一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液配方及制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液配方及制备方法，该配方由以下化合物和对应的用量配制而成：2，4-二氯苯氧乙酸100mg/L、蔗糖35-45g/L、磷酸二氢钾2-4g/L、亚硫酸6-8ml/L、四硼酸钠0.5-1.5g/L、碳酰二胺2-4g/L、硝酸银8-10mg/L。该配方配制的培养液，用于培养授过玉米花粉、从盆钵或田间剪回室内的小麦穗，诱导产生小麦单倍体胚；在所有其它条件不改变的情况下，改用该配方后单倍体胚的诱导率可比用现有的穗培养液再提高10-15个百分点。
【专利说明】一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液配方及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于农业生物化学【技术领域】，涉及一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液配方及制备方法。
【背景技术】
[0002]Zenkteler (1984)、Laurie等(1986)建立的玉米花粉诱导小麦单倍体技术,通过20多年的研究，目前已成为产生小麦单倍体效率最高的途径之一。小麦单倍体在筛选基因突变体、基因功能研究等方面具有重要应用价值，加倍单倍体在基因定位、构建连锁遗传图谱、固定杂种优势、加速小麦育种进程等方面具有重要应用价值。
[0003]单倍体胚诱导率，也称成胚率、得胚率，是指用玉米花粉每授粉100个去雄的小麦小花能得到的小麦单倍体胚个数，它是判断小麦玉米杂交单倍体胚诱导效率的主要技术指标，也是决定该单倍体胚诱导技术能否在小麦育种上应用的关键指标之一。单倍体胚诱导率受小麦基因型、玉米基因型、玉米花粉的质量、激素处理方法、授粉后的生长条件(包括自然条件和营养条件)等多种因素的影响。目前绝大多数报道的单倍体胚诱导率只有15% -25%，成本较高，只是在极少数小麦材料上可达到30% -40%，个别材料最高为59%，单倍体胚诱导率不稳定，时低时高。因此获得较高而且稳定的单倍体胚诱导率，是小麦玉米杂交单倍体胚诱导技术在小麦育种上广泛应用必须解决的关键问题之一ο Riera-Lizarazu (1992)、Suenaga (1997)、Inagaki (1997)、Cherkaoui (2000)、Inagaki (1997,1998 )、Mujeeb-Kazi (2006)、Muhammad Ahsan Khan (2011)、MakhdoomHussain(2012)等将授过玉米花粉的麦穗剪回室内插在穗培养液中并置于室内人工控制的温度、湿度、光照条件下进行离体培养，最大限度地减少了外界复杂多变的自然因素对单倍体胚诱导、发育的影响，较好地解决了单倍体胚诱导率的稳定性问题，但大多数小麦材料的单倍体胚诱导率较低的问题仍未解决。
[0004]离体培养时，由于麦穗在脱离母体植株后还要继续生长13天以上，在此期间要保证麦穗维持正常的生理生化功能，产生更多的单倍体胚、保证单倍体胚不夭亡，穗培养液是其最主要的外部营养来源，因此穗培养液的质量至关重要。
[0005]在世界绝大多数地区，小麦和玉米两种作物都不能同季种植，小麦在冬春季节种植，而玉米则在春夏季种植，给该技术的进一步研究完善带来诸多不便。而云南多数地区的夏季，春性、弱春性、半冬性小麦与玉米都可在夏季同季种植，为研究完善该技术提供了便利条件。2000年以来我们利用云南的自然优势开展了 60余项试验研究，也报道了一些研究结果，包括高诱导率玉米基因型、高效授粉方法和激素处理方法、改进的穗培养液配方等。关于穗培养液配方，2008年我们用自主改进配方(2，4-D100mg/L+蔗糖40g/L+硝酸银10mg/L+亚硫酸8ml/L+磷酸二氢钾3g/L)与国内外报道的以下3种主要穗培养液配方进行了比较研究:
[0006]配方A:2,4_D100mg/L+鹿糖 40g/L+亚硫酸 8ml/L(Inagaki, 1997 ;蔡华等，2005 ；Mujeeb-Kazi, 2006 ；Muhammad Ahsan Khan,2011 ；Makhdoom Hussain,2012)；
[0007]配方B:2,4-D100mg/L+ 鹿糖 40g/L+ 硝酸银 10mg/L+ 亚硫酸 8ml/L(Inagaki,1998)；
[0008]配方C:2,4_D100mg/L+鹿糖 40g/L+乙醇 10ml/L(Najia Saidi, 1997 ；Cherkaoui,2000)
[0009]结果自主改进配方的单倍体胚诱导率基本稳定在30%左右(加权平均31.35%),优于其他3种配方，其中用配方C在两年两个试验点的单倍体胚诱导率均为0，详细结果见《麦类作物学报》2008年第I期第1-5页。
【发明内容】
[0010]为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液配方及制备方法，涉及高频率诱导小麦产生单倍体胚，该单倍体胚通过胚培养，可产生小麦单倍体苗，对单倍体苗进行染色体加倍，可获得加倍单倍体(Doubledhaploid,简称DH)植株。其技术方案如下:
[0011]一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液配方，该配方由以下化合物和对应的用量配制而成:2，4-二氯苯氧乙酸(别名2，4-D)100mg/L、蔗糖35-45g/L、磷酸二氢钾 2-4g/L、亚硫酸 6-8ml/L、四硼酸钠 0.5-1.5g/L、碳酰二胺 2_4g/L、硝酸银 8-lOmg/L。
[0012]进一步优选，该配方由以下化合物和对应的用量配制而成:2，4_ 二氯苯氧乙酸100mg/L、鹿糖40g/L、磷酸二氢钾3g/L、亚硫酸8ml/L、四硼酸钠1.0g/L、碳酰二胺3g/L、硝酸银9mg/L。
[0013]进一步优选，用该配方配制培养液时，所用水的最低质量要求为符合国家《生活饮用水卫生标准》(GB5749-2006)的自来水；所用蔗糖、磷酸二氢钾、亚硫酸、四硼酸钠、碳酰二胺的最低纯度要求为化学纯；所用2，4-二氯苯氧乙酸和硝酸银的纯度要求为分析纯。
[0014]进一步优选，所述麦穗离体培养液配制完成后需盛于深色容器保存备用。
[0015]本发明所述的小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液配方的制备方法，包括以下步骤:
[0016](I)称取IOOmg的2，4-二氯苯氧乙酸于烧杯，加入60ml浓度为0.1N的氢氧化钠，用玻棒或搅拌器搅拌，使2,4- 二氯苯氧乙酸完全溶解；
[0017](2)用容量为1000ml的容器量取600ml自来水，按权利要求1所述配方中各化合
物的用量，依次加入蔗糖、磷酸二氢钾、四硼酸钠、碳酰二胺、亚硫酸、硝酸银，和已溶解的2，
4-二氯苯氧乙酸；
[0018](3)加自来水定容到1000ml，摇匀，倒入深色容器常温保存备用。
[0019]本发明所述的小麦单倍体胚是指通过玉米花粉给普通小麦授粉的途径来诱导小麦产生的未进行人工染色体加倍的单倍体胚；
[0020]本发明所述的麦穗离体培养是指从田间或盆钵中剪取授过玉米花粉的麦穗插入盛有穗培养液的器皿中在室内进行昼夜连续培养。
[0021]与现有技术相比，本发明的有益效果:用该配方培养的麦穗，到培养结束的14天，茎、叶、穗仍保持绿色，即仍能维持正常的生理生化功能，且颖果结实率高，发育饱满；相比之下自主改进配方到此时茎、叶、穗已基本变黄，说明到培养结束前几天其茎、叶、穗的生理生化功能已开始衰退。因此利用本发明提供的新培养液配方，在其它条件不改变的情况下，其单倍体胚诱导率比用此前的自主改进配方平均至少提高了 5个百分点，比国内外报道的其它配方平均至少提高了 10个百分点，这在批量生产小麦加倍单倍体中，可进一步提高效率，降低成本。
【具体实施方式】
[0022]下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
[0023]实施例1:
[0024]本发明穗培养液配方(P):2，4-D100mg/L+蔗糖35g/L+磷酸二氢钾2g/L+亚硫酸6ml/L+四硼酸钠0.5g/L+碳酰二胺2g/L+硝酸银8mg/L。
[0025]对照穗培养液配方(C):2,4-D100mg/L+鹿糖40g/L+硝酸银10mg/L+亚硫酸8ml/L，配方来自于期刊 Euphytica (1998，104: 17-23)。
[0026]培养液的配制:(1)称取IOOmg的2,4_ 二氯苯氧乙酸于烧杯，加入50ml浓度为0.1N的氢氧化钠，用玻棒或搅拌器搅拌，使2，4_ 二氯苯氧乙酸完全溶解；(2)向容量为1000ml的容量瓶中加入600ml自来水，然后依次加入蔗糖35g、磷酸二氢钾2g、四硼酸钠
0.5g、碳酰二胺2g、亚硫酸6ml、硝酸银8mg和已溶解的2,4- 二氯苯氧乙酸；(3)补充自来水定容到1000ml，摇匀后倒入深色容器常温保存备用。对照穗培养液的配制只是在(2)中加入的化合物种类、用量不同，其他均相同。
[0027]小麦玉米杂交麦穗的离体培养:按照《麦类作物学报》2008年第I期第1-5页论文“小麦玉米杂交诱导小麦单倍体的割穗离体培养研究”所述的方法进行。2009年7月12日的对比试验中，将授过玉米花粉的3个不同小麦材料Al (云麦52号)、A2 (云麦101)、A3 (01Y1-608)共30个麦穗沿植株地表从田间剪回，每个小麦材料的10个麦穗分为两组，每组5穗，分别插入本发明配方配制的培养液⑵和对比培养液(C)培养14天(至2009年7月26日)，取穗，剥取颖果(籽粒)，在解剖镜下剥胚，统计每个处理的单倍体胚个数。试验结果如下:
[0028]AlP:总授粉小花数154个，结实颖果数151个，单倍体胚62个，诱导率为40.26%
[0029]AlC:总授粉小花数156个，结实颖果数124个，单倍体胚42个，诱导率为26.92%
[0030]A2P:总授粉小花数167个，结实颖果数160个，单倍体胚54个，诱导率为32.34%
[0031]A2C:总授粉小花数159个，结实颖果数132个，单倍体胚28个，诱导率为17.61%
[0032]A3P:总授粉小花数149个，结实颖果数139个，单倍体胚54个，诱导率为36.24%
[0033]A3C:总授粉小花数146个，结实颖果数120个，单倍体胚28个，诱导率为19.18%
[0034]总平均:本发明配方(P)配制的培养液共培养15穗，授粉小花数470个，共获得单倍体胚170个，单倍体胚诱导率为36.17% ;对照配方(C)配制的培养液共培养15穗，授粉小花数461个，共获得单倍体胚98个，单倍体胚诱导率为21.26%。本发明培养液的单倍体胚诱导率平均比对照高14.91个百分点。
[0035]实施例2:
[0036]穗培养液配方(P):2 ,4-D100mg/L+鹿糖45g/L+磷酸二氢钾4g/L+亚硫酸8ml/L+四硼酸钠1.5g/L+碳酰二胺4g/L+硝酸银10mg/L。
[0037]对照(C)穗培养液配方:2,4-D100mg/L+鹿糖40g/L+硝酸银10mg/L+亚硫酸8ml/L+磷酸二氢钾3g/L，配方引自《麦类作物学报》，2008，28 (I):1_5。
[0038]两个培养液的配制方法同实施例1。
[0039]小麦玉米杂交麦穗的离体培养:2011年8月7日的对比试验中，将授过玉米花粉的2个小麦不育系K78S(S1)和K456S(S2)共24个麦穗从田间剪回室内，每个小麦材料的12个麦穗分为两组,每组6穗,分别插入本配方配制的培养液(P)和对照培养液(C)培养14天(至2011年8月21日)，取穗，剥取颖果(籽粒)，在解剖镜下剥胚，统计每个处理的单倍体胚个数。试验结果如下:
[0040]SlP:总授粉小花数237个，结实颖果数221个，单倍体胚91个，诱导率为38.40%
[0041]SlC:总授粉小花数234个，结实颖果数223个，单倍体胚71个，诱导率为30.34%
[0042]S2P:总授粉小花数255个，结实颖果数249个，单倍体胚84个，诱导率为32.94%
[0043]S2C:总授粉小花数259个，结实颖果数254个，单倍体胚72个，诱导率为27.80%
[0044]总平均值:本发明配方配制的培养液(P)共培养12穗，授粉小花数492个，共获得单倍体胚175个，单倍体胚诱导率为35.57% ;对照配方配制的培养液(C)共培养12穗，授粉小花数493个，共获得单倍体胚143个，单倍体胚诱导率为29.01%。本发明培养液的单倍体胚诱导率平均比对照高6.56个百分点。
[0045]实施例3:
[0046]穗培养液配方 (P):2,4-D100mg/L+鹿糖40g/L+磷酸二氢钾3g/L+亚硫酸7ml/L、四硼酸钠1.0g/L、碳酰二胺3g/L、硝酸银9mg/L。培养液的配制方法同实施例1。
[0047]小麦玉米杂交麦穗的离体培养:2012年7月22日将授过玉米花粉的15个小麦不育系材料(S1-S15)共156个麦穗从田间剪回室内插入本配方配制的培养液中培养14天(至2012年8月5日)，取穗，剥取颖果(籽粒)，在解剖镜下剥胚，统计每个不育系材料的单倍体胚个数。试验结果如下:
[0048]SI:12穗，总授粉小花数459个，结实颖果数453个，单倍体胚180个，诱导率为39.2%
[0049]S2:15穗，总授粉小花数611个，结实颖果数574个，单倍体胚169个，诱导率为27.7%
[0050]S3:12穗，总授粉小花数493个，结实颖果数462个，单倍体胚96个，诱导率为19.5%
[0051]S4:11穗，总授粉小花数433个，结实颖果数425个，单倍体胚95个，诱导率为21.9%
[0052]S5:9穗，总授粉小花数325个，结实颖果数321个，单倍体胚116个，诱导率为35.7%
[0053]S6:10穗，总授粉小花数402个，结实颖果数371个，单倍体胚个177，诱导率为
44.0%
[0054]S7:14穗，总授粉小花数505个，结实颖果数487个，单倍体胚207个，诱导率为41.0%
[0055]S8:8穗，总授粉小花数个304，结实颖果数285个，单倍体胚107个，诱导率为35.2%
[0056]S9:5穗，总授粉小花数226个，结实颖果数个211，单倍体胚53个，诱导率为23.4%
[0057]SlO:10穗，总授粉小花数384个，结实颖果数365个，单倍体胚137个，诱导率为
35.7%
[0058]Sll: 11穗，总授粉小花数444个，结实颖果数个430，单倍体胚142个，诱导率为32.0%
[0059]S12:12穗，总授粉小花数469个，结实颖果数个461，单倍体胚205个，诱导率为43.7%
[0060]S13:7穗，总授粉小花数295个，结实颖果数个283，单倍体胚109个，诱导率为
36.9%
[0061]S14:10穗，总授粉小花数363个，结实颖果数个352，单倍体胚136个，诱导率为
37.5%
[0062]S15:10穗，总授粉小花数357个，结实颖果数个343，单倍体胚132个，诱导率为36.9%
[0063]以上15个小麦不育系材料共计培养156穗，总授粉小花数6070个，共获得单倍体胚2061个，单倍体胚诱导率为33.9%。
[0064]以上所述，仅为本发明最佳实施方式，任何熟悉本【技术领域】的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液配方，其特征在于，该配方由以下化合物和对应的用量配制而成:2，4_ 二氯苯氧乙酸100mg/L、蔗糖35-45g/L、磷酸二氢钾2-4g/L、亚硫酸 6-8ml/L、四硼酸钠 0.5-1.5g/L、碳酰二胺 2_4g/L、硝酸银 8-lOmg/L。
2.根据权利要求1所述的小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液配方，其特征在于，该配方由以下化合物和对应的用量配制而成:2，4- 二氯苯氧乙酸100mg/L、蔗糖40g/L、磷酸二氢钾3g/L、亚硫酸8ml/L、四硼酸钠1.0g/L、碳酰二胺3g/L、硝酸银9mg/L。
3.根据权利要求1所述的小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液配方，其特征在于，用该配方配制培养液时，所用水的最低质量要求为符合国家《生活饮用水卫生标准》GB5749-2006的自来水；所用蔗糖、磷酸二氢钾、亚硫酸、四硼酸钠、碳酰二胺的最低纯度要求为化学纯；所用2，4- 二氯苯氧乙酸和硝酸银的纯度要求为分析纯。
4.根据权利要求1所述的小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液配方，其特征在于，所述麦穗离体培养液配制完成后需盛于深色容器保存备用。
5.一种权利要求1所述的小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液配方的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)称取IOOmg的2，4-二氯苯氧乙酸于烧杯，加入60ml浓度为0.1N的氢氧化钠，用玻棒或搅拌器搅拌，使2,4-二氯苯氧乙酸完全溶解； (2)用容量为1000ml的容器量取600ml自来水，按权利要求1所述配方中各化合物的用量，依次加入蔗糖、磷酸二氢钾、四硼酸钠、碳酰二胺、亚硫酸、硝酸银，和已溶解的2，4-二氯苯氧乙酸； (3)加自来水定容到1000ml，摇匀，倒入深色容器常温保存备用。
【文档编号】A01H4/00GK103782907SQ201410000309
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月2日 优先权日:2014年1月2日
【发明者】杨木军, 顾坚, 李绍祥, 刘琨, 李宏生, 田玉仙, 赵红, 杨和仙, 丁明亮 申请人:云南省农业科学院粮食作物研究所