红托鹅膏菌丝体固液交替培养的方法
【专利摘要】本发明涉及一种红托鹅膏菌丝体固液交替培养的方法，属于大型真菌培养【技术领域】。其特征为：将已经诱导并扩繁的菌丝体，采用固液交替培养方法，即固体培养4～6代后，液体培养3～4代，再进行固体培养，菌丝体的生长速度为未经液体培养前的8～10倍，生长明显加快。本发明通过简单改变培养方式，即加快了菌丝体的繁殖速度，其操作简单易实现、效益明显、生产成本低。鹅膏属毒素在开发新特效药如抗肿瘤、抗菌抗病毒、镇静或麻醉药等领域具有潜在地应用，但至今因其资源珍稀、难以人工驯化等瓶颈问题尚难以开发应用。本发明征对红托鹅膏菌丝生长非常缓慢等制约纯培养的问题进行了重点研究，为菌丝规模化培养及今后人工驯化栽培等提供了条件。
【专利说明】红托鹅膏菌丝体固液交替培养的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种红托鹅膏菌丝体固液交替培养的方法，属于生物【技术领域】，具体地说是属于有毒大型真菌室内培养范畴。
【背景技术】
[0002]鹅膏菌属—)隶属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、鹅膏菌科 iaceae)，是有毒的大型真菌中较特殊、较有价值的一个世界性广布大属,其物种多
样性是非常丰富的。全球已报道近400种，中国已记录的近100种(含亚种、变种及变型)。据考证，目前中国仍有不少种尚未研究和命名。但是如今随着全球生态危机的出现，我国的许多大型真菌资源已告危，处于严重衰退及濒危状态，而部份种面临着可能还没有被人类认识或发现其价值时，就已灭绝的风险。[0003]鹅膏菌属中的大部份种属于著名剧毒菌，据知，因误食野生蕈菌中毒死亡者95%是因鹅膏菌所致。科学家们对鹅膏菌真正感兴趣的是其毒性，因此，大约在140年前，人们就开始了鹅膏菌毒素的研究。鹅膏毒素的应用研究主要体现在以下几方面:①可用于研究真核生物基因的表达、调控及细胞定位；②可开发抗菌、抗病毒特效新药可筛选抗肿瘤药物；④可开发镇静、麻醉及其它特效药可用于生物防冶等。
[0004]目前导致鹅膏难以开发及可持续性利用的主要瓶颈问题有:①鹅膏资源珍稀，其种群小，个体少，产量低，分布数量极其有限，加之对生境敏感，一旦生境受到破坏，极易消失或灭绝，属于特殊的致危生物类群，这增加了其进一步被研究、利用的难度；②鹅膏菌属，大多属于外生菌根真菌，其绝大部份种仍属于自然界中难培养或未能培养的微生物，难以人工、半人工栽培。因此，至今国内外还没有一种能规模化开发的毒素产品，现作为生化试剂的肽类毒素依然价格昂贵(10多年前每克在10万美元左右一陈作红等，1999)，难以满足科研和应用所需。
[0005]鹅膏的纯培养是保证鹅膏资源可持续性利用的前提或关键，但此目前仍然属于难以攻克的问题，存在许多盲点，其中菌丝难以诱导、菌丝生长非常缓慢是制约及影响纯培养的重要环节或因素。
[0006]红托鹅毫(A.rubrovolvata S.1mai ),属于鹅膏亚属(Amanita subgen.Amanita)鹅膏组(sect.Amanita),其种群分布较少，目前已成功分离到了该种的菌丝,但菌丝的生长前期仍然很慢，难以扩繁，本发明征对这个问题，改变培养方法，大大提高了菌丝的生长速度，为鹅膏毒素的可持续性开发利用等奠定了重要基础。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于，提供一种生产成本低、易实现，能使鹅膏菌丝快速生长的培养方法。
[0008]本发明的技术任务是，采用固液交替培养方法，以加快菌丝体的繁殖速度，其所述特征如下:将已经诱导并扩繁的菌丝体，固体培养4~6代后，液体培养3~4代，再进行固体培养2~3代，即采用固体一液体一固体的培养方法；
所述的红托鹅膏菌丝体的诱导及扩繁方法如下:野外采摘生长健状、未开伞的幼嫩子实体；取菌盖与菌柄交接处的内部无菌组织块约0.3cm2大小，轻轻嵌入诱导培养基，所述的培养基成分为:马铃薯200g/L、葡萄糖13~15g/L、酵母膏1.20~1.40g/L、MgS04l.00g/L、CaCl2 1.0Og /UKH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麦芽汁 120 ~140ml、琼脂 10.00g/L，控制培养基PH值为5.8~6.0，在22~23°C下暗培养46~55天，组织块表面长出绒毛状白色菌丝；将菌丝在上述诱导培养基中继代扩繁2~3次；
所述的固体培养方法如下:将菌丝体转入含固体培养基的直径为9cm培养皿中，在22~23°C下暗培养70~80天，待菌丝长至3.5~4.5cm时，转接，培养3~6代；所述的固体培养基成分为:马铃薯200g/L、葡萄糖15~18g/L、酵母膏1.20~1.40g/L,ZnSO40.40~0.60 g/L、MgSO40.40 ~0.60g/L、玉米素 ZT 1.00 ~1.20mg/L、复合生境物质 90 ~100g/L、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.8~6.0 ;
所述的固体培养基中的复合生境物质的制备方法如下:在红托鹅膏生长地，取生长土、共生的滇青R树根、滇青R落叶，带回实验室，烘干，用高速粉碎机分别粉碎，按土:根:叶=1: I: I的比例混合；
所述的液体培养方法如下:取培养皿中经固体培养3~6代的菌丝体，用直径为6_的无菌打孔器，无菌条件下切取菌片，剔除上面的培养基，转入含100ml液体培养基的250ml三角瓶中，每瓶接种4块，置于转速为150r/min、温度为25°C的摇床上培养，20天后，待菌丝长成分散的刺突状的细小菌球时，取IOml所培养的菌液移入新配的培养基中进行继代，20~25天，待小菌球逐渐变大，呈絮状的团块时，即可继代或转回固体培养基中；其所述的液体培养基成分为:马铃薯200g/L、葡萄糖15~18g/L、酵母膏1.20~1.40g/L、ZnSO40.40 ~0.60g/L、MgSO40.40 ~0.60g/L、ZTl.00 ~1.20mg/L、复合生境物质水提液400~500ml，控制培养基PH值为5.8~6.0 ;
所述的复合生境物质水提液的制备方法如下:取以上复合生境物质200g，加入1000ml蒸馏水浸泡1天后，加热煮沸I~2hr，过滤，滤液加热浓缩成400~500ml ；
所述的经过液体培养3~4代的絮状菌丝球，再按以上进行固体培养2~3代，菌丝生长速度为未经液体培养前的8~10倍，生长明显加快。
[0009]本发明的有益效果是:简单改变培养方式，即可以大大加快菌丝体的繁殖速度，其特点如下:
(1)操作简单易实现:通过固体一液体一固体的交替培养方法，即可明显提高菌丝体的生长速度；
(2)效益明显:经过液体培养，再转入固体培养，菌丝生长速度为未经液体培养前的8~10倍，生长明显加快；
(3)生产成本低:本发明采用常规培养方式，只是两种方式交替进行；培养基结合添加复合生境物质，该材料取自于野外，易得，因此本发明整个培养过程不涉及昂贵的生物或化学药品，也不需要特殊的设备。
【具体实施方式】
[0010]以下的实施例子是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。[0011]实例一:
野外采摘生长健状、未开伞的幼嫩子实体；取菌盖与菌柄交接处的内部无菌组织块约
0.3cm2大小，轻轻嵌入诱导培养基，所述的培养基成分为:马铃薯200g/L、葡萄糖13g/L、酵母膏 1.20g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.0Og /UKH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麦芽汁 120ml、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.8，在22~23°C下暗培养46天，组织块表面长出绒毛状白色菌丝；将菌丝在上述诱导培养基中继代扩繁3次；
再将菌丝体转入含固体培养基的直径为9cm培养皿中，在22~23 °C下暗培养70天，待菌丝长至3.5cm时，转接，培养4代；所述的固体培养基成分为:马铃薯200g/L、葡萄糖15g/L、酵母膏 1.20g/L,ZnSO40.40 g/L、MgS040.40g/L、玉米素 ZT 1.00mg/L、复合生境物质 90g/L、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.8 ;所述复合生境物质的制备方法如下:在红托鹅膏生长地，取生长土、共生的滇青R树根、滇青R落叶，带回实验室，烘干，用高速粉碎机分别粉碎，按土:根:叶=1:1:1的比例混合；
取培养皿中经固体培养3代的菌丝体，用直径为6mm的无菌打孔器，无菌条件下切取菌片，剔除上面的培养基，转入含100ml液体培养基的250ml三角瓶中，每瓶接种4块，置于转速为150r/min、温度为25°C的摇床上培养，20天后，待菌丝长成分散的刺突状的细小菌球时，取IOml所培养的菌液移入新配的培养基中进行继代，20天，待小菌球逐渐变大，呈絮状的团块时，即可继代或转回固体培养基中；其所述的液体培养基成分为:马铃薯200g/L、葡萄糖 15g/L、酵母膏 1.20g/L, ZnSO40.40g/L,MgSO40.40g/L、ZTl.00mg/L、复合生境物质水提液400ml，控制培养基PH值为5.8 ;所述复合生境物质水提液的制备方法如下:取以上复合生境物质200g，加入1000ml蒸馏水浸泡I天后，加热煮沸Ihr，过滤，滤液加热浓缩成400ml ；
将经过液体培养3代的絮状菌丝球，再按以上固体培养方法培养2代，菌丝生长速度为未经液体培养前的8倍，生长明显加快。
[0012]实例二:
野外采摘生长健状、未开伞的幼嫩子实体；取菌盖与菌柄交接处的内部无菌组织块约
0.3cm2大小，轻轻嵌入诱导培养基，所述的培养基成分为:马铃薯200g/L、葡萄糖15g/L、酵母膏 1.40g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g /UKH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麦芽汁 140ml、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为6.0，在22~23°C下暗培养55天，组织块表面长出绒毛状白色菌丝；将菌丝在上述诱导培养基中继代扩繁2次；
再将菌丝体转入含固体培养基的直径为9cm培养皿中，在22~23°C下暗培养80天，待菌丝长至4.5cm时，转接，培养6代；所述的固体培养基成分为:马铃薯200g/L、葡萄糖18g/L、酵母膏 1.40g/L,ZnSO40.60 g/L,MgS040.60g/L、玉米素 ZTL 20mg/L、复合生境物质 100g/L、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为6.0 ;所述复合生境物质的制备方法如下:在红托鹅膏生长地，取生长土、共生的滇青R树根、滇青R落叶，带回实验室，烘干，用高速粉碎机分别粉碎，按土:根:叶=1:1:1的比例混合；
取培养皿中经固体培养6代的菌丝体，用直径为6mm的无菌打孔器，无菌条件下切取菌片，剔除上面的培养基，转入含100ml液体培养基的250ml三角瓶中，每瓶接种4块，置于转速为150r/min、温度为25°C的摇床上培养，20天后，待菌丝长成分散的刺突状的细小菌球时，取IOml所培养的菌液移入新配的培养基中进行继代，25天，待小菌球逐渐变大，呈絮状的团块时，即可继代或转回固体培养基中；其所述的液体培养基成分为:马铃薯200g/L、葡萄糖 18g/L、酵母膏 1.40g/L,ZnSO40.60g/L,MgSO40.60g/L、ZTl.20mg/L、复合生境物质水提液500ml，控制培养基PH值为6.0 ;所述复合生境物质水提液的制备方法如下:取以上复合生境物质200g，加入1000ml蒸馏水浸泡I天后，加热煮沸2hr，过滤，滤液加热浓缩成500ml ；
将经过液体培养4代的絮状菌丝球，再按以上固体培养方法培养3代，菌丝生长速度为未经液体培养前的10倍，生长明显加快。
[0013]实例三:
野外采摘生长健状、未开伞的幼嫩子实体；取菌盖与菌柄交接处的内部无菌组织块约0.3cm2大小，轻轻嵌入诱导培养基，所述的培养基成分为:马铃薯200g/L、葡萄糖14g/L、酵母膏 1.30g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.0Og /UKH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麦芽汁 130ml、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.8，在22~23°C下暗培养50天，组织块表面长出绒毛状白色菌丝；将菌丝在上述诱导培养基中继代扩繁3次；
再将菌丝体转入含固体培养基的直径为9cm培养皿中，在22~23 °C下暗培养75天，待菌丝长至4.0cm时，转接，培养5代；所述的固体培养基成分为:马铃薯200g/L、葡萄糖17g/L、酵母膏 1.30g/L,ZnSO40.50 g/L、MgS040.50g/L、玉米素 ZT 1.10mg/L、复合生境物质 97g/L、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.8 ;所述复合生境物质的制备方法如下:在红托鹅膏生长地，取生长土、共生的滇青R树根、滇青R落叶，带回实验室，烘干，用高速粉碎机分别粉碎，按土:根:叶=1:1:1的比例混合；
取培养皿中经固体培养5代的菌丝体，用直径为6mm的无菌打孔器，无菌条件下切取菌片，剔除上面的培养基，转入含100ml液体培养基的250ml三角瓶中，每瓶接种4块，置于转速为150r/min、温度为25°C的摇床上培养，20天后，待菌丝长成分散的刺突状的细小菌球时，取IOml所培养的菌液移入新配的培养基中进行继代，23天，待小菌球逐渐变大，呈絮状的团块时，即可继代或转回固体培养基中；其所述的液体培养基成分为:马铃薯200g/L、葡萄糖 17g/L、酵母膏 1.30g/L, ZnSO40.50g/L,MgSO40.50g/L、ZTl.15mg/L、复合生境物质水提液450ml，控制培养基PH值为5.8 ;所述复合生境物质水提液的制备方法如下:取以上复合生境物质200g，加入1000ml蒸馏水浸泡I天后，加热煮沸1.5hr，过滤，滤液加热浓缩成450ml ；
将经过液体培养3代的絮状菌丝球，再按以上固体培养方法培养3代，菌丝生长速度为未经液体培养前的9倍，生长明显加快。
[0014]实例四:
野外采摘生长健状、未开伞的幼嫩子实体；取菌盖与菌柄交接处的内部无菌组织块约
0.3cm2大小，轻轻嵌入诱导培养基，所述的培养基成分为:马铃薯200g/L、葡萄糖13g/L、酵母膏 1.30g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 1.00g /UKH2PO4 0.50g/L、16.0 波美的麦芽汁 135ml、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为6.0，在22~23°C下暗培养53天，组织块表面长出绒毛状白色菌丝；将菌丝在上述诱导培养基中继代扩繁2次；
再将菌丝体转入含固体培养基的直径为9cm培养皿中，在22~23 °C下暗培养73天，待菌丝长至3.8cm时，转接，培养3代；所述的固体培养基成分为:马铃薯200g/L、葡萄糖16g/L、酵母膏 1.25g/L、ZnSO40.55 g/L、MgSO40.55g/L、玉米素 ZTL 15mg/L、复合生境物质 94g/L、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为6.0 ;所述复合生境物质的制备方法如下:在红托鹅膏生长地，取生长土、共生的滇青R树根、滇青R落叶，带回实验室，烘干，用高速粉碎机分别粉碎，按土:根:叶=1:1:1的比例混合；
取培养皿中经固体培养4代的菌丝体，用直径为6mm的无菌打孔器，无菌条件下切取菌片，剔除上面的培养基，转入含100ml液体培养基的250ml三角瓶中，每瓶接种4块，置于转速为150r/min、温度为25°C的摇床上培养，20天后，待菌丝长成分散的刺突状的细小菌球时，取IOml所培养的菌液移入新配的培养基中进行继代，21天，待小菌球逐渐变大，呈絮状的团块时，即可继代或转回固体培养基中；其所述的液体培养基成分为:马铃薯200g/L、葡萄糖 16g/L、酵母膏 1.30g/L,ZnSO40.55g/L,MgSO40.55g/L、ZTl.10mg/L、复合生境物质水提液430ml，控制培养基PH值为6.0 ;所述复合生境物质水提液的制备方法如下:取以上复合生境物质200g，加入1000ml蒸馏水浸泡I天后，加热煮沸1.2hr，过滤，滤液加热浓缩成430ml ；
将经过液体培养4代的絮状菌丝球，再按以上固体培养方法培养2代，菌丝生长速度为未经液体培养前的8.5倍，生长 明显加快。
【权利要求】
1.一种红托鹅膏菌丝体固液交替培养的方法，其特征为，采用固液交替培养方法，可以大大加快菌丝体的繁殖速度，其所述的培养方法为:将已经诱导并扩繁的菌丝体，固体培养4~6代后，液体培养3~4代，再进行固体培养2~3代，即采用固体一液体一固体的培养方法。
2.根据权利要求1所述的红托鹅膏菌丝体固液交替培养的方法，其特征在于，红托鹅膏菌丝体的诱导及扩繁方法如下:野外采摘生长健状、未开伞的幼嫩子实体；取菌盖与菌柄交接处的内部无菌组织块约0.3cm2大小，轻轻嵌入诱导培养基，所述的培养基成分为:马铃薯 200g/L、葡萄糖 13 ~15g/L、酵母膏 1.20 ~1.40g/L,MgSO4L 00g/L,CaCl2 1.0Og /L、KH2PO4 0.50g/L、16.0波美的麦芽汁120~140ml、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.8~6.0，在22~23°C下暗培养46~55天，组织块表面长出绒毛状白色菌丝；将菌丝在上述诱导培养基中继代扩繁2~3次。
3.根据权利要求1所述的红托鹅膏菌丝体固液交替培养的方法，其特征在于，固体培养方法如下:将菌丝体转入含固体培养基的直径为9cm培养皿中，在22~23°C下暗培养70~80天，待菌丝长至3.5~4.5cm时，转接，培养3~6代；所述的固体培养基成分为:马铃薯 200g/L、葡萄糖 15 ~18g/L、酵母膏 1.20 ~1.40g/L、ZnSO40.40 ~0.60 g/L、MgSO40.40 ~0.60g/L、玉米素 ZT 1.00 ~1.20mg/L、复合生境物质 90 ~100g/L、琼脂10.00g/L，控制培养基PH值为5.8~6.0。
4.根据权利要求3所述的固体培养方法，其特征在于，所述的固体培养基中的复合生境物质的制备方法如下:在红托鹅膏生长地，取生长土、共生的滇青R树根、滇青R落叶，带回实验室，烘干，用高速粉碎机分别粉碎，按土:根=Bf=I:1:1的比例混合。
5.根据权利要求1所述的红托鹅膏菌丝体固液交替培养的方法，其特征在于，液体培养方法如下:取培养皿中经固体培养3~6代的菌丝体，用直径为6_的无菌打孔器，无菌条件下切取菌片，剔除上面的培养基，`转入含100ml液体培养基的250ml三角瓶中，每瓶接种4块，置于转速为150r/min、温度为25°C的摇床上培养，20天后，待菌丝长成分散的刺突状的细小菌球时，取IOml所培养的菌液移入新配的培养基中进行继代，20~25天，待小菌球逐渐变大，呈絮状的团块时，即可继代或转回固体培养基中；其所述的液体培养基成分为:马铃薯 200g/L、葡萄糖 15 ~18g/L、酵母膏 1.20 ~1.40g/L、ZnSO40.40 ~0.60g/L、MgSO40.40~0.60g/L、ZTl.00~1.20mg/L、复合生境物质水提液400~500ml，控制培养基PH值为5.8~6.0。
6.根据权利要求5所述的液体培养方法，其特征在于，复合生境物质水提液的制备方法如下:取权利要求4中的复合生境物质200g，加入1000ml蒸馏水浸泡I天后，加热煮沸I~2hr,过滤,滤液加热浓缩成400~500ml。
7.根据权利要求5所述的液体培养，其特征在于，经过液体培养3~4代的絮状菌丝球，再按权利要求3进行固体培养2~3代，菌丝生长速度为未经液体培养前的8~10倍，生长明显加快。
【文档编号】C05G3/00GK103688753SQ201310702241
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月19日 优先权日:2013年12月19日
【发明者】李宗菊, 李彪, 张曦予, 冯辽辽, 赵昱, 左奎 申请人:云南大学