淡紫拟青霉航天诱变突变株Sd-m-26及其微生物制剂和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了淡紫拟青霉航天诱变突变株Sd-m-26及其微生物制剂和应用。本发明将淡紫拟青霉菌株20-7、山东（Sd）菌株搭载“神舟”8号飞船进行航天诱变，以未搭载的原始菌株为对照，比较航天搭载菌株在表形、色素变化、生长速度、产孢量和致病力等方面的变异性，以筛选获得生长性能有所改善以及对根结线虫卵的致病能力有显著提高的突变株。本发明对航天搭载菌株通过生长速度、产孢量和致病力的筛选发现，山东菌株航天诱变菌株Sd-m-26在生长特性和致病力方面发生了较大幅度的正向变异，特别是在对根结线虫卵的致病力上比原始菌株有了非常显著的提升，在根结线虫的生物防治上具有重要的应用潜力。
【专利说明】淡紫拟青霉航天诱变突变株Sd-m-26及其微生物制剂和应用【技术领域】
[0001]本发明涉及淡紫拟青霉(Paecilomyces Iilacinus)航天诱变突变株,尤其涉及淡紫拟青霉山东株航天诱变突变株Sd-m-26及其微生物制剂，本发明进一步涉及该突变株在生物防治根结线虫中的应用，属于淡紫拟青霉突变株的筛选及其应用领域。
【背景技术】
[0002]航天诱变育种(Space Mutation Breeding),又叫空间诱变育种，就是将航天技术与传统的物理、化学诱变及分子技术等相结合的新育种技术，利用卫星搭载微生物等生物体样品，经特殊的空间环境条件(微重力、强宇宙射线、高真空、微重力等)的作用，引起生物体的染色体畸变，进而导致生物体遗传变异，经地面选育试验后，能快速而有效地育成生物新品种(系)，供生产和研究使用(张玲华，田兴山.微生物空间诱变育种的研究进展[J].核农学报，2004，18 (4):294~296)。因此法能引起大幅度的生理变异和遗传变异，所以成为高效率育种的新途径。已有研究表明，一些农作物和微生物经过航天诱变，正向突变率和变异幅度大大高于常规诱变(宋满刚，张满贵，缪美锁，红晓祥，梁虹，罗宝君，.我国太空育种成果显著[J].种子世界，2004，7:57)。
[0003]太空环境具有较好的诱变作用，可以产生改善菌种的有利性状、创造新品种等有益变异，还可发诱发与产量有关的数量性状变异，但很多变异具有一定的随机性。搭载微生物的主要目的就是通过设计最佳方案筛选那些产量高、价值大的变异生产菌株，而为了选择得到性状稳定的新品种或品系，需要进行大量繁重的筛选和检测试验(张世成，林作楫，杨会民，赖菁茹.航天诱变条件下小麦若干性状的变异[J].空间科学学报，1996，增刊:103~107 ;边银丙，翁曼丽，孙勇，王斌，赵培新，闵家顺.香菇菌丝太空诱变效应研究I太空环境对香菇菌丝生长特性的影响[J].食用菌学报，1999，6 (4):11~14)。
[0004]淡紫拟青霉(Paecilomyces Iilacinus)是许多重要农作物病虫的生防菌,能在土壤中习居并宿存，能够寄生控制多种植物根结线虫，还是多种非土栖害虫如荔枝蝽蟓、稻黑蝽、稻叶蝉等的天敌。其能够产生几丁质酶和丝氨酸蛋白酶，并通过这两种酶的作用破坏根结线虫卵壳，从而菌丝侵入根结线虫的卵并寄生于卵内，因此淡紫拟青霉菌株被认为是最具有应用前景的线虫生防真菌(Khan A, Willianms K L, and Nevalainen H K M.Effectof Paecilomyces lilacius protease and chitinase on the eggshell structuresand hatching of Meloidogyne javanica juveniles[J].Biological Control，2004，3:346-352)。
[0005]现有的淡紫拟青霉菌株在生长速度、产孢量等生长性能以及对根结线虫卵的致病力上都亟待提高，将淡紫拟青霉菌株通过航天诱变筛选得到在生产性能或对根结线虫卵的致病力上有显著提高的突变菌株，对于根结线虫的生物防治将具有重要的应用价值。
【发明内容】
[0006]本发明的主要目的是将淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)进行航天诱变获得一株对根结线虫卵的致病能力有显著提高的突变株；
[0007]本发明的另一目的是将所获得的突变株应用于根结线虫的生物防治。
[0008]本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:
[0009]—株对根结线虫卵的致病能力有显著提高的淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)山东航天诱变突变株Sd-m-26，其微生物保藏号是:CGMCCN0.7770 ;分类命名:淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus ;保藏时间是:2013年6月20日;保藏单位是:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0010]本发明将淡紫拟青霉菌株20-7、山东(Sd)菌株各分为两份，一份为原始菌株，留在地面常规保存用作对照(CK);另一份搭载“神舟”8号飞船进行航天诱变，航天搭载菌株返回地面后，以未搭载的原始菌株为对照，比较航天搭载菌株在表形、色素变化、生长速度、产孢量和致病力等方面的变异性，以筛选获得对根结线虫卵的致病能力有显著提高的突变株。
[0011]本发明将航天搭载菌株通过5-6代继代培养得到性状稳定菌株后，观察航天诱变对菌落形态和色素变化的影响，观察发现，经航天诱变的20-7淡紫拟青霉菌株筛选得到的19个突变菌株，变异类型较多，且各菌株均出现比原始菌株明显的轮纹，但产孢均比原始菌株少，与轮纹越明显产孢越多的文献中的结论不一致(王明祖.根结线虫卵寄生真菌的研究I1.淡紫拟青霉菌生长和产孢条件[J].华中农业大学学报，1992，11 (I):52-56)。菌落出现不同程度的隆起，大致可分为三种类型:中心隆起，隆起或扁平。中心隆起和隆起菌株颜色均比原始菌株浅；扁平菌株颜色也比原始菌株浅，只有极少数菌株颜色加深呈紫色。菌落背后颜色一般呈炒米黄色，与原始菌株差异不大。
[0012]在山东(Sd)突变菌株中，菌落有明显的形态分化，可将它们分为4种类型:1型菌落为性状变化最大的一种，菌落正面为极浅淡紫色，接近白色，菌落背部色素初生长时为墨绿色，9d后由墨绿色变为黑-棕红-白色的由深及浅的特征，菌落直径均比原始菌株小，即生长速度较原始菌株慢，其中Sd-m-30生长速度最慢，培养15d的菌落直径仅5.85cm, I型菌落共8株，占山东航天突变体菌落数的26.7%，其中Sd-m-3菌株边缘不呈圆形而是呈现出类似花朵状边缘；另外两种色素较原始菌株深，其中一种菌落中部为白色凸起外围呈淡紫色，菌落轮纹明显，为II型，共7株，占山东航天突变体菌落数的23.3% ;另一种菌落平展，中部无凸起并出现辐射状分支，为III型，共5株占航天单孢菌落数的16.7%。其它菌落的大小均与原始菌株相近，其中12株菌株与原始菌株形态相似，为IV型，占山东航天突变体菌落数的40%。
[0013]本发明采用显微镜观察航天诱变对菌丝及孢子形态的影响，观察结果发现山东突变体I型菌落均出现菌丝缠绕形成的环状菌丝结构，环状结构的成因还不明确，有待于进一步的实验研究。II型、III型和IV型菌株有轮状分枝的分生孢子梗，分生孢子多数稍呈棱形，少数近椭圆形或圆形，单细胞，无色，表面光滑，形态与原始菌株基本无差异。20-7突变体菌株的菌丝及孢子形态基本无变化。
[0014]本发明还观察了航天诱变对菌株的生长速度以及菌丝干重的影响，以筛选出生长速度比原始菌株有加快的突变菌株。观察结果发现，与原始菌株相比，淡紫拟青霉20-7航天诱变菌落生长速度无明显加快的菌株；山东(Sd)突变菌株生长速度与山东(Sd)原始菌株相比，出现了正负双向变异，变异幅度较大，说明航天诱变可使山东菌株的生长速度产生不同趋向和不同幅度的变异。培养15d后菌落直径大于或等于原始菌株的菌株占突变菌株的26.7%，小于原始菌株的占73.3% ;其中，生长速度最快的菌株为Sd-m-26，培养15d后菌落直径为8.46cm,生长速度最慢的为菌株Sd-m-30，培养15d后菌落直径仅为5.85cm。
[0015]淡紫拟青霉菌株20-7和山东(Sd)菌株的突变体菌株培养过程菌丝干重总体均变化幅度较大，培养4d的航天突变菌株菌丝干重均在0.3g以下。在20-7突变菌株中，除H20-7-1菌丝干重为0.2592g，比20_7原始菌株的0.2555g重外，其它突变体均轻于原始菌株。山东突变体菌株菌丝干重最重的Sd-m-26为0.2751g ;总体上看，20_7和山东两种菌株负变异率均大于正变异率。
[0016]本发明进一步的观察了航天诱变对菌株产孢量的影响，观察结果发现，20-7原始菌株经航天诱变后，筛选得到的19株菌株中产孢量均少于原始菌株，其中产孢量最小的H20-7-4只有0.24X 107cfu/mL,说明航天诱变使菌落的产孢量较难在菌株本身产孢量较高的基础上更优而产生正向变异，而是更趋向于产生负向变异并且负向变异的幅度较大。相对于20-7菌株，山东菌株本身产孢量要小于20-7菌株，而经航天诱变后的菌株出现了不同趋向、不同幅度的变异。正向变异的幅度比较小，负向变异幅度较大。从观察结果可见，山东航天诱变突变株Sd-m-26的产孢量相比于原始菌株有了非常显著的提升。 [0017]为了筛选出对根结线虫卵的致病能力有显著提高的突变株，本发明对20-7、山东(Sd)菌株的航天搭载株进行了根结线虫卵的致病力测定，测定结果发现，20-7的各航天诱变菌株都保持了对根结线虫卵的致病能力，但未见致病力提高的菌株，H20-7-16寄生率最低为4.0%。山东试验菌株中，大部分航天诱变菌株保持了原始菌株的致病水平，寄生率提高菌株占突变菌株的46.7%。其中菌株Sd-m-26致病力显著提高，其致病力达到了 94.0%，比原始菌株的致病力提高了 14.3%。寄生率最低的突变菌株为Sd-m-17，仅为16.3%。
[0018]生长速度、产孢量和致病力是筛选生物防治菌株的重要指标，航天诱变使这些特性表现出不同变异趋向和幅度，证明了航天诱变是非定点的、广泛性的、正负双向性的，且诱变位点多、诱变率高，所导致的生物体变异有生理性变异也可能有遗传性变异(农向群，张泽华，胡攀，高松，张礼生.航天诱变对昆虫病原真菌的生物学效应[J].菌物学报，2006，25(4):674~681)。两株原始菌株相比，20_7无论是产孢量、生长速率还是致病力等方面均优于山东(sd)菌株，经航天诱变后，20-7菌株只在生长速度、菌丝干重上出现了少量正向变异，产孢量、致病力等均无正向变异出现，而山东菌株出现了正负双向变异，说明在诱变率高低与出发菌株本身性状的优劣密切相关。
[0019]通过生长速度、产孢量和致病力的筛选发现，山东菌株航天诱变菌株Sd-m-26在生长特性和致病力方面发生了较大幅度的正向变异，尤其是在致病力上相比于原始菌株有了非常显著的提升。本发明进一步将山东菌株航天诱变菌株Sd-m-26按照常规的微生物菌剂制备成可湿性粉剂，同时按照同样的方法将山东原始菌株制备成可湿性粉剂，比较了二者对根结线虫的生防效果；从实验结果可见，用淡紫拟青霉山东航天诱变突变株Sd-m-26制备的可湿性粉剂对根结线虫的相对防治效果高出对照菌剂(用淡紫拟青霉山东原始菌株制备的可湿性粉剂)32.66%，幼虫减少百分率高出对照菌剂32.1% ;实验结果表明，淡紫拟青霉山东航天诱变突变株Sd-m-26对于根结线虫的生物防治效果要远远优于原始菌株对于根结线虫的生物防治效果。
[0020]本发明提供了一种防治根结线虫的淡紫拟青霉微微生物制剂，包括:淡紫拟青霉航天诱变突变株Sd-m-26的孢子粉或发酵液和载体。
[0021]作为参考，本领域技术人员可参考下述方法制备得到淡紫拟青霉航天诱变突变株Sd-m-26孢子粉:(1)制备淡紫拟青霉航天诱变突变株Sd-m-26发酵液；(2)从淡紫拟青霉航天诱变突变株Sd-m-26发酵液中回收孢子产物；(3)干燥所回收的淡紫拟青霉孢子产物，即得淡紫拟青霉粉。
[0022]本领域所属技术人员可按照文献中所公开的各种方法制备得到淡紫拟青霉发酵液；例如，采用三级培养方法，即:种子培养、二级液体扩大培养和液体发酵培养，制备得到淡紫拟青霉菌航天诱变突变株Sd-m-26发酵液；其中，在液体发酵培养时，可以采用发酵罐发酵或采用摇瓶培养的方式进行发酵培养；三级培养所用到的培养基及其培养条件均已在文献中公开，作为参考，其中，所述的液体发酵培养基的组成成分包括碳源和氮源；所述的碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉或玉米粉中的任一种或多种。所述的氮源包括但不限于硝酸钠、硫酸铵、蛋白胨或黄豆粉中的任一种或多种。
[0023]本发明进一步提供一种制备防治根结线虫的淡紫拟青霉微生物制剂的方法，该方法包括以下步骤:将淡紫拟青霉航天诱变突变株Sd-m-26的孢子粉或发酵液和载体混合在一起，搅拌均匀，粉碎过筛，制备得到相应的微生物制剂，例如，可以是颗粒制剂、粉剂、可湿性粉剂或微胶囊菌剂等。 [0024]其中，所述的载体可以是硅藻土、高岭土、木屑、活性碳、草炭、农作物秸杆、干燥的农家肥等；此外，本发明的淡紫拟青霉微生物制剂中还可加入辅料或/和助剂；所述的辅料可以是蟹壳粉或几丁质等；所述的助剂可以是润湿剂、分散剂或稳定剂等。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1航天诱变20-7菌落形态变异菌株与20-7原始菌株。
[0026]图2航天诱变山东菌株形态变异4种类型与山东原始菌株及花朵状边缘Sd-m-3菌株。
[0027]图3航天诱变山东突变体I型菌落的环状菌丝结构。
【具体实施方式】
[0028]通过下列实施例将更具体说明本发明的实施方式，但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0029]实施例1淡紫拟青霉可湿性粉剂的制备
[0030]—、淡紫拟青霉(P.lilacinus)航天诱变突变株Sd-m-26孢子粉的制备
[0031](一)、淡紫拟青霉发酵液的制备
[0032]1、将淡紫拟青霉航天诱变突变株Sd-m-26菌种活化后，进行摇瓶种子培养；
[0033]摇瓶种子培养培养基的组成(按质量百分比计):
[0034]
【权利要求】
1.一株淡紫拟青霉(Paecilomyces Iilacinus)山东航天诱变突变株Sd-m_26,其特征在于，其微生物保藏号是=CGMCC N0.7770。
2.权利要求1所述的淡紫拟青霉航天诱变突变株Sd-m-26在防治植物害虫中的应用。
3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于:所述的植物害虫是线虫。
4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于:所述的线虫是根结线虫。
5.一种防治植物害虫的微生物制剂，其特征在于，包括:权利要求1所述的淡紫拟青霉航天诱变突变株Sd-m-26的孢子粉或发酵液以及载体。
6.按照权利要求5所述的微生物制剂，其特征在于:所述的载体是硅藻土、高岭土、木屑、活性碳、草炭、农作物秸杆或干燥的农家肥。
7.按照权利要求5所述的微生物制剂，其特征在于:还含有辅料或助剂。
8.按照权利要求7所述的微生物制剂，其特征在于:所述的辅料是蟹壳粉或几丁质；所述的助剂是润湿剂、分散剂或稳定剂。
9.一种制备权利要求5-8任何一项所述微生物制剂的方法，包括以下步骤:将淡紫拟青霉航天诱变突变株Sd-m-26的孢子粉或发酵液和载体混合在一起，搅拌均匀，粉碎过筛，得到相应的微生物制剂。
10.按照权利要求5所述的微生物 制剂，其特征在于:所述的植物害虫是根结线虫。
【文档编号】A01P5/00GK103602595SQ201310538360
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月4日 优先权日:2013年11月4日
【发明者】汪来发, 王源, 朴春根, 王曦茁, 马建伟 申请人:中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所