一种龙爪柳茎的增殖方法
【专利摘要】本发明公开了一种龙爪柳茎的增殖方法，通过植物组织培养的方法以龙爪柳茎为外植体对龙爪柳茎进行增殖，在组织培养中所用培养基包括MS、0.01～1mg/L萘乙酸（NAA）、0.05～2mg/L玉米素、30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂粉，根据本发明提供的方法，可快速稳定的对龙爪柳茎进行增殖，操作简单易控，增殖率高。
【专利说明】一种龙爪柳茎的增殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及林木培育领域，特别涉及植物组织培养领域。
【背景技术】
[0002]龙爪柳，又名龙须柳，拉丁名:Salix matsudana var.tortuosa,科名:杨柳科Salicaceae柳属，是生长在东北、华北、西北、华东等地的杨柳科柳属落叶灌木或小乔木，湿地、旱地皆能生长，生长快，其有阳性，耐寒等特点，春季至夏季为适期，其枝条卷曲，姿态别致，在园林中广泛应用栽培，但其数量有限，并且自身繁殖不易，因此在园林应用中受到一定的限制，目前尚无良好的繁殖方法对其进行大规模繁殖。
[0003]龙爪柳的繁殖方法有播种法或扦插法繁殖。其中，播种法即是在适宜萌芽的条件下在土壤中播撒龙爪柳种子，等待龙爪柳自然萌芽。由于获取龙爪柳种子受到时间和空间的限制，而且种子自然出芽率低，同时，在野外培养中，土地养料状况、细菌浓度等因素都会对龙爪柳的生长有不可控的影响。此外，播种法育种周期长，种苗变异大，受气候、土壤、水源等自然条件限制严重，植物出芽率、成活率低，选种、播种工作繁重，还需要人工管护、基地、劳动强度大，所需运输等费用大，因此播种法不适合大面积播种和推广。
[0004]扦插法是将植物的营养器官:根、茎、叶作为插条进行扦插从而形成独立植株的繁殖方法，该方法培育的植株比播种苗生长快，短时间内可以培育成大苗，避免了种苗的变异问题，然而，传统的扦插方法对插条的需求量大，要求高，而且取材时间固定，同时，植物体的根、茎、叶数量有限，因此会对扦插方法的大规模应用造成限制，此外，该方法存在成活率低，育种周期长，增殖速度慢，管护等费用高的问题。
[0005]植物组织培养是在人工培养基中，将离体组织细胞培养成为完整植株的增殖方法。采用植物组织培养方法增殖植物具有占地面积小，增殖周期短，全年都能进行增殖，增殖系数高等特点，同时还可以消除母本植物带来的某些病毒，因此，目前利用植物组织培养来繁殖难以自身繁殖的植物正在 大规模推广。如，中国专利CN200610050993.9公开了一种西洋杜鹃组培快速繁殖及试管开花的方法及所用的培养基，其在外植体准备过程中使用含有重金属离子的氯化汞溶液进行消毒，会造成环境污染，其使用的培养基含有Read、MS有机成分物、鹿糖20~30g/L、玉米素1.0~2.5mg/L、萘乙酸0.05~0.lmg/L、琼脂9~Hg/L，pH5.0~5.4。该培养基用于常绿灌木西洋杜鹃的组培块快速增殖。
[0006]然而，目前尚未有利用植物组织培养的方法对龙爪柳茎进行增殖的报道。
【发明内容】
[0007]为了克服上述问题，本发明经锐意研究，结果发现:龙爪柳茎在包括MS、0.01~lmg/L萘乙酸(ΝΑΑ)、0.05~2mg/L玉米素、30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂粉的培养基可迅速增殖，具有不受自然条件限制、增殖迅速、种苗变异小等优势。其中，加入的萘乙酸和玉米素等激素使龙爪柳茎的增殖效率提升。本发明人经不断探索，确定萘乙酸和玉米素促进龙爪柳茎增殖的最佳浓度分别为0.lmg/L和lmg/L，经多次试验证明，该两种激素在此浓度下能够有效诱导龙爪柳茎增殖。
[0008]因此，本发明以MS、萘乙酸(NAA)、玉米素、蔗糖和琼脂粉制备培养基，并在此培养基中对龙爪柳茎进行增殖，从而完成本发明。
[0009]本发明的目的在于提供以下几方面:
[0010]第一方面，本发明提供一种龙爪柳茎的增殖方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0011](I)外植体的选取，包括以下子步骤:
[0012](1-1)每年4~10月选取龙爪柳当年生嫩莖的形态学上端4~5节,每一节作为一个外植体，冰袋保存；
[0013](1-2)将(1-1)中取得的外植体上叶片的形态学上端剪去，保留叶片的形态学下端0.5 ~Icm ；
[0014](2)外植体灭菌，包括以下子步骤:
[0015](2-1)将(I)处理过的外植体以流动水冲洗；
[0016](2-2)将(2-1)中处理后的外植体移至超净工作台中进行以下操作:
[0017]①用75%酒精对 外植体进行表面灭菌30~60s，后用灭菌水冲洗酒精灭菌后的外植体；
[0018]②在不断摇动的条件下，用0.5~1%次氯酸钠溶液对①处理后的外植体进行灭菌,6 ~8min ；
[0019]③用灭菌水冲洗经②处理后的外植体；
[0020](3)接种、培养，包括以下子步骤:
[0021](3-1)将步骤(2)处理后的外植体的形态学下端插入培养基中，每个培养基中接种4个外植体，置于组织培养室中在以下培养条件下培养:温度27°C，光照30001x，14小时光周期；
[0022](3-2)继代培养:(3-1)中接种的外植体约2周后腋芽开始膨大，3~4周后腋芽抽出新叶，5~6周外植体长至3cm长后，继代至与(3-1)中所用培养基配比相同的培养基中进行继代培养，培养3个月左右，外植体长至10~15cm，得到继代龙爪柳茎；
[0023](3-3)增殖培养:将(3-2)中继代培养得到的继代龙爪柳茎取出，按照其节数，将每节叶片的形态学上端剪去，保留叶片的形态学下端0.5~lcm，移至与(3-1)中所用培养基配比相同的培养基中进行增殖培养；
[0024](4)重复步骤(2)~(3);
[0025]其中，
[0026]所述培养基包括:
[0027]
【权利要求】
1.一种龙爪柳茎的增殖方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)外植体的选取，包括以下子步骤: (1-1)每年4~10月选取龙爪柳当年生嫩莖的形态学上端4~5节,每一节作为一个外植体，冰袋保存； (1-2)将(1-1)中取得的外植体上叶片的形态学上端剪去，保留叶片的形态学下端0.5 ~Icm ； (2)外植体灭菌，包括以下子步骤: (2-1)将(I)处理过的外植体以流动水冲洗； (2-2)将(2-1)中处理后的外植体移至超净工作台中进行以下操作: ①用75%酒精对外植体进行表面灭菌30~60s，后用灭菌水冲洗酒精灭菌后的外植 体； ②在不断摇动的条件下，用0.5~1%次氯酸钠溶液对①处理后的外植体进行灭菌，6~8min ； ③用灭菌水冲洗经②处理后的外植体； (3)接种、培养，包括以下子步骤: (3-1)将步骤(2)处理后的外植体的形态学下端插入培养基中，每个培养基中接种4个外植体，置于组织培养室中在以下培养条件下培养:温度27°C，光照30001x，14小时光周期； (3-2)继代培养:(3-1)中接种的外植体约2周后腋芽开始膨大，3~4周后腋芽抽出新叶，5~6周外植体长至3cm长后，继代至与(3-1)中所用培养基配比相同的培养基中进行继代培养，培养3个月左右，外植体长至10~15cm，得到继代龙爪柳茎； (3-3)增殖培养:将(3-2)中继代培养得到的继代龙爪柳茎取出，按照其节数，将每节叶片的形态学上端剪去，保留叶片的形态学下端0.5~1cm，移至与(3-1)中所用培养基配比相同的培养基中进行增殖培养； (4)重复步骤(2)~(3)； 其中， 所述培养基包括:
MS；萘乙酸(NAA ):0.01-1 mg/L;玉米素:0.05-2 mg/L; 蔗糖:30 g/L; 琼脂粉:6.5 g/L; 其中，所述g/L是基于每升培养基所述成分的重量。
2.根据权利要求1所述的一种龙爪柳茎的增殖方法，其特征在于，所述培养基包括:MS;萘乙酸(NAA ):0.05~OJ mg/L;i米素:0.1 ~1.8 mg/L； 庶糠:30 g/L; 球 Il 粉:6.5 g/L; 其中，所述g/L是基于每升培养基所述成分的重量。
3.根据权利要求1所述的一种龙爪柳茎的增殖方法，其特征在于，所述培养基包括:
MS；
萘乙酸(NAA ):0.06-0.09 mg/L;
玉米素:1.l~L6 mg/L;
蔗糖:30 g/L;
琼脂输:6.5 g/L; 其中，所述g/L是基于每升培养基所述成分的重量。
4.根据权利要求1所述的一种龙爪柳茎的增殖方法，其特征在于，所述培养基由以下步骤制得: (1)调节MS培养基pH至5.8~6.0,加入琼脂粉，后于1211:下高温蒸汽灭菌20~30min，冷却至50~60°C待用； (2)萘乙酸和玉米素灭菌待用； (3)将(2)中灭菌后的萘乙酸和玉米素加入步骤(1)中制备的琼脂-MS中，凝固制备完成。
5.根据权利要求1所述的一种龙爪柳茎的增殖方法，其特征在于，所述灭菌方式为通过滤膜过滤灭菌，其中，滤膜孔径为0.22 μ m。
6.一种用于龙爪柳茎增殖的培养基，其特征在于，包括:
MS；萘乙酸(NAA ):0.01-1 mg/L;玉米素:0.05~2 mg/L; 蔗ft:30 g/L; 琼脂粉:6,5 g/L; 其中，所述g/L是基于每升培养基所述成分的重量。
7.根据权利要求6所述的用于龙爪柳茎增殖的培养基，其特征在于，包括:MS；
萘乙酸(NAA ):0.05~OJ mg/L;
玉米素:0.1~1,8 mg/L；
庶糠:30 g/L; 球 Il 粉:6.5 g/L; 其中，所述g/L是基于每升培养基所述成分的重量。
8.根据权利要求6所述的用于龙爪柳茎增殖的培养基，其特征在于，包括:
MS;
萘乙 ft ( NAA ):0.06^0.09 mg/L;
玉米素:Li~1.6 mg/L;
蔗糖:30 g/L;
琼脂粉:6.5 g/L; 其中，所述g/L是基于每升培养基所述成分的重量。
9.根据权利要求6所述的用于龙爪柳茎增殖的培养基，其特征在于，通过以下步骤制备得到: (1)调节MS培养基pH至5.8~6.0,加入琼脂粉，后于1211:下高温蒸汽灭菌20~30min，冷却至50~60°C待用； (2)萘乙酸和玉米素灭菌待用；` (3)将(2)中灭菌后的萘乙酸和玉米素加入步骤(1)中制备的琼脂-MS中，凝固制备完成。
10.根据权利要求6所述的用于龙爪柳茎增殖的培养基，其特征在于，所述灭菌方式为通过滤膜过滤灭菌，其中，滤膜孔径为0.22 μ m。
【文档编号】C05G3/00GK103548677SQ201310496399
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月21日 优先权日:2013年10月21日
【发明者】张建国, 饶国栋, 睢金凯 申请人:中国林业科学研究院林业研究所