一种丹参人工栽培方法
【专利摘要】本发明提供一种丹参人工栽培方法，利用丹参内生真菌对宿主植物丹参生长的影响，采用真菌发酵液浸种法，丹参种子的发芽势和发芽率均显著高于对照；采用丹参苗与真菌进行共培养法，促进丹参苗生长；采用真菌发酵液喷洒，促进丹参生长及品质提高，本发明在丹参人工栽培中有效地利用内生真菌，促进丹参种子的萌发和丹参苗生长，显著地提高人工栽培丹参生长状态，为丹参的人工种植和移栽奠定基础。
【专利说明】一种丹参人工栽培方法
【技术领域】
[0001]本发明属于丹参栽培领域，具体涉及一种丹参人工栽培方法。
【背景技术】
[0002]内生真菌(endophytic fungi)是指在生活史中的某一个阶段存在于健康植物组织内部，不会引起宿主明显病症或者对宿主造成明显伤害的真菌。研究发现植物内生真菌可以通过改善植物的营养条件，促进植物生长，表现在增加植物的总生物量、提高种子发芽率、幼苗存活率以及抑制病原菌等多个方面；还可以通过产生次生代谢物及快速激活宿主的逆境反应系统，增强宿主对环境的生态适应能力。内生真菌在生物制药、农业生产、工业发酵等方面上表现出美好的应用前景，已受到世界各国专家的广泛关注。
[0003]原料药丹参为唇形科植物丹参Salvia mihiorrhiza Bunge的干燥根及根莖,用于治疗冠心病、脑血管疾病和诱导各种癌细胞凋亡等，随着丹参新药的不断研制开发及市场需求量的增加，对丹参需求量亦明显攀升。丹参的需求量逐渐增加，野生资源不能满足需要，人工栽培成为解决药源的根本途径。丹参繁殖方法有种子繁殖、分根繁殖、扦插繁殖和芦头繁殖等，由于分根繁殖、扦插繁殖和芦头繁殖能够缩短丹参生长周期而为人们所常用，但种植的丹参由于长期的无性繁殖，有效成分含量极不稳定、感染病毒病等现象导致品质和产量的下降，严重影响了临床应用和制药工业的发展。丹参以种子繁殖能很好的解决由于长期的无性繁殖导致品质和产量下降等问题。然而在自然条件下丹参种子萌发率低，不耐贮藏，常温干燥贮藏丹参种子，每放置30天种子发芽率就下降10%，贮藏时间超过半年，其发芽率低于40%，从而严重影响了丹参的人工栽培。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种丹参人工栽培方法。
[0005]为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案。
[0006]一种丹参人工栽培方法，该丹参人工栽培方法包括以下步骤:
[0007]I)浸种:将丹参种子消毒后置于经过灭菌的丹参内生真菌发酵液中浸泡10_12h ；
[0008]2)萌发:浸种后用无菌水冲洗丹参种子，然后用无菌滤纸吸干丹参种子表面水分，然后放在超净工作台内晾干，将晾干后的丹参种子静置于平皿中的衬垫物上，衬垫物包括铺于平皿底部的经无菌水浸润的若干层滤纸以及铺于所述若干层滤纸上的若干层纱布，静置过程中定时向平皿中喷无菌水以保持衬垫物湿润；
[0009]3)萌发后的丹参种子经过育苗后移栽。
[0010]所述丹参种子为当年的新种子或者贮藏一年至两年的种子。
[0011]所述静置过程中采用全天光照，温度控制在25_27°C。
[0012]所述育苗包括以下步骤:
[0013]将萌发后的丹参种子转接到MS培养基中进行培养得丹参苗，培养条件为:温度为昼 / 夜=23-25°C /16-18°C，光照周期为 12/12h，照度为 1800_2000Lx。[0014]所述丹参人工栽培方法还包括以下步骤:
[0015]在育苗阶段，待丹参苗生长至株高2~3cm后，将丹参内生真菌打成菌饼，将菌饼接种于与丹参苗相距l_2cm处的培养基上进行共培养，共培养条件为:温度为昼/夜=23-250C /16-18°C，光照周期为 12/12h，照度为 1800_2000Lx。
[0016]所述丹参内生真菌为茴香裸胞壳(Emericella foeniculicola)。
[0017]所述丹参内生真菌为茴香裸胞壳(Emericella foeniculicola)TR21菌株、茴香裸胞壳(Emericella foeniculicola) N157 菌株、茴香裸胞壳(Emericella foeniculicola)NUl52 菌株或茴香裸胞壳(Emericella foeniculicola) U104 菌株。
[0018]移栽15-20天后用丹参内生真菌发酵液进行喷洒处理，每4-5株苗一次喷洒10-15mL丹参内生真菌发酵液，每周喷洒一次。
[0019]用于喷洒处理的丹参内生真菌发酵液为茴香裸胞壳(Emericellafoeniculicola) TR21 菌株、茴香裸胞壳(Emericella foeniculicola) N157 菌株或茴香裸胞壳(Emericella foeniculicola) U104 菌株的发酵液。
[0020]所述丹参内生真菌发酵液的制备方法包括以下步骤:将丹参内生真菌接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，然后置于恒温摇床中于25-28°C、130-160r/min条件下振荡培养三到四周得菌培养液，将菌培养液中的菌丝体经真空抽滤除去，然后以4000-5000r/min离心20-30min，得丹参内生真菌发酵液。
[0021]本发明的有益效果体现在:本发明在丹参人工栽培中有效地利用内生真菌，促进丹参种子的萌发，并且可 以进一步促进丹参苗生长以及显著地提高人工栽培丹参生长状态和品质，为丹参的高效人工种植奠定基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为各菌株对2010年丹参种子发芽势的影响；
[0023]图2为各菌株对2010年丹参种子发芽率的影响；
[0024]图3为各菌株对2011年丹参种子发芽势的影响；
[0025]图4为各菌株对2011年丹参种子发芽率的影响；
[0026]图5为各菌株对2012年丹参种子发芽势的影响；
[0027]图6为各菌株对2012年丹参种子发芽率的影响；
[0028]图中:**表示与对照组(CK)比较极显著，*表示与对照组(CK)比较显著。
【具体实施方式】
[0029]下面结合附图对本发明作详细说明。
[0030]在本发明的前期工作中，分离出一株产丹参酮II A内生真菌TR21，以TR21为出发菌株通过诱变方法诱变出3株能够高产丹参酮II A的内生真菌(参见文献I)，本发明旨在观察这4株菌对丹参生长的影响作用，从内源角度解决丹参人工栽培品质下降等问题。
[0031]文献(I) Caixia Ma, Dongliang Jiang, Xiying We1.Mutation breeding ofEmericella foeniculicola TR21for improved production of tanshinone IIA.ProcessBiochemistry, 2011, 46(10):2059 ~2063.[0032]I材料与方法[0033]1.1 材料
[0034]1.1.1 培养基
[0035]马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL, pH自然(即不做PH的调整)；
[0036]马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB):马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水lOOOmL，pH自然；
[0037]MS培养基:配方见表1，调pH为5.7~6。
[0038]表1
[0039]
【权利要求】
1.一种丹参人工栽培方法，其特征在于:该丹参人工栽培方法包括以下步骤: 1)浸种:将丹参种子消毒后置于经过灭菌的丹参内生真菌发酵液中浸泡10-12h； 2)萌发:浸种后用无菌水冲洗丹参种子，然后用无菌滤纸吸干丹参种子表面水分，然后放在超净工作台内晾干，将晾干后的丹参种子静置于平皿中的衬垫物上，静置过程中定时向平皿中喷无菌水以保持衬垫物湿润； 3)萌发后的丹参种子经过育苗后移栽。
2.根据权利要求1所述一种丹参人工栽培方法，其特征在于:所述丹参种子为当年的新种子或者贮藏一年至两年的种子。
3.根据权利要求1所述一种丹参人工栽培方法，其特征在于:所述静置过程中采用全天光照，温度控制在25-27 °C。
4.根据权利要求1所述一种丹参人工栽培方法，其特征在于:所述育苗包括以下步骤: 将萌发后的丹参种子转接到MS培养基中进行培养得丹参苗，培养条件为:温度为昼/夜=23-25°C /16-18°C，光照周期为 12/12h，照度为 1800_2000Lx。
5.根据权利要求4所述一种丹参人工栽培方法，其特征在于:所述丹参人工栽培方法还包括以下步骤: 在育苗阶段，待丹参苗生长至株高2~3cm后，将丹参内生真菌打成菌饼，将菌饼接种于与丹参苗相距l_2cm处的培养基上进行共培养，共培养条件为:温度为昼/夜=23-250C /16-18°C，光照周期为 12/12h，照度为 1800_2000Lx。
6.根据权利要求1或5所述一种丹参人工栽培方法，其特征在于:所述丹参内生真菌为茴香裸胞壳(Emericella foeniculicola)。
7.根据权利要求1或5所述一种丹参人工栽培方法，其特征在于:所述丹参内生真菌为茵香裸胞壳(Emericella foeniculicola) TR21菌株、茵香裸胞壳(Emericellafoeniculicola)N157 菌株、茴香裸胞壳(Emericella foeniculicola)NU152 菌株或茴香裸胞壳(Emericella foeniculicola) U104 菌株。
8.根据权利要求1所述一种丹参人工栽培方法，其特征在于:移栽15-20天后用丹参内生真菌发酵液进行喷洒处理，每4-5株苗一次喷洒10-15mL丹参内生真菌发酵液，每周喷洒一次。
9.根据权利要求8所述一种丹参人工栽培方法，其特征在于:用于喷洒处理的丹参内生真菌发酵液为茴香裸胞壳(Emericella foeniculicola) TR21菌株、茴香裸胞壳(Emericella foeniculicola)NI57 菌株或茴香裸胞壳(Emericella foeniculicola)U104菌株的发酵液。
10.根据权利要求1或8所述一种丹参人工栽培方法，其特征在于:所述丹参内生真菌发酵液的制备方法包括以下步骤:将丹参内生真菌接种于马铃薯葡萄糖液体培养基中，然后置于恒温摇床中于25-28°C、130-160r/min条件下振荡培养三到四周得菌培养液，将菌培养液中的菌丝体经真空抽滤除去，然后以4000-5000r/min离心20_30min，得丹参内生真菌发酵液。
【文档编号】A01G1/00GK103733829SQ201310655949
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】魏希颖, 王凤霞, 马彩霞, 万陕宁, 井明博, 刘颖, 王喆之 申请人:陕西师范大学