一种玉米单倍体植株染色体组加倍的方法
【专利摘要】本发明公开了一种玉米单倍体植株染色体组加倍的方法，包括以下步骤：首先配置秋水仙素溶液，并加入助渗剂二甲基亚砜混合均匀得到注射液，再将注射液80～100微升注射入单倍体玉米植株茎尖生长点，对接受注射后的玉米植株进行常规护理，即可收获染色体组加倍的种子。本发明可大大提高染色体组加倍的成功率，降低了科研人员的工作量，缩短了育种时间，并且科研人员无需长时间暴露在秋水仙素污染的环境中，身体健康安全得到保障。
【专利说明】一种玉米单倍体植株染色体组加倍的方法【技术领域】
[0001]本发明属于农业育种领域，特别涉及一种玉米单倍体植株染色体组加倍的方法。【背景技术】
[0002]传统的玉米育种中常采用双单倍体育种(Doubled haploid, DH)技术来利用孤雌生殖诱导系诱导产生单倍体，再经加倍形成二倍体，一般只需经过2个世代就可得到100%的纯合系，其被称为DH (Doubled Haploid)系,育种进程较快。
[0003]玉米单倍体植株由于只含I套染色体组，一般生长势较弱，多数表现出高度不育，生产中直接应用效率极低。只有将单倍体加倍后使其植株散粉得到DH系，才能在育种中大规模应用。玉米单倍体加倍技术的限制是当前玉米单倍体育种技术规模化应用的主要限制因素。
[0004]目前实现单倍体加倍主要有两种途径:单倍体自然加倍或单倍体人工加倍。
[0005]单倍体自然加倍由于不借助任何药剂，是较经济实惠的方法。然而自然加倍只适用于自然加倍率高的背景材料，同时要积极创造能提高单倍体自然加倍率的地理、生态、气候条件，该方法受遗传背景影响较大且加倍成功率低。
[0006]单倍体人工加倍是获得DH系较有效的方法，最常用的是化学药剂法，其原理是使用化学药剂破坏细胞有丝分裂时纺锤丝的形成，使2个子细胞染色体在有丝分裂后期不移向两极，从而改变细胞染色体倍性，实现染色体的化学加倍，目前，主要利用的化学药剂有秋水仙素和除草剂。在国内，利用秋水仙素加倍单倍体的方法已较为成熟，秋水仙素是一种高毒致癌物，在实际操作中常常添加二甲基亚砜(DMSO)作为助渗剂来提高加倍效率。化学药剂法在实际使用时又分为浸泡法和滴定法:浸泡法一般是使用0.06%~0.5%的秋水仙素溶液浸泡玉米种子、幼`芽或幼苗根部，浸泡时间为12~48小时，再将材料清洗干净后转入温室培养或移入田间栽种，加倍率可达到20~50%，该方法因加倍效率高而被广泛应用，但是该方法需要使用秋水仙素溶液长时间浸泡玉米材料，而后又要清洗、移栽，高毒致癌物-秋水仙素长时间处于开放环境，科研人员在浸泡、清洗、移栽的过程中要长时间接触秋水仙素，身体健康安全受到了威胁；滴定法是用滴管将0.06%~0.5%的秋水仙素溶液滴在子叶、幼苗的生长点，由于溶液滴流、蒸发后药效降低，需要每隔6~8小时滴定一次，如此反复数日，该方法需要科研人员反复定时滴定，程序繁琐，工作量大，并且在反复滴定操作过程中科研人员暴露在秋水仙素开放的环境里，身体健康受到损害。
[0007]因此，目前急需一种加倍成功率高，又使科研人员的身体健康得到保障的玉米单倍体植株染色体组加倍方法。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种既能提高加倍成功率，又对科研人员的健康伤害较小的玉米单倍体植株染色体组加倍的方法。
[0009]本发明所提供的一种玉米单倍体植株染色体组加倍的方法，包括以下步骤:[0010](a)配置秋水仙素溶液，并加入助渗剂混合均匀得到注射液；
[0011](b)将步骤(a)所得的注射液80~100微升注射入单倍体玉米植株茎尖生长点；
[0012](c)对接受注射后的玉米植株进行常规护理，收获染色体组加倍的种子。
[0013]其中，步骤(a)中所述的秋水仙素溶液的质量百分比浓度为0.3%~0.8%，优选地，所述水仙素溶液的质量百分比浓度为0.5%。
[0014]其中，步骤(a)中所述的助渗剂为二甲基亚砜，其添加量优选为为按质量百分比加入2%~3%，最优选地，所述二甲基亚砜的添加量为按质量百分比加入2.5%。
[0015]其中，步骤(b)中所述的单倍体玉米植株优选为2~3叶期的单倍体玉米植株。
[0016]其中，在步骤(b)中注射入单倍体玉米植株茎尖生长点的注射液的注射量优选为100微升。
[0017]为使本发明达到更好的技术效果，所述单倍体玉米植株为将单倍体玉米种子在温室大棚中播种种植而得，在所述步骤(b)完成以后，再将玉米植株移栽至大田。
[0018]本发明所提供的技术方案，实现了以下有益效果:
[0019](I)通过注射的方法将秋水仙素精准注射入玉米幼苗的茎尖生长点，使秋水仙素的效果达到最大化，加倍成功率可提高到30~50%，高于使用自然加倍法的10%~20%的加倍率，降低了科研人员的工作量，缩短了育种时间；
[0020](2)本发明的方法比传统的化学药剂法简单、快捷，科研人员只需要配置秋水仙素溶液后进行注射操作，程 序简单、时间短，无需长时间暴露在秋水仙素污染的环境中，身体受到的损害大为减少，健康安全得到保障。
【具体实施方式】
[0021]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0022]若未特别指明，实施例中所用的化学试剂、种子、种苗均为常规市售，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0023]以下实施例中使用的玉米品系农大高诱I号、M9均从广西壮族自治区农业科学院获得。
[0024]实施例1
[0025]1.2012年3月以农大高诱I号为父本，双M9 XM9杂交组合为母本，杂交获得60粒玉米单倍体种子，2012年8月将这些种子播种于广西农科院玉米研究所温室大棚，进行常规护理，使其萌芽生长。
[0026]2.配置质量百分比为0.3%的秋水仙素溶液，并加入质量百分比为2%二甲基亚砜，制成注射液，使用注射器将注射液100微升注射于3叶期单倍体玉米植株的茎尖生长点。
[0027]3.在注射7天后把单倍体玉米植株移至大田并常规精细护理，收获种子。
[0028]实施例2
[0029]1.2012年3月以农大高诱I号为父本，双M9 XM9杂交组合为母本，杂交获得60粒玉米单倍体种子，2012年8月将这些种子播种于广西农科院玉米研究所温室大棚，进行常规护理，使其萌芽生长。
[0030]2.配置质量百分比为0.5%的秋水仙素溶液,并加入质量百分比为2.5% 二甲基亚砜，制成注射液，使用注射器将注射液100微升注射于3叶期单倍体玉米植株的茎尖生长点。
[0031]3.在注射7天后把单倍体玉米植株移至大田并常规精细护理，收获种子。
[0032]实施例3
[0033]1.2012年3月以农大高诱I号为父本，双M9 XM9杂交组合为母本，杂交获得60粒玉米单倍体种子，2012年8月将这些种子播种于广西农科院玉米研究所温室大棚，进行常规护理，使其萌芽生长。
[0034]2.配置质量百分比为0.8%的秋水仙素溶液，并加入质量百分比为3%二甲基亚砜，制成注射液，使用注射器将注射液100微升注射于3叶期单倍体玉米植株的茎尖生长点。
[0035]3.在注射7天后把单倍体玉米植株移至大田并常规精细护理，收获种子。
[0036]实施结果及分析
[0037]统计实施例2的实施结果:2012年10月共有21株植株散粉，即加倍成功率为21/60X100%=35%，11月底收获时，共16株玉米能收到至少一粒种子，结实株率为16/60=26.7% ；2013年3月播种这一批种子共45粒，进行农艺性状观察及配合力测定，最终育成了五个农艺性状优良的双单倍体玉米自交系，如果用自然加倍方法进行染色体组加倍则需要233粒左右的玉米单倍体种子，意味着需要杂交11.6倍的双M9XM9杂交组合为母本来诱导才能达到类似的效果(表1)。使用本发明方法进行玉米单倍体植株染色体组加倍，加倍成功率达到35%，结实株率可达到26.7%，大大高于使用自然加倍法的1%~5%加倍率和0.5~8%的结实株率，可见使用本发明方法大大降低了科研人员的工作强度，并且科研人员也无需长时间暴露于致癌物秋水仙素污染的环境，保障了他们的身体健康安全。
[0038]表1本发明方法与自然加倍法加倍效率对比
`[0039]
【权利要求】
1.一种玉米单倍体植株染色体组加倍的方法，其特征在于，包括以下步骤: Ca)配置秋水仙素溶液，并加入助渗剂混合均匀得到注射液； (b)将步骤(a)所得的注射液80~100微升注射入单倍体玉米植株茎尖生长点； (C)对接受注射后的玉米植株进行常规护理，收获得到染色体组加倍的种子。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(a)中所述的秋水仙素溶液的质量百分比浓度为0.3%~0.8%。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(a)中所述的助渗剂为二甲基亚砜。
4.按照权利要求2所述的方法，其特征在于:步骤(a)中所述的秋水仙素溶液的质量百分比浓度为0.5%。
5.按照权利要求3所述的方法，其特征在于:步骤(a)中所述的二甲基亚砜的添加量为按质量百分比加入2%~3%。
6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于:步骤(a)中所述的二甲基亚砜的添加量为按质量百分比加入2.5%。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:步骤(b)中所述的单倍体玉米植株为2~3叶期的单倍体玉米植株。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:在步骤(b)中，将注射液100微升注射入单倍体玉米植株茎尖生长点。
9.按照权利要求1~8任一所述的方法，其特征在于:所述单倍体玉米植株为将单倍体玉米种子在温室大棚中播种种植而得；在所述步骤(b)完成以后，再将玉米植株移栽至大田。`
【文档编号】A01H1/08GK103749291SQ201310497188
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年10月21日 优先权日:2013年10月21日
【发明者】吴永升, 黄开健, 苏治军, 谭华, 黄爱花, 韦新兴, 郑德波, 邹成林, 莫润秀 申请人:广西壮族自治区农业科学院玉米研究所