从浒苔中分离纯化制备酚酸和生物碱的方法与用途
【专利摘要】本发明是一种从浒苔中的分离纯化制备酚酸和生物碱的方法：向浒苔干粉末加入无水甲醇制得蒸干物，再加入蒸馏水制得上清液；将上清液调pH后加入乙酸乙酯多次萃取制得组分ABCD；将组分A的甲醇溶液柱洗脱、将BCD甲醇溶液点样于硅胶GF254上，合并收集相同Rf处条带溶解于丙酮，经离心和减压浓缩，制备到9种组分，其中的3种组分再次以划线法点样于硅胶GF254上进行纯化制备，制备到8种组分。14种组分为生物碱和酚酸。可用于抑制米氏凯伦藻或者中肋骨条藻的生长。本发明方法可操作性强，制得的酚酸和生物碱纯度高，实现了从浒苔中提取制得酚酸和生物碱的突破。该方法制得的多种酚酸和生物碱具有海藻抑藻活性，具有实际应用价值。
【专利说明】从浒苔中分离纯化制备酚酸和生物碱的方法与用途
【技术领域】
[0001]本发明属于海洋生化工程领域，具体涉及一种从浒苔中分离纯化制备酚酸和生物碱的方法。本发明还涉及该方法制得的酚酸和生物碱的用途。
【背景技术】
[0002]由于海洋生物的生存环境不同于陆地生物，处于高盐、高压、缺氧等环境中，为求生存及竞争生存空间，很多海洋生物代谢产生一些结构独特的化学物质即次生代谢物(Secondary metabolites),酌?酸(phenolic acid, PA)和生物喊(Marine alkaloids, MA)就是其中的重要组成成分，这也造就了酚酸和生物碱独特的生物学活性，主要包括抗肿瘤作用，其次有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎等作用，对人类多种疾病有很好的疗效。另外，其作用机制具有多样性和独特性的特征，这为开发海洋生物的酚酸和生物碱的药用价值提供了很好的依据和广阔的前景，将来会有更多的海洋酚酸和生物碱被发现，并开发成为抗肿瘤、抗菌和抗病毒等药物。
[0003]f^mEnteromorpha prolifera)分类上归属于绿藻门，石药科,將苔属,俗称“绿紫菜”、“海青菜”，是重要的经济海藻，广泛分布于河口和中潮带的石沼中，多被人们用作食品、饲料和肥料等。我国野生浒苔资源十分丰富，仅在福建沿海每年的产量就在10万t以上，养殖海域中一年四季均可发生。与其他海藻相比，浒苔生长繁殖快，无须购置种苗，是一种廉价海洋生物质资源。近年来由于海水营养化，浒苔出现爆发式生长，导致“绿潮”，造成海洋灾害。对浒苔的资源化开发利用是浒苔防治的长远之计和根本点，目前，对浒苔综合利用的研究范围较小，低端开发主要集中于生物质肥料和生物质能源的开发，高端利用主要围绕食品及其添加剂，饲料、药品以及浒苔生物活性物质等几个方面。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的从浒苔中的分离纯化制备酚酸和生物碱的方法，该方法可操作性强，制得的酚酸和生物碱纯度高。
[0005]本发明所要解决的另一个技术问题是提供了上述方法所制得的酚酸和生物碱的用途。
[0006]本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种从浒苔中分离纯化制备酚酸和生物碱的方法，其特点是，其步骤如下:
(1)将浒苔干粉末加入无水甲醇，常温、黑暗下浸泡，过滤后获得浸提液；减压蒸干，得蒸干物；蒸干物加入蒸馏水，充分振荡，4°C下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，得上清液；
(2)将上清液调pH至11，加入乙酸乙酯萃取，所得上层减压蒸干，获得组分A，调节所得下层PH至7，乙酸乙酯萃取，所得上层减压蒸干，得到组分B，再调节所得下层pH至2，乙酸乙酯萃取，所得上层和下层分别减压蒸干，获得组分C和组分D ;A、B、C、D 4种组分分别溶解于无水甲醇中，制得A、B、C、D 4种甲醇溶液；
(3 )将组分A的甲醇溶液加载于S印hadex LH-20凝胶柱层析上，以30%、50%、70%、90%和100%甲醇溶液为洗脱溶剂；经薄层层析检测，合并收集洗脱液，减压浓缩，分别在30-50%、70%和100%甲醇溶液洗脱下，收集到3种组分，记为组分AA、组分AB和组分AC ;将组分AA，以及组分B、C、D的甲醇溶液点样于硅胶GF254上，进行薄层层析检测；以体积比为15:3:2的氯仿/丙酮/甲酸为展开剂，展开后，紫外254 nm下观察，组分AA出现4个斑点，Rf为 0.375,0.688,0.775和0.825 ;组分B的甲醇溶液出现2个斑点，TPf为0.602和0.851 ;组分C的甲醇溶液出现I个斑点，Rf为0.843 ;采用体积比为8:1的氯仿/甲醇为展开剂，紫外254 nm下，组分D的甲醇溶液出现2个斑点，Rf分别为0.333和0.575 ;在此基础上，以划线法多次点样，合并收集相同Ri处条带，重新溶解于丙酮，经离心和减压浓缩，制备到9种组分，依次记为组分AA1、组分AA2、组分AA3、组分AA4、组分B1、组分B2、组分C1、组分D1和组分D2 ;其中，组分AA2、组分AA4和组分C1再次以划线法点样于硅胶GF254上进行纯化，以体积比为18:1:3的氯仿/丙酮/甲酸为展开剂，制备到8种组分，依次记为组分AA21、组分AA22、组分AA23、组分AA41、组分AA42、组分AA43、组分AA44和组分C11 ；
(4)经化合物定性检测、波长扫描和薄层层析检测，上述14种组分中，组分D1和组分D2是生物碱，其余组分为酚酸；分别减压蒸干，即得。
[0007]以上所述的本发明方法制得的酚酸或者生物碱，可以用来抑制米氏凯伦藻或者中肋骨条藻的生长。
[0008]与现有技术相比，本发明方法可操作性强，制得的酚酸和生物碱纯度高，实现了从浒台中提取制得酚酸和生物碱的突破。该方法制得的多种酚酸和生物碱具有海藻抑藻活性，具有实际应用价值。
【具体实施方式】
[0009]以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
[0010]实施例1，一种从浒苔中分离纯化制备酚酸和生物碱的方法，其步骤如下:
(1)将浒苔干粉末加入无水甲醇，常温、黑暗下浸泡，过滤后获得浸提液；减压蒸干，得蒸干物；蒸干物加入蒸馏水，充分振荡，4°c下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，得上清液；
(2)将上清液调pH至11，加入乙酸乙酯萃取，所得上层减压蒸干，获得组分A，调节所得下层PH至7，乙酸乙酯萃取，所得上层减压蒸干，得到组分B，再调节所得下层pH至2，乙酸乙酯萃取，所得上层和下层分别减压蒸干，获得组分C和组分D ;A、B、C、D 4种组分分别溶解于无水甲醇中，制得A、B、C、D 4种甲醇溶液；
(3 )将组分A的甲醇溶液加载于S印hadex LH-20凝胶柱层析上，以30%、50%、70%、90%和100%甲醇溶液为洗脱溶剂；经薄层层析检测，合并收集洗脱液，减压浓缩，分别在30-50%、70%和100%甲醇溶液洗脱下，收集到3种组分，记为组分AA、组分AB和组分AC ;将组分AA，以及组分B、C、D的甲醇溶液点样于硅胶GF254上，进行薄层层析检测；以体积比为15:3:2的氯仿/丙酮/甲酸为展开剂，展开后，紫外254 nm下观察，组分AA出现4个斑点，Rf为
0.375,0.688,0.775和0.825 ;组分B的甲醇溶液出现2个斑点，TPf为0.602和0.851 ;组分C的甲醇溶液出现I个斑点，Rf为0.843 ;采用体积比为8:1的氯仿/甲醇为展开剂，紫外254 nm下，组分D的甲醇溶液出现2个斑点，Rf分别为0.333和0.575 ;在此基础上，以划线法多次点样，合并收集相同Ri处条带，重新溶解于丙酮，经离心和减压浓缩，制备到9种组分，依次记为组分AA1、组分AA2、组分AA3、组分AA4、组分B1、组分B2、组分C1、组分D1和组分D2 ;其中，组分AA2、组分AA4和组分C1再次以划线法点样于硅胶GF254上进行纯化，以体积比为18:1:3的氯仿/丙酮/甲酸为展开剂，制备到8种组分，依次记为组分AA21、组分AA22、组分AA23、组分AA41、组分AA42、组分AA43、组分AA44和组分C11 ；
(4)经化合物定性检测、波长扫描和薄层层析检测，上述14种组分中，组分D1和组分D2是生物碱，其余组分为酚酸；分别减压蒸干，即得。
[0011]实施例2，从浒苔中分离纯化制备酚酸和生物碱的方法实验:
浒苔干品粉碎成0.3 _粉末，加入无水甲醇，在常温、黑暗下浸泡3-4d。反复提取3-4次后，合并浸提液，经离心、过滤和减压蒸干，制备到蒸干物；此蒸干物加入适量蒸馏水，充分振荡，4°C下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，保留上清液。用2-5 mol/L氢氧化钠将上清液PH调至11，加入乙酸乙酯萃取3-4次。上层减压蒸干，获得组分A。调节下层pH至7，乙酸乙酯萃取3-4次，上层减压蒸干，制备到组分B。再将下层pH调节至2，乙酸乙酯萃取3-4次，上层和下层分别减压蒸干，获得组分C和组分D。上述4种组分分别溶解于无水甲醇中，制备到4种甲醇溶液。组分A溶液加载于S印hadex LH-20凝胶柱层析上，以30%、50%、70%、90%和100%甲醇溶液为洗脱溶剂。经薄层层析检测，合并收集洗脱液，减压浓缩，分别在30-50%、70%和100%甲醇溶液洗脱下，收集到3种组分，记为组分AA、组分AB和组分AC。此3种组分中，由于组分AB和组分AC非常少，因此，在后续分离过程中，仅纯化组分AA。将组分AA溶液与组分B、组分C和组分D溶液点样于硅胶GF254上，前3种组分以氯仿/丙酮/甲酸(15:3:2)为展开剂，组分D采用氯仿/甲醇(8:1)为展开剂。展开后，紫外254 nm下观察。组分AA出现4个斑点，TPf为0.375,0.688,0.775和0.825 ;组分B出现2个斑点，Ri为0.602和0.851 ;组分C出现I个斑点，Rf为0.843 ;组分D出现2个斑点，Rf分别为
0.333和0.575。在此基础上，以划线法多次点样，合并收集相同 < 处条带，重新溶解于丙酮，经离心和减压浓缩，制备到9种组分，依次记为组分AV组分AA2、组分AA3、组分AA4、组分B1、组分B2、组分C1、组分D1和组分D2 ;其中，组分AA2、组分AA4和组分C1再次以划线法点样于硅胶GF254上进行纯化，以氯仿/丙酮/甲酸(18:1:3)为展开剂，制备到8种组分，依次记为组分AA21、组分AA22、组分AA23、组分AA41、组分AA42、组分AA43、组分AA44和组分Cn。取
0.1 mL 14种组分的浓缩液，溶剂挥发后，加入I mol/L冰醋酸溶液I mL，充分振荡，加入铁氰化钾-三氯化铁显色剂(0.6 %铁氰化钾溶液和0.9 %三氯化铁溶液，使用前按0.9:1.0混合而成，现用现配)，观察颜色反应，发现组分AA1、组分AA21、组分AA22、组分AA23、组分AA3、组分AA41、组分AA42、组分AA43、组分AA44、组分B1、组分B2和组分C11呈现污绿色，为酚酸类物质的阳性反应；波长扫描显示，此12种组分在260-330 nm范围内有特征吸收峰，为酚酸类物质的特征吸收峰；12种组分的0.1 mL浓缩液，溶剂挥发后，加入碘化铋钾溶液I mL，充分振荡，仅组分D1和组分D2出现黄色沉淀，为生物碱的阳性反应。将此14种组分溶液点样于硅胶GF254上，分别在氯仿/甲醇，环己烷/乙酸乙酯和正丁醇/醋酸/水等3种展开剂下展开，发现此14种组分均呈现单一斑点；同时，采用通用型显色剂(10%硫酸溶液和碘)以及专属显色剂(铁氰化钾-三氯化铁溶液或碘化铋钾溶液)，发现在此3种显色剂下，此14种组分同样呈现单一斑点，表明纯度达到了薄层纯。最后，抑藻活性检测表明，此14种组分均能抑制米氏凯伦藻和中肋骨条藻的生长。减压蒸干，制备到14种抑藻活性物质。
[0012]实施例3，从浒苔中分离纯化制备酚酸和生物碱的方法实验:称取浒苔干粉末480 g，溶解于700 mL无水甲醇，室温黑暗下浸泡3d。提取3次后，合并提取液，经离心、过滤和减压蒸干，制备到14.8 g蒸干物。此蒸干物中加入20 mL蒸馏水，充分振荡，4°C下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，保留上清液。用2 mol/L氢氧化钠将上清液PH调至11，加入乙酸乙酯萃取3次。上层40°C下减压蒸干，获得墨绿色蒸干物1.782 g(组分A)。调节下层pH至7，乙酸乙酯萃取3次，上层40°C下减压蒸干，制备到绿色蒸干物
0.271 g (组分B)。再将下层pH调节至2，乙酸乙酯萃取3次，上层和下层分别在40°C减压蒸干，获得棕黄色蒸干物0.225 g (组分C)和棕黄色蒸干物5.108 g (组分D)。上述4种组分分别溶解于无水甲醇中，制备到4种甲醇溶液。组分A溶液加载于Sephadex LH-20凝胶柱层析上，以30%、50%、70%、90%和100%甲醇溶液为洗脱溶剂。经薄层层析检测，合并收集洗脱液，减压浓缩，分别在30-50%、70%和100%甲醇溶液洗脱下，收集到3种组分，记为组分AA、组分AB和组分AC。此3种组分中，由于组分AB和组分AC非常少，因此，在后续分离过程中，仅纯化组分AA。将组分AA溶液与组分B、组分C和组分D溶液点样于硅胶GF254上，前3种组分以氯仿/丙酮/甲酸(15:3:2)为展开剂，组分D采用氯仿/甲醇(8:1)为展开剂。展开后，紫外254 nm下观察。组分AA出现4个斑点，TPf为0.375、0.688、0.775和
0.825 ;组分B出现2个斑点，TPf为0.602和0.851 ;组分C出现I个斑点，TPf为0.843 ;组分D出现2个斑点，Rf分别为0.333和0.575。在此基础上，以划线法多次点样，合并收集相同 < 处条带，重新溶解于丙酮，经离心和减压浓缩，制备到9种组分，依次记为组分AAp组分AA2、组分AA3、组分AA4、组分B1、组分B2、组分C1、组分D1和组分D2 ;其中，组分AA2、组分AA4和组分C1再次以划线法点样于硅胶GF254上进行纯化，以氯仿/丙酮/甲酸(18:1:3)为展开剂，制备到8种组分，依次记为组分AA21、组分AA22、组分AA23、组分AA41、组分AA42、组分AA43、组分AA44和组分Cn。取0.1 mL 14种组分的浓缩液，溶剂挥发后，加入I mol/L冰醋酸溶液I mL，充分振荡，加入铁氰化钾-三氯化铁显色剂(0.6 %铁氰化钾溶液和0.9 %三氯化铁溶液，使用前按0.9:1.0混合而成，现用现配)，观察颜色反应，发现组分AA1、组分AA21、组分AA22、组分AA23、组分AA3、组分AA41、组分AA42、组分AA43、组分AA44、组分B1、组分B2和组分C11呈现污绿色，为酚酸类物质的阳性反应；波长扫描显示，此12种组分在260-330nm范围内有特征吸收峰，为酚酸类物质的特征吸收峰；12种组分的0.1 mL浓缩液，溶剂挥发后，加入碘化铋钾溶液I mL，充分振荡，仅组分D1和组分D2出现黄色沉淀，为生物碱的阳性反应。将此14种组分溶液点样于硅胶GF254上，分别在氯仿/甲醇，环己烷/乙酸乙酯和正丁醇/醋酸/水等3种展开剂下展开，发现此14种组分均呈现单一斑点；同时，采用通用型显色剂(10%硫酸溶液和碘)以及专属显色剂(铁氰化钾-三氯化铁溶液或碘化铋钾溶液)，发现在此3种显色剂下，此14种组分同样呈现单一斑点，表明纯度达到了薄层纯。最后，抑藻活性检测表明，此14种组分均能抑制米氏凯伦藻和中肋骨条藻的生长。减压蒸干，制备到14种抑藻活性物质 ，AA1黄色油状物0.014 g、AA21黄色粉末0.004 g、AA22黄色结晶性粉末0.005 g、AA23黄色粉末0.002 g、AA3黄色结晶0.040 g、AA41黄色针状结晶0.004g、AA42淡黄色粉末0.005 g、AA43淡黄色粉末0.004 g、AA44淡黄色结晶0.002 g、B:黄色颗粒物0.018 g、B2黄色油状物0.008 g、C11淡黄色粉末0.002 g、Di黄色油状物0.041 g和D2黄色粉末0.052 g0
[0013]实施例4，从浒苔中分离纯化制备酚酸和生物碱的方法实验:
称取將苔干粉末800 g,溶解于1500 mL无水甲醇,室温黑暗下浸泡4d。提取4次后，合并提取液，经离心、过滤和减压蒸干，制备到18.872 g蒸干物。此蒸干物中加入50 mL蒸馏水，充分振荡，4°C下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，保留上清液。用3 mol/L氢氧化钠将上清液PH调至11，加入乙酸乙酯萃取4次。上层40°C下减压蒸干，获得墨绿色蒸干物2.651 g (组分A)。调节下层pH至7，乙酸乙酯萃取4次，上层40°C下减压蒸干，制备到绿色蒸干物0.402 g(组分B)。再将下层pH调节至2，乙酸乙酯萃取4次，上层和下层分别在40°C减压蒸干，获得棕黄色蒸干物0.327 g (组分C)和棕黄色蒸干物10.167 g (组分D)。上述4种组分分别溶解于无水甲醇中，制备到4种甲醇溶液。组分A溶液加载于SephadexLH-20凝胶柱层析上，以30%、50%、70%、90%和100%甲醇溶液为洗脱溶剂。经薄层层析检测，合并收集洗脱液，减压浓缩，分别在30-50%、70%和100%甲醇溶液洗脱下，收集到3种组分，记为组分AA、组分AB和组分AC。此3种组分中，由于组分AB和组分AC非常少，因此，在后续分离过程中，仅纯化组分AA。将组分AA溶液与组分B、组分C和组分D溶液点样于硅胶 GF254上，前3种组分以氯仿/丙酮/甲酸(15:3:2)为展开剂，组分D采用氯仿/甲醇(8:1)为展开剂。展开后，紫外254 nm下观察。组分AA出现4个斑点，TPf为0.375、0.688、0.775和0.825 ;组分B出现2个斑点，TPf为0.602和0.851 ;组分C出现I个斑点，TPf为0.843 ；组分D出现2个斑点，Rf分别为0.333和0.575。在此基础上，以划线法多次点样，合并收集相同 < 处条带，重新溶解于丙酮，经离心和减压浓缩，制备到9种组分，依次记为组分AAp组分AA2、组分AA3、组分AA4、组分B1、组分B2、组分C1、组分D1和组分D2 ;其中，组分AA2、组分AA4和组分C1再次以划线法点样于硅胶GF254上进行纯化，以氯仿/丙酮/甲酸(18:1:3)为展开剂，制备到8种组分，依次记为组分AA21、组分AA22、组分AA23、组分AA41、组分AA42、组分AA43、组分AA44和组分Cn。取0.1 mL 14种组分的浓缩液，溶剂挥发后，加入I mol/L冰醋酸溶液I mL，充分振荡，加入铁氰化钾-三氯化铁显色剂(0.6 %铁氰化钾溶液和0.9 %三氯化铁溶液，使用前按0.9:1.0混合而成，现用现配)，观察颜色反应，发现组分AA1、组分AA21、组分AA22、组分AA23、组分AA3、组分AA41、组分AA42、组分AA43、组分AA44、组分B1、组分B2和组分C11呈现污绿色，为酚酸类物质的阳性反应；波长扫描显示，此12种组分在260-330nm范围内有特征吸收峰，为酚酸类物质的特征吸收峰；12种组分的0.1 mL浓缩液，溶剂挥发后，加入碘化铋钾溶液I mL，充分振荡，仅组分D1和组分D2出现黄色沉淀，为生物碱的阳性反应。将此14种组分溶液点样于硅胶GF254上，分别在氯仿/甲醇，环己烷/乙酸乙酯和正丁醇/醋酸/水等3种展开剂下展开，发现此14种组分均呈现单一斑点；同时，采用通用型显色剂(10%硫酸溶液和碘)以及专属显色剂(铁氰化钾-三氯化铁溶液或碘化铋钾溶液)，发现在此3种显色剂下，此14种组分同样呈现单一斑点，表明纯度达到了薄层纯。最后，抑藻活性检测表明，此14种组分均能抑制米氏凯伦藻和中肋骨条藻的生长。减压蒸干，制备到14种抑藻活性物质，AA1黄色油状物0.032 g、AA21黄色粉末0.009 g、AA22黄色结晶性粉末0.008 g、AA23黄色粉末0.004 g、AA3黄色结晶0.078 g、AA41黄色针状结晶0.008g、AA42淡黄色粉末0.012 g、AA43淡黄色粉末0.007 g、AA44淡黄色结晶0.005 g、B:黄色颗粒物0.028 g、B2黄色油状物0.011 g、Cll淡黄色粉末0.004 g、Dl黄色油状物0.079 g和D2黄色粉末0.095 g0
[0014]实施例5，从浒苔中分离纯化制备酚酸和生物碱的方法实验:
称取將苔干粉末1200 g,溶解于3500 mL无水甲醇,室温、黑暗下浸泡4d。提取4次后，合并提取液，经离心、过滤和减压蒸干，制备到30.072 g蒸干物。此蒸干物中加入100 mL蒸馏水，充分振荡，4°C下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，保留上清液。用5 mol/L氢氧化钠将上清液PH调至11，加入乙酸乙酯萃取4次。上层40°C下减压蒸干，获得墨绿色蒸干物4.012 g (组分A)。调节下层pH至7，乙酸乙酯萃取4次，上层40°C下减压蒸干，制备到绿色蒸干物0.584 g(组分B)。再将下层pH调节至2，乙酸乙酯萃取4次，上层和下层分别在40°C减压蒸干，获得棕黄色蒸干物0.516 g (组分C)和棕黄色蒸干物16.128 g (组分D)。上述4种组分分别溶解于无水甲醇中，制备到4种甲醇溶液。组分A溶液加载于SephadexLH-20凝胶柱层析上，以30%、50%、70%、90%和100%甲醇溶液为洗脱溶剂。经薄层层析检测，合并收集洗脱液，减压浓缩，分别在30-50%、70%和100%甲醇溶液洗脱下，收集到3种组分，记为组分AA、组分AB和组分AC。此3种组分中，由于组分AB和组分AC非常少，因此，在后续分离过程中，仅纯化组分AA。将组分AA溶液与组分B、组分C和组分D溶液点样于硅胶GF254上，进行薄层层析检测。以氯仿/丙酮/甲酸(15:3:2)为展开剂，展开后，紫外254 nm下观察，组分AA出现4个斑点，TPf为0.375,0.688,0.775和0.825 ;组分B出现2个斑点，TPf为0.602和0.851 ;组分C出现I个斑点，TPf为0.843。采用氯仿/甲醇(8:1)为展开剂，紫外254 nm下，组分D出现2个斑点，Rf分别为0.333和0.575。在此基础上，以划线法多次点样，合并收集相同Ri处条带，重新溶解于丙酮，经离心和减压浓缩，制备到9种组分，依次记为组分AA1、组分AA2、组分AA3、组分AA4、组分B1、组分B2、组分C1、组分D1和组分D2 ;其中，组分AA2、组分AA4和组分C1再次以划线法点样于硅胶GF254上进行纯化，以氯仿/丙酮/甲酸(18:1:3)为展开剂，制备到8种组分，依次记为组分AA21、组分AA22、组分AA23、组分AA41、组分AA42、组分AA43、组分AA44和组分Cn。取0.1 mL 14种组分的浓缩液，溶剂挥发后，加入I mol/L冰醋酸溶液I mL，充分振荡，加入铁氰化钾-三氯化铁显色剂(0.6 %铁氰化钾溶液和0.9 %三氯化铁溶液，使用前按0.9:1.0混合而成，现用现配)，观察颜色反应，发现组分AA:、组分AA21、组分AA22、组分AA23、组分AA3、组分AA41、组分AA42、组分AA43、组分AA44、组分B1、组分B2和组分C11呈现污绿色，为酚酸类物质的阳性反应；波长扫描显示，此12种组分在260-330 nm范围 内有特征吸收峰，为酚酸类物质的特征吸收峰；12种组分的0.1 mL浓缩液，溶剂挥发后，加入碘化铋钾溶液I mL，充分振荡，仅组分0:和组分D2出现黄色沉淀，为生物碱的阳性反应。将此14种组分溶液点样于硅胶GF254上，分别在氯仿/甲醇，环己烷/乙酸乙酯和正丁醇/醋酸/水等3种展开剂下展开，发现此14种组分均呈现单一斑点；同时，采用通用型显色剂(10%硫酸溶液和碘)以及专属显色剂(铁氰化钾-三氯化铁溶液或碘化铋钾溶液)，发现在此3种显色剂下，此14种组分同样呈现单一斑点，表明纯度达到了薄层纯。最后，抑藻活性检测表明，此14种组分均能抑制米氏凯伦藻和中肋骨条藻的生长。减压蒸干，制备到14种抑藻活性物质，AA1黄色油状物0.041 g、AA21黄色粉末0.0il g、AA22黄色结晶性粉末0.010 g、AA23黄色粉末0.005 g、AA3黄色结晶0.092g、AA41黄色针状结晶0.010 g、AA42淡黄色粉末0.015 g、AA43淡黄色粉末0.008 g、AA44淡黄色结晶0.006 g、B1黄色颗粒物0.043 g、B2黄色油状物0.021 g、C11淡黄色粉末0.006g、D1黄色油状物0.096 g和D2黄色粉末0.105 g。
[0015]采用抑藻圈实验进行抑藻活性检测。在数个直径为1.5 cm的圆形滤纸片上，分别滴加5 ML待测组分丙酮浓缩液和丙酮(作为对照组)，待丙酮完全挥发后，将滤纸片放置于接种对数生长期的中肋骨条藻的固体培养基上，置于GXZ-260B智能型光照培养箱中培养，温度(26±1) °C，光照强度62 Mmol m_2 s_S光暗比为12:12。2d后，观察滤纸片及周围受试微藻的生长，发现14种待测组分均对中肋骨条藻的生长表现出较为明显的抑制作用。通 过测定抑藻圈，此14种待测组分的抑藻圈均超过1.0 cm。
【权利要求】
1.一种从浒苔中分离纯化制备酚酸和生物碱的方法，其特征在于，其步骤如下: (1)将浒苔干粉末加入无水甲醇，常温、黑暗下浸泡，过滤后获得浸提液；减压蒸干，得蒸干物；蒸干物加入蒸馏水，充分振荡，4°C下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，得上清液； (2)将上清液调pH至11，加入乙酸乙酯萃取，所得上层减压蒸干，获得组分A，调节所得下层PH至7，乙酸乙酯萃取，所得上层减压蒸干，得到组分B，再调节所得下层pH至2，乙酸乙酯萃取，所得上层和下层分别减压蒸干，获得组分C和组分D ;A、B、C、D 4种组分分别溶解于无水甲醇中，制得A、B、C、D 4种甲醇溶液； (3 )将组分A的甲醇溶液加载于S印hadex LH-20凝胶柱层析上，以30%、50%、70%、90%和100%甲醇溶液为洗脱溶剂；经薄层层析检测，合并收集洗脱液，减压浓缩，分别在30-50%、70%和100%甲醇溶液洗脱下，收集到3种组分，记为组分AA、组分AB和组分AC ;将组分AA，以及组分B、C、D的甲醇溶液点样于硅胶GF254上，进行薄层层析检测；以体积比为15:3:2的氯仿/丙酮/甲酸为展开剂，展开后，紫外254 nm下观察，组分AA出现4个斑点，Rf为0.375,0.688,0.775和0.825 ;组分B的甲醇溶液出现2个斑点，TPf为0.602和0.851 ;组分C的甲醇溶液出现1个斑点，Rf为0.843 ;采用体积比为8:1的氯仿/甲醇为展开剂，紫外254 nm下，组分D的甲醇溶液出现2个斑点，Rf分别为0.333和0.575 ;在此基础上，以划线法多次点样，合并收集相同Ri处条带，重新溶解于丙酮，经离心和减压浓缩，制备到9种组分，依次记为组分AA1、组分AA2、组分AA3、组分AA4、组分B1、组分B2、组分C1、组分D1和组分D2 ;其中，组分AA2、组分AA4和组分C1再次以划线法点样于硅胶GF254上进行纯化，以体积比为18:1:3的氯仿/丙酮/甲酸为展开剂，制备到8种组分，依次记为组分AA21、组分AA22、组分AA23、组分AA41、组分AA42、组分AA43、组分AA44和组分C11 ； (4)经化合物定性检测、波长扫描和薄层层析检测，上述14种组分中，组分D1和组分D2是生物碱，其余组分为酚酸；分别减压蒸干，即得。
2.如权利要求1所述方法制得的酚酸或者生物碱在抑制米氏凯伦藻或者中肋骨条藻的生长中的用途。
【文档编号】A01N65/03GK103636679SQ201310649594
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】孙颖颖, 王辉, 董晓柯, 李光成 申请人:淮海工学院