一种植物光诱导型基因启动子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于分子生物学领域，涉及一种植物光诱导型基因启动子及其应用，本发明提供了一种植物光诱导型基因启动子，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，或该序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸形成的编码同等功能氨基酸序列的由SEQ?ID?No.1衍生的核苷酸序列。本发明利用诱导型启动子代替组成型启动子，可以获得光诱导的特异表达的启动子；利用遗传转化技术将其导入到植物基因组中，可以实现对目的基因的定向操作，获得光诱导表达目的基因的转基因植株；这不仅可以实现目的基因在转基因植株中的定时、定点、定量三维调控，而且为植物转基因应用提供强有力的工具。
【专利说明】一种植物光诱导型基因启动子及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种植物光诱导型基因启动子及其应用。【背景技术】
[0002]植物的生长发育和生命周期是不同的基因在时间和空间上有序表达的结果。高等植物基因表达调控主要发生在转录水平上，受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互作用。启动子是一段位于基因5’端上游区的DNA序列，它包含有增强或阻遏基因表达的序列和对激素或外界胁迫有应答作用的序列，即顺式作用元件，转录调控是通过其与转录因子之间的相互作用来实现的。
[0003]植物启动子按其转录方式可以分为组成型、组织特异型和诱导型启动子，但不具有绝对性。组成型启动子广泛应用于植物转基因，如常用于转Bt基因抗虫水稻的CaMV35S启动子，ubiquitin启动子和actin启动子，它能高效、持续和非特异的启动外源基因表达，但外源蛋白在转基因植物中组成型表达也会带来很多负面影响。例如，持续合成外源基因产物会增加植物的代谢负担，并且这种高效表达经常是以大量的营养消耗为代价，从而直接影响了植株的生长发育，表现为植物生长延滞、植株矮小、产量降低等；另外，利用组成型启动子可能诱发基因沉默，影响转基因技术应用；并且，随着人们对于转基因植物食品安全问题的越来越多的关注，组成型启动子也越来越不能满足现代基因工程育种的要求。与组成型启动子相比，诱导型启动子只在某些物理或化学信号的刺激下或者植物发育到特定的阶段，才启动外源基因的转录。它不仅能使目的基因的表达产物在一定时空积累，增加区域表达量，提高植株的抗逆性，同时可避免由组成型启动子启动外源基因超表达引起的对植株发育的负面影响，也可以在一定程度上解决转基因应用中的基因沉默和食品安全性问题，是应用植物转基因技 术进行基因工程育种的理想启动子。
[0004]光是影响植物生长发育最重要的因素之一，因为它不仅作为植物感知环境的信号来源，还作为光合作用的能量来源。因此，对光诱导型启动子的研究有助于了解植物基因光下的转录调控表达模式及其调控机制，并应用于基因工程中使外源基因伴随植物生理状态适度表达，同时维持转基因植株的健康生长。
【发明内容】
[0005]为了解决上述问题，本发明的目的是解决目前分子育种过程中，因使用组成型启动子，使得外源基因持续大量表达，而破坏了植物的代谢平衡，阻碍植物正常生长发育的问题，提供一种新的植物光诱导型基因启动子序列及其应用。
[0006]为了实现本发明目的，本发明一种植物光诱导型基因启动子，其核苷酸序列如SEQID N0.1所示，全长序列为1567bp ;该序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸形成的编码同等功能氨基酸序列的由SEQ ID N0.1衍生的核苷酸序列也属于本发明的保护范围。
[0007]本发明还提供了上述光诱导型基因启动子的构建方法，具体步骤为:以玉米基因组DNA为模板，根据ZmRBCS-1基因序列设计特异性引物，进行PCR扩增，获得上述光诱导型
基因启动子。
[0008]优选地，所述玉米为B73系。
[0009]所述特异性引物的核苷酸序列为:
[0010]5， -CAAGCTT GGTCTGTATGGAAGCTCCCAGT-3，；
[0011]5， -GGGATCC CATGGCTGCCTGGCTGC CTAG-3，。
[0012]其中，PCR扩增程序为 95°C 5min ；94°C 45sec，69°C 45sec，72°C 2min，共 30 个循环；72°C延伸10min，4°C保温保存。
[0013]本发明还提供了用于扩增植物光诱导型基因启动子的引物对，其核苷酸序列为:
[0014]5， -CAAGCTT GGTCTGTATGGAAGCTCCCAGT-3，；
[0015]5， -GGGATCC CATGGCTGCCTGGCTGC CTAG-3，。
[0016]本发明还提供了含上述光诱导型启动子的植物表达载体，优选为P1-ZmRBCS-1:⑶S。
[0017]本发明还提供上述启动子在植物基因工程中获得光诱导表达目的基因的转基因植株中的应用。
[0018]本发明还提供上述启动子在培育转基因玉米和水稻中的应用。
[0019]本发明利用诱导型启动子代替组成型启动子，可以获得光诱导的特异表达的启动子；利用遗传转化技术将其导入到植物基因组中，可以实现对目的基因的定向操作，获得光诱导表达目的基因的转基因植株；这不仅可以实现目的基因在转基因植株中的定时、定点、定量三维调控，而且为植物转基因应用提供强有力的工具。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为本发明实施例1中玉米Zm-RBCS-1启动子p0片段和pi片段的克隆:A图中 M 为 DNA maker, I 为 Zm-RBCS-1 启动子 p0 片段；B 图中 M 为 DNA maker, I 为 Zm-RBCS-1启动子Pl片段。
[0021]图2为本发明实施例1中含有Zm-RBCS-1启动子pO片段和pi片段的pBI121载体质粒，酶切位点为Hind III和BamH I的酶切图。图中M为DNA maker, I为pO-ZmRBCS-l:GUS利用Hind III /BamH I双酶切的图谱，2为p1-ZmRBCS-1 AUS利用Hind III /BamH I双酶切的图谱
[0022]图3为本发明实施例2中转基因植株的PCR鉴定。A图中M为DNA maker, I为水稻中花11，2为pO-ZmRBCS-l:⑶S转基因植株；B图中M为DNA maker，I为水稻中花11，2为P1-ZmRBCS-1 AUS转基因植株。
[0023]图4为本发明实施例3中转基因水稻的叶片、叶鞘在不同光线处理后GUS染色分析结果。A图是？0-21111?05-1:^5转基因植株，？0-2111-1?05-1:^5的叶片、叶鞘⑶S染色后没有变蓝图是P1-ZmRBCS-1 AUS转基因植株，PO-Zm-RBCS-1 AUS的叶片、叶鞘⑶S染色后都变蓝，随着光照时间的延长，蓝色越来越深。
【具体实施方式】
[0024]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
[0025]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0026]实施例1玉米Zm-RBCS-1启动子pO和pi片段的克隆及序列分析⑴启动子克隆
[0027]生物信息学分析显示，Zm-RBCS-1基因的启动子中含有多个光应答的顺式作用元件，说明该基因有可能受到光诱导表达。本发明将Zm-RBCS-1基因的序列登录号ZM04G24740在Plaza网站上进行比对分析，得到包含此基因上游约2227bp (pO)和1567bp(pl)的序列。根据二者序列分别设计引物用于扩增Zm-RBCS-1的启动子pO和pi片段。设计用于扩增Zm-RBCS-1启动子pO片段引物为:正向引物5’ -CAAGCTTCTGCAGCGCGCATGGCATCGTG-3’(SEQ ID N0.4), 5'端引入HindIII 酶切位点;反向引物 5’-GGGATCCCATGGCTGCCTGGCTGCCTAG-3’ (SEQ ID N0.3)，3’ 端引入 BamHI 酶切位点。设计用于扩增 Zm-RBCS-1 启动子 Pl 片段引物为:正向引物 5’-CAAGCTT GGTCTGTATGGAAGCTCCCAGT-3’ (SEQ ID N0.2),5’ 端引入 HindIII 酶切位点；反向引物为 5’-GGGATCCCATGGCTGCCTGGCTGCCTAG-3’ (SEQ IDN0.3), 3'端引入BamHI酶切位点。利用PCR技术从玉米B73的基因组DNA上分别扩增Zm-RBCS-1启动子的pO和pi片段，得到2227bp和1567bp的PCR产物(图l)，pl片段的序列如SEQ ID N0.1所示，pO片段的序列如SEQ ID N0.5所示。
[0028]PCR反应体系:
【权利要求】
1.一种植物光诱导型基因启动子，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，或该序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸形成的编码同等功能氨基酸序列的由SEQ ID N0.1衍生的核苷酸序列。
2.一种植物光诱导型基因启动子的构建方法，具体步骤为:以玉米基因组DNA为模板，根据ZmRBCS-1基因序列设计特异性引物，进行PCR扩增，获得上述光诱导型基因启动子。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述玉米为B73。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述特异性引物的核苷酸序列为:
5’ -CAAGCTTGGTCTGTATGGAAGCTCCCAGT-3’ ；
5，-GGGATCCCATGGCTGCCTGGCTGCCTAG-3，。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，PCR扩增程序为95°C5min ；94°C 45sec，69°C 45sec，72°C 2min，共 30 个循环；72°C延伸 lOmin，4°C保温保存。
6.用于扩增植物光诱导型启动子的引物，其核苷酸序列为:
5’ -CAAGCTTGGTCTGTATGGAAGCTCCCAGT-3’ ；
5，-GGGATCCCATGGCTGCCTGGCTGCCTAG-3，。
7.含权利要求1所述启动子的植物表达载体。
8.如权利要求7所述的表达载体，其为pl-ZmRBCS-1:⑶S。
9.权利要求1所述启动子在植物基因工程中获得光诱导表达目的基因的转基因植株中的应用。
10.权利要求1所述启动子在培育转基因玉米、水稻中的应用。
【文档编号】A01H5/00GK103740718SQ201310739014
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2013年12月26日
【发明者】杨建平, 苏亮, 习雨琳, 郭林, 孟凡华, 宋梅芳, 侯佩, 方聪燕 申请人:中国农业科学院作物科学研究所