黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白及其重组表达载体和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白及其重组表达载体和应用，黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.4所示，家蚕幼虫添食黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白后导致家蚕存活率降低，表明该基因是一个可导致鳞翅目昆虫家蚕致死的毒性蛋白，能够用于制备生物农药杀虫剂，特别是抗鳞翅目害虫的生物农药杀虫剂，具有广泛的应用前景。
【专利说明】黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白及其重组表达载体和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物化学领域，具体涉及黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白，还涉及含黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白的重组表达载体和应用。
【背景技术】
[0002]细菌是植物、动物和人类的主要病原微生物之一，而毒素蛋白是其重要的毒力因子，主要类型为穿孔毒素蛋白(Pore-forming toxins,简称:PFT)。大多数细菌的PFT作用于宿主的细胞膜，形成孔洞使细胞内外离子平衡，导致细胞裂解破碎而死亡。目前已鉴定的细菌穿孔毒素蛋白超过300多种，根据其插入细胞膜磷脂双分子层的结构特征，可以分为a-PFT和β-PFT。其中β-PFT又可以分为smalP-PFT和CDCs两种类型，它们的结合细胞方式、孔道形成机制和引起靶细胞反应不同。尽管有如此之多的细菌PFT，但由于绝大多数的PFT经口添食不会导致昆虫死亡，所以真正在作物抗虫方面有利用价值的并不常见。目前只有a-PFT的Bt Cry伴孢晶体毒素蛋白和β-PFT的Bt Cyt δ内毒素在生物农药杀虫剂或抵抗害虫的转基因植物分子育种等方面有产业上的应用。尽管转Bt植物品种的大面积推广应用极大地减轻了虫害，也减少了农药用量，并在保护环境的同时也挽回了大量的经济损失；但长期使用同一抗性品种也导致了对Bt Cry伴孢晶体毒素蛋白具有抗性的昆虫相继出现。因此寻找新的靶标基因培育新的抗性品种迫在眉睫，但如何从数以万计的病原微生物中鉴定出可以经口添食感染导致昆虫死亡的穿孔毒素蛋白明显非常困难。
[0003]黑胸败血芽孢杆菌(Bacillus bombyseptieus,简称Bb)是鳞翅目模式昆虫家蚕的主要细菌性病原之一，Bb感染家蚕后，在家蚕中肠组织中形成孔洞，进而通过这些孔洞侵入血淋巴引起家蚕细菌性败血病。有学者通过电镜扫描观察到家蚕中肠上皮在Bb感染后有孔洞形成，暗示Bb产生了穿孔毒素蛋白·且家蚕在感染Bb后会很快死亡，表明Bb的穿孔毒素蛋白具有重要的生物学功能。因此，对该基因进行克隆进而对其生物学功能进行研究，将为新的生物杀虫剂的开发奠定基础。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明的目的之一在于提供黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白，本发明的目的之二在于提供黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白的编码基因；本发明的目的之三在于提供含有上述编码基因的重组表达载体，本发明的目的之四在于提供含有重组表达载体的工程菌；本发明的目的之五在于提供利用所述工程菌制备黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白的方法，本发明的目的之六在于提供黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白在制备生物农药杀虫剂中的应用。
[0005]1.黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白，氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0006]2.权利要求1所述黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白的编码基因。
[0007]优选的，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0008]3.含有所述编码基因的重组表达载体。[0009]优选的，所述重组表达载体是将SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列连入pET28a载体的BamH I和Xho I酶切位点而得。
[0010]4.含有权利要求4或5所述重组表达载体的工程菌。
[0011]优选的，所述工程菌为大肠杆菌BL21。
[0012]5.利用所述工程菌制备黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白的方法，将工程菌扩大培养后加入IPTG诱导表达，离心收集菌体，PBS清洗后用液氮反复冻融，然后超声波破碎收集沉淀；沉淀分别用含质量分数为0.5%的Triton TM X_100、0.1~0.3Mm EDTA的PBS和含2M尿素、IOOmM NaCl的PBS清洗；再用含8M尿素、IOOmM NaCl的PBS重悬沉淀，使包涵体充分溶解；离心收集上清，抽滤，滤液含有尿素的PBS进行透析；最后用PBS溶液透析，然后用Ni亲和柱纯化，用PBS溶液和含有20mM咪唑的PBS洗去未结合的蛋白后，再分别用含200mM、500mM和IM咪唑的PBS洗脱，最后用PBS溶液透析，得黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白。
[0013]6.所述黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白在制备生物农药杀虫剂中的应用。
[0014]优选的，所述黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白在制备抗鳞翅目害虫的生物农药杀虫剂中的应用。
[0015]本发明的有益效果在于:本发明克隆得到了黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白Bbtoxin-2,经口添食Bb toxin-2毒素蛋白后可导致家蚕死亡,该蛋白是除Bt Cry伴孢晶体
毒素蛋白外唯--个经口饲养家蚕可导致家蚕死亡的毒素蛋白，这将为开发新的生物农药
杀虫剂提供新的思路。
【专利附图】
【附图说明】
`[0016]为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图:
[0017]图1为黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白在BL21中诱导表达电泳检测(1:对照沉淀；2:对照上清；3:16°C诱导20h沉淀；4:16°C诱导20h上清；5:37°C诱导4h沉淀；6:37°C诱导4h上清)。
[0018]图2为黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白原核表达纯化SDS-PAGE电泳检测。
[0019]图3为4龄起家蚕添食Bb toxin-2生存率统计(1:添食等体积PBS的家蚕存活率；2:添食Bb toxin-2毒素蛋白的家蚕存活率)。
[0020]图4为5龄期家蚕分别添食黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白、PBS和非致病钙粘蛋白CR12的结果(A:5龄期家蚕添食黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白生存率统计；B:添食PBS后家蚕存活照片；C:添食非致病钙粘蛋白CR12后家蚕存活照片；D:添食Bb toxin-2毒素蛋白后家蚕死亡照片)。
【具体实施方式】
[0021]下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J-萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0022]实施例1、穿孔毒素蛋白Bb toxin-2的鉴定和克隆
[0023]从NCBI上下载目前已报道的α-PFT和β-PFT的蛋白质序列，具体如下:嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)气单胞菌溶素(Aerolysin) (Genbank:AECl2846.1)、腐败梭菌(Clostridium septicum) α 毒素(Alpha-toxin) (Genbank:AAB32892.1)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) α 毒素(Alpha-toxin) (Genbank:Ρ09616.2)、产胺链球菌(Streptococcus pyogenes)溶血性链球菌产生的溶血素O (StreptolysinO) (Genbank:Q53957.1)、炭疽杆菌 str.A0174 (Bacillus anthracis str.A0174)anthrolysin O (ALO) (Genbank:EDT69040.1)、单核增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)李斯特菌溶血素(Listeriolysin O) (Genbank:P13128.1)、蜂房芽胞杆菌(Paenibacillus alvei)蜂房杆菌溶素(Alveolysin) (Genbank:Ρ23564.I)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)炭疽毒素(Anthrax toxins) (Genbank:ΝΡ_052806.I)、苏云金芽抱杆菌(Bacillus thuringiensis) Bt CrylAa (Genbank:AAA22353.1)、苏云金芽抱杆菌(Bacillus thuringiensis) Bt Cry2Aa (Genbank: AAA22335.1 )、苏云金芽抱杆菌(Bacillus thuringiensis)Bt Cry3Aa(Genbank:AAA22336.1)、苏云金芽抱杆菌(Bacillusthuringiensis)Bt Cry4Aa(Genbank:CAA68485.1)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)霍乱弧菌溶细胞毒素 Vcc (Genbank: BAA09545.1)和白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)白喉毒素(Diphtheria Toxin)(Genbank:NP_938615.1)。然后对 a-PFT 和 β-PFT 的蛋白质序列用BLAST软件比对分析，序列比对分析主要包括:用a-PFT和β-PFT的氨基酸序列运行BLASTP程序检索Bb基因组数据库，采用检索标准Ε〈10-1(ι，鉴定Bb穿孔毒素蛋白基因。最终鉴定获得一个E值为8Ε-34，氨基酸相似性为49%的候选基因(Bb000863)，命名为Bb toxin-2ο
[0024]根据Bb基因组序列设计扩增Bb toxin-2的特异引物，Bb toxin-2的正向引物:5 1 -atgaaacgttctaaaacatactt-3 1 (SEQ ID N0.1),反向引物51 -ttttttctctactaatttcttattc-31 (SEQ ID N0.2)。以 Bb 基因组 DNA 为模板进行扩增，PCR反应条件为:95°C预变性5分钟，然后95°C变性40秒、50°C退火40秒、72°C延伸80秒，共28个循环，最后72°C延伸10分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收1000bp左右条带，然后与PMD19-T Simpl e载体连接,连接反应体系严格按照Solution I连接酶使用说明进行，连接条件是在16°C条件下连接2小时，将连接产物转化DH5a感受态细胞，获得阳性克隆pMD19-T Simple/Bb toxin-2后测序验证,测序结果如SEQ ID N0.3所示,经分析克隆的 Bb toxin-2 基因的 CDS 为 101 lbp，编码 336 个氨基酸(SEQ ID N0.4)。
[0025]实施例2、Bb toxin-2原核表达、蛋白复性及纯化
[0026]由于全长Bb toxin-2基因的N端含有31个氨基酸的信号肽序列,而信号肽会影响蛋白表达，因此对Bb toxin-2进行原核表达时去除了该信号肽。然后根据克隆获得的全长Bb toxin-2设计不含信号肽的特异引物,正向引物为:5' -cgggaXcccaaacaacatcgcaagttgt-3/ (SEQ ID N0.5),下划线为 BamH I 酶切位点，反向引物 5' -cctcgagttattttttctctactaatttcttattc-3' (SEQ ID N0.6)，下划线为 Xho I 酶切位点，然后以 pMD19_T Simple/Bb toxin-2质粒为模板进行PCR扩增，反应条件为:94°C预变性5分钟，然后95°C变性40秒、52 °C退火40秒、72°C延伸80秒，共28个循环，最后72°C延伸10分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，回收产物用BamHI和Xho I双酶切，回收Bb toxin-2基因片段，同时将pET28a载体用BamH I和Xho I进行双酶切，回收载体骨架，将回收的Bb toxin-2酶切片段和pET28a骨架片段进行连接转化，获得pET28a/Bb toxin-2重组质粒，然后送往华大基因公司测序，将测序确认正确的重组质粒转化表达感受细胞大肠杆菌BL21，加入IPTG至终浓度为0.2mM后在16°C条件下培养20h和37°C条件下培养4小时分别进行Bb toxin毒素蛋白诱导表达，SDS-PAGE电泳检测，结果如图1所示,结果显示Bb toxin-2毒素蛋白主要是以包涵体形式表达。
[0027]将含pET28a/Bb toxin-2重组质粒的大肠杆菌BL21和大肠杆菌Rosetta扩大培养后在7000rpm条件下离心10分钟收集菌体，PBS清洗3次后液氮反复冻融3次，然后超声波破碎30min，16000rpm离心30分钟收集沉淀；沉淀用洗涤液I (含有0.5%Triton TMx-100,0.1- 0.3Mm EDTA的PBS)和洗涤液2 (含有2M尿素，IOOmM NaCl的PBS)分别清洗；再用20-30mL的含有8M尿素，IOOmM NaCl的PBS重悬沉淀，4°C缓慢摇动12小时，使包涵体充分溶解；4°C，16000rpm离心30分钟，收集上清，上清用0.45 μ m滤膜抽滤后进行蛋白复性。
[0028]Bb toxin-2蛋白复性:将滤液依次用含有6M、4M、2M和IM尿素的PBS进行透析，每隔12小时换液一次；最后用PBS溶液透析4次，每隔6小时换液一次，获得含复性Bbtoxin-2毒素蛋白的混合蛋白。
[0029]将含复性Bb toxin-2毒素蛋白的混合蛋白上柱到用PBS平衡过的Ni亲和柱中，分别用30mL PBS溶液和含有20mM咪唑的PBS快速冲洗柱子以洗去未结合的蛋白，再分别用IOmL含200mM、500mM和IM咪唑的PBS缓慢冲洗柱子并收集洗脱液，大约每2ml收集一管，收集到的洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测；纯化获得的Bb toxin-2毒素蛋白用PBS溶液透析36小时，每6小时更换透析液一次，最后进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图2所示。由图2可知，纯化获得了 Bb toxin-2毒素蛋白，其分子量约为35kda。然后用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定其Bb toxin-2穿孔毒素蛋白浓度,结果显示Bb toxin-2穿孔毒素蛋白的浓度为:1.49μ g/μ L0 [0030]实施例3、Bb toxin-2毒素蛋白添食鳞翅目昆虫家蚕的存活率检测
[0031]鳞翅目昆虫家蚕DZ品种蚕卵进行浸酸(盐酸比重为1.073，温度为46°C，时间为5分钟)以解除滞育，然后置于15°C、85%湿度的黑暗环境中催青至孵化，将蚁蚕收于高压灭菌的培养皿中，放置于温度和湿度分别控制在25°C、80%的生化培养箱中饲养。
[0032]对4龄期家蚕幼虫饥饿6小时，以60 μ g/头经口添食纯化获得的Bb toxin-2毒素蛋白，设置3个重复区，每个重复区40头蚕，同时设置添食相同体积PBS为对照，连续统计存活率和死亡率，结果如图3所示。统计结果显示，添食Bb toxin-2毒素蛋白后家蚕幼虫的死亡率明显高于添食PBS的对照组，添食Bb toxin-2毒素蛋白的4龄期家蚕的死亡率大约为70%，而对照组的家蚕并没有出现死亡。
[0033]对5龄期家蚕幼虫饥饿6小时，以60 μ g/头经口添食纯化获得的Bb toxin-2毒素蛋白，设置3个重复区，每个重复区40头蚕，同时设置添食相同体积PBS和添食等量的采用相同分离纯化方法获得的非致病钙粘蛋白CR12的家蚕作为对照区，连续统计存活率和死亡率，结果如图4A所示。统计结果显示，添食Bb toxin-2毒素蛋白后家蚕幼虫的死亡率明显高于添食PBS和非致病钙粘蛋白CR12的对照组，并且添食Bb toxin-2毒素蛋白5龄期家蚕的死亡率大约为50%，而对照组的家蚕并没有出现死亡；然后观察添食PBS和非致病钙粘蛋白CR12后家蚕幼虫(图4B和图4C)以及添食Bb toxin-2毒素蛋白后死亡家(图4C)。通过添食Bb toxin-2毒素蛋白来观察Bb toxin-2穿孔毒素蛋白对鳞翅目昆虫家蚕是否具有致病性。统计结果表明，添食Bb toxin-2毒素蛋白后家蚕幼虫的存活率显著下降，说明鉴定到的Bb toxin-2基因是编码一个可导致鳞翅目昆虫家蚕幼虫致死的毒性蛋白，可作为靶标基因应用于抗鳞翅目害虫的转基因作物的分子育种。
[0034]最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种·各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【权利要求】
1.黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白，其特征在于:氨基酸序列如SEQID N0.4所示。
2.权利要求1所述黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于:所述编码基因的核苷酸序列如SEQID N0.3 所示。
4.含有权利要求2所述编码基因的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于:所述重组表达载体是将SEQIDN0.3所示的核苷酸序列连入pET28a载体的BamH I和Xho I酶切位点而得。
6.含有权利要求4或5所述重组表达载体的工程菌。
7.根据权利要求6所述工程菌，其特征在于:所述工程菌为大肠杆菌BL21。
8.利用权利要求7所述工程菌制备黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白的方法，其特征在于:将工程菌用IPTG诱导表达，离心收集菌体，PBS清洗后用液氮反复冻融，然后超声波破碎收集沉淀；沉淀分别用含质量分数为0.5%的Triton TM X_100、0.1~0.3Mm EDTA的PBS和含2M尿素、IOOmM NaCl的PBS清洗；再用含8M尿素、IOOmM NaCl的PBS重悬沉淀，使包涵体充分溶解；离心收集上清，抽滤，滤液用含有尿素的PBS透析；最后用PBS溶液透析，然后用Ni亲和柱纯化，用PBS溶液和含有20mM咪唑的PBS洗去未结合的蛋白后，再分别用含200mM、500mM和IM咪唑的PBS洗脱，最后用PBS溶液透析，得黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白。
9.权利要求1所述黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白在制备生物农药杀虫剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于:所述黑胸败血芽孢杆菌穿孔毒素蛋白在制备抗鳞翅目害虫的生物农药杀虫剂中的应用。
【文档编号】A01N47/44GK103626854SQ201310629013
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月28日 优先权日:2013年11月28日
【发明者】程廷才, 林平, 金盛凯, 常怀谱, 夏庆友 申请人:西南大学