，按照步骤(8)的η由小到大的顺序，得到与步骤(8)的η最小的一组有显著差异的第一组，纤维素酶在该组饲料中的添加量就是纤维素酶在所述饲料原料中的最适添加量； 所述酶为纤维素酶； 所述还原糖为葡萄糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述还原糖测定步骤如下: (1)取出透析管，将消化液离心5min(5000r/min )，取一定量上清液，用水定容至2.0mLjP 3.0mL DNS煮沸显色，以水为空白调零，540nm测量加酶组和不加酶组的吸光值，分别记作Xe和X。； (2)用DNS法绘制葡萄糖标准曲线，以葡萄糖含量(mg)为Y轴、吸光度OD值为X轴，绘制标准曲线，得到公式Y=aX+b ； (3)分别将Xe和Xtl代入(2)的公式，计算加酶组和不加酶组的还原糖的浓度，分别记作Ye和Y。,单位换算为mg/mL ； 所述还原糖为葡萄糖。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述饲料原料为玉米、豆柏、小麦、麸皮、米糠柏、菜柏、棉柏和DDGS中任意一种。
4.一种饲料，由饲料原料和纤维素酶组成。
5.根据权利要求4所述的饲料，其特征在于:所述饲料原料为玉米、豆柏、小麦、麸皮、米糠柏、菜柏、棉柏和DDGS中任意一种。
6.根据权利要求4或5所述的饲料，其特征在于:所述玉米与所述纤维素酶的比例为Ig:4.98U ;所述豆柏与所述纤维素酶的比例为Ig:28.62U ;所述小麦与所述纤维素酶的比例为Ig:8.88U ;所述麸皮与所述纤维素酶的比例为Ig:19.44U ;所述米糠柏与所述纤维素酶的比例为Ig:22.8U ;所述菜柏与所述纤维素酶的比例为Ig:27.78U ;所述棉柏与所述纤维素酶的比例为Ig:44.48U ;所述DDGS与所述纤维素酶的比例为Ig:9.72U ； 所述U的定义为:纤维素酶在37°C、pH为5.5的条件下，每分钟从过量底物中降解释放Iμ mol还原糖所需的酶量定义为IU ； 所述底物为所述饲料原料； 所述还原糖为葡萄糖。
【文档编号】A23K1/165GK103518976SQ201310484374
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月16日 优先权日:2013年10月16日
【发明者】汤海鸥, 蔡辉益, 杨禄良, 谢宁, 王晓睿 申请人:天津博菲德科技有限公司