一种促进植物结瘤固氮的microRNA及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种促进植物结瘤固氮的microRNA及其应用，此microRNA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，此microRNA的前体序列如SEQ?ID?NO：3所示，此microRNA前体序列的编码基因如SEQ?ID?NO：4所示。首先构建含有SEQ?ID?NO：3所示基因的过表达重组载体，然后利用此重组表达载体构建转化体，再利用此转化体侵染目的植物，筛选得到与正常植物相比具有高固氮能力的转基因植物。本发明对提高大豆产量具有重大的意义，为培育高固氮能力的大豆新品种提供了新的基因资源。
【专利说明】—种促进植物结瘤固氮的microRNA及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物中和根瘤发育相关的小RNA，特别涉及来源于大豆的和根瘤发育相关的小RNAmicroRNA167c及其在培育高固氮能力大豆新品种方面的应用。
【背景技术】
[0002]大豆是非常重要的、具有特殊经济价值的作物。大豆根部着生的根瘤可以把空气中的氮气转化为植物可以吸收利用的氨态氮，从而为大豆生长发育提供了必需的氮素养料。由根瘤介导的共生固氮不仅影响着大豆的正常生长和产量，还有利于节约能源，减少环境化学污染。目前，提高固氮效率已成为提高大豆产量及保证农业可持续发展的重要途径
之一 。
[0003]MicroRNA (miRNA)是近年来在生物体中发现的一类长度约为20_24nt非编码的小分子RNA，已有研究表明miR169-a及其靶基因MtHAP2_l对根瘤的发育起重要调节作用(Combier et al.，2006)。miR166 在 Medicago truncatula 对根瘤的发育具有调控作用(Boualem et al.，2008)。2013年大豆中的gma_miR172被证明参与了大豆的根系结瘤过程(Yan et al.，2013)，可以看出miRNA在根瘤发育过程中起到了很重要的调控作用，从而调节着大豆成熟根瘤的共生固氮能力。大豆中与根系结瘤相关的miRNA的分离与功能鉴定将为我们阐明大豆根瘤发育的分子机制提供依据，从而为通过生物固氮提高大豆的固氮效率另辟蹊径。
[0004]miR167在拟南芥中的研究结果表明，miR167调控着拟南芥花发育过程，其在雄蕊和胚珠的发育过程中具有重要的调控作用(Wu et al.，2006)，miR167在水稻中负调控不定根的发育(Meng et al.，2010)，miR167还可以调控拟南芥根系在相应氮营养缺乏时的侧根生长(Gifford et al.，2008)。目前尚未见到关于miR167调控豆科根瘤发育的报道。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种与植物结瘤固氮能力相关的miRNA以及此miRNA的如体序列及其如体序列的编码基因，利用此miRNA能够提闻大?的结瘤固氣能力，
对提高大豆产量具有重大的意义。
[0006]为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
[0007]一种促进植物结瘤固氮的microRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，本发明的microRNA在植物细胞内与至少一条mRNA的至少一部分序列互补。
[0008]上述microRNA的互补序列,其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0009]上述microRNA的前体序列,其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0010]上述HiiCT0RNA前体序列的编码序列，其为如下的A)或者B):A)其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；B)能够在植物体内编码SEQ ID NO:3所示的microRNA前体序列并且与SEQ ID NO:4所示序列具有90%以上相似度的核苷酸序列；此编码序列被导入植物细胞后可被植物细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被植物细胞剪切且加工成成熟的miRNA,进而影响到相关生物学功能的发挥；此gma-miR167c前体序列的基因定位在大豆7号染色体上，实时荧光定量PCR检测结果表明，gma-miR167c在根瘤菌侵染后根瘤的发育过程中受到显著诱导，并且通过毛状根转化嵌合苗的结瘤分析，表明gma-miR167c在大豆根瘤发育中具有重要的作用。
[0011]包含上述编码序列的重组表达载体，在pEGAD空载体的限制性内切酶位点Age I和Hind III之间插入microRNA前体序列的基因，得到重组表达载体。
[0012]上述microRNA在培育具有高固氮能力的转基因植物中的应用。
[0013]作为上述应用方法的一种优选技术方案，在植物中过表达SEQ ID N0:1所示的miciORNA，培育出具有高固氮能力的转基因植物。
[0014]作为上述应用方法的一种优选技术方案，首先构建含有SEQ ID NO:3所示基因的重组表达载体，然后利用此重组表达载体构建转化体，再利用此转化体侵染目的植物，筛选得到与正常植物相比具有高固氮能力的转基因植物。
[0015]优选的，所述植物为大豆。
[0016]采用上述技术方案所产生的有益效果在于:参看下述实施例2，在大豆体内过表达本发明的microRNA，能够显著提高大豆的结瘤固氮能力，对提高大豆产量具有重大的意义，为培育高固氮能力的大豆新品种提供了新的基因资源。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为gma _miR167c的实时突光定量PCR结果,结果显示随着根瘤菌侵染时间的延长，gma-miR167c的表达受到显著诱导。
[0018]图2为过表达gma_miR167c后对大豆结瘤的表型分析,表明在完全相同的实验环境下，过表达gma-miR167c的转基因根同空载体转化的转基因根系(EV)相比，根瘤数量显著增多(图2A和2B)，图2C为对转基因根系中gma-miR167c的表达水平分析，结果显示在转基因根系中gma-miR167c的表达是显著上调的。
【具体实施方式】
[0019]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0020]本发明提供的miRNA来源于大豆根组织,命名为gma-miR167c,其前体序列可折叠成一种稳定的茎环结构，属于miRNA前体典型的二级结构，符合miRNA前体的结构特征。
[0021]实施例1、gma_miR167c的表达模式分析
[0022]1.gma-miR167c的实时荧光定量PCR:通过实时荧光定量PCR技术分析gma-miR167c在根瘤菌侵染后根瘤发育过程不同时期的根中的表达特性；
[0023]⑴材料获取:实验所用材料为Wilimas82 (威廉姆斯82，下文简称W82)，材料按照以下流程进行处理:大豆种子用70%的洒精灭菌30S，播种于低氮营养液浸泡的蛭石珍珠岩(3:1)混合基质中，于培养室中培养，16h光/8h暗，光强7000LUX，温度26°C，相对湿度为70%。播种后7天，每株接种慢生型根瘤菌USDAl 10菌液(0D600:0.08) 30ml，分别在接菌后0、1、3、5、10 天取根；
[0024]⑵大豆根组织中miRNA的分离:取上步所得的大豆不同发育阶段的根组织，分别使用百泰克公司出品的microRNA提取试剂盒(Cat#RP5301)提取小片段RNA，具体提取方法如下:
[0025]匀浆处理:取大豆的根组织，依次分别用液氮在研钵中快速磨碎，每50~IOOmg植物组织中加Iml裂解液；
[0026]将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15~30°C条件下孵育5min以使核蛋白体完全分解；
[0027]4°C条件下12，OOOrpm离心IOmin,小心取上清转入一个新RNase free离心管中；
[0028]每Iml裂解液加0.2ml氯仿，盖紧样品管盖，剧烈振荡15s并将其在室温下孵育3min ；
[0029]样品于4°C条件下12，OOOrpm离心IOmin ;会分成三层:下层有机相，中间层和上层无色水相，RNA存在于水相中；水相层的容量大约为所加裂解液体积的60%，把水相转移到新管中，进行下一步操作；
[0030]加入0.6倍体积70 %乙醇，颠倒混匀，此时会出现沉淀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱RA中；
[0031]10, OOOrpm离心45s，收集下滤液，下滤液中含有miRNA，准确估计下滤液的体积，加入2/3倍体积的无水乙醇，颠倒几次混匀，将混合液倒入到吸附柱II中，吸附柱RB容量约为700 μ 1，所以要分几次离心加入同一吸附柱，10，OOOrpm离心30s弃掉废液；
[0032]加入700 μ I漂洗液RW，12，OOOrpm离心60s，弃掉废液；
[0033]加入500 μ I漂洗液RW，12，OOOrpm离心60s，弃掉废液；
[0034]将吸附柱RB放回空收集管中，12，OOOrpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；
[0035]取出吸附柱RB，放入一个RNase free离心管中，在吸附膜中间部位加60-80 μ IRNase free water(事先在65_70°C水浴中加热)，室温放置2min,然后12，OOOrpm离心Imin,依次分别收集得到大豆叶、茎、根、根瘤组织的纯净miRNA，保存于-80°C冰箱中；
[0036]⑶反转录PCR:使用TIANGEN公司出品的miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒(目录号:KR201)对上步所得大豆根组织的miRNA进行反转录克隆:
[0037]首先将miRNA末端进行加poly (A)处理，在20 μ I体系中加入miRNA6 μ 1，Ε-ΡΑΡΟ.4 μ 1，10ΧΡΑΡ Buffer2u I, 5XrATP solution4 μ 1，Nuclease-free Water7.6 μ I,轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后，37°C反应60min ;所得反应液可以直接进行下游实验，也可以放置-20°C短暂保存，如需长期保存建议存放于-80°C;然后将poly(A)修饰后的miRNA进行逆转录反应，获取miRNA的cDNA，在20 μ I体系中加入Poly (A)反应液2 μ 1，10XRTprimer2 μ 1,10XRT Buffer2 μ I,超纯 dNTPMixture (2.5Mm) I μ I, RNasin (40U/μ 1)0.5 μ 1，Quant Rtase0.5 μ I, RNase_freeddH2012 μ 1，轻轻混匀上述配制的反应液，短 暂离心后，37°C反应60min ;合成的cDNA反应液放置_20°C保存，也可以直接进行下游荧光定量检测；
[0038]⑷实时荧光定量PCR分析:使用TaKaRa公司出品的SYBR Premix Ex Tag?进行定量PCR分析；[0039]在20μ I体系中加入上步所得cDNA模板2μ 1、正反向引物各0.4μ 1、SYBR PrimixEx taq?(2X) 10μ 1、ROX Reference Dye II (50X) 0.4 μ 1、ddH206.8 μ I ;扩增程序为:95°C 30s ；95°C 5s,60°C 34s,45cycles ；95°C 15s,60°C lmin，95°C 15s ;其中，正向引物为:TGAAGCTGCCAGCATGATCTG (SEQ ID NO:5);反向引物为:GCGAGCACAGAATTAATACGACT (SEQ IDNO:6)；
[0040](5)结果:gma-miR167c在根瘤菌侵染不同时期的根中的表达模式如图1所示，结果显示随着根瘤菌侵染时间的延长，gma-miR167c的表达受到显著诱导。
[0041]实施例2、基于gma_miR167c的功能培育高固氮能力大豆的方法
[0042]l、Wilimas82大豆功能叶组织中总RNA的提取
[0043]研钵经180°C高温处理8小时或经燃烧处理以消除RNA酶污染；氯仿、异丙醇，乙醇等试剂使用新开封未被污染的；其它器材如枪头、离心管和试剂如超纯水、NaAcd^经IXf5DEPC水处理过夜后121°高温湿热灭菌30分钟，枪头，离心管65°烘干备用；采用Trizol法提取大豆总RNA:
[0044](I)取50mg材料(叶片)用液氮研磨材料,加入Iml redzol试剂,充分匀衆后,将匀浆液吸入1.5ml离心管，室温放置5min ；
[0045](2)加 200 μ I 氯仿，震荡混匀，静置 2-3min, 12000g4°C离心 IOmin ；
[0046](3)取上清于另一离心管，加等体积异丙醇，-20°放置30min，12000g4°C离心IOmin ；
[0047](4) Iml75%乙醇洗沉淀，7500g离心5min,两次重复；室温风干IOmin左右，加20 μ I左右DEPC处理过的无菌水溶解沉淀。
[0048]2、反转录 PCR
[0049](I)在用DEPC处理过的的200 μ IPCR管中顺序加入5 μ LRNA和3 μ Loligo(dt) 18 ;4μ L dNTPs，65°C温育5min后迅速置于冰上冷却；
[0050](3)按以下顺序加入以下溶液:5X M-MLV buffer (invitrogen公司出品)4 μ I,RNase inhibitorI μ I, M-MLVl μ 1,0.1M DTT2μ I ；
[0051](4)将上述反应液混匀，37°C反应1.5小时；
[0052](5)反应结束后，70°C处理IOmin灭活逆转录酶活性；反应合成的cDNA第一条链可用作PCR反应模板。
[0053]3、构建重组表达载体
[0054](I) gma_miR167c 基因的克隆
[0055]根据gma_miR167c的前体序列(SEQ ID NO:3)比对得到gma_miR167c前体的编码序列，再加上上游574bp，总共890bp的序列(SEQ ID NO:4)，根据该序列设计引物对，根据载体pEGAD多克隆位点，引物末端分别引入Age I和Hind III酶切识别位点，以大豆测序品种W82的cDNA为模板进行PCR，扩增gma-miR167c前体的编码基因；引物序列为:
[0056]gma-miR167c-F:5’-TTGCACCGGTAGGAGGACCAGTGGTACTTT-3’ (SEQ ID NO:7)
[0057]gma-miR167c-R:5’-GCAAGCTTCCGGTACTGTTCAACTACAAT-3’ (SEQ ID NO:8)
[0058]扩增程序为:95°C 5分钟；95°C 30秒，57°C 30秒，72°C 40秒，26个循环；72°C I分钟；
[0059]PCR扩增产物进行I %琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化890bp左右的条带；
[0060]回收的DNA片段与pMD19-T载体(Takara公司)连接，10 μl体系中加入Tvectorl μ l, solution I 5 μl,回收片段4 μ l,混匀混合液，16°C连接过夜,热击法转入
E.coli大肠杆菌感受态细胞,过夜培养,挑阳性克隆,送交invitrogen公司测序。
[0061](2)重组表达载体的构建
[0062]1)、提取含有正确测序的gma-miR167c前体基因序列的T载体质粒，用限制性内切酶Age I和Hind III酶切，回收酶切产物；
[0063]2)、用限制性内切酶Age I和Hind III酶切空载体pEGAD，回收载体骨架；
[0064]3)、用T4连接酶将步骤I的酶切产物和步骤2的载体骨架连接；
[0065]4)、将步骤3的连接产物热激转化大肠杆菌感受态DH5 α菌株，37°C过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒PEGAD-35S::gma-miR167c。
[0066]4.农杆菌K599介导的毛状根转化:
[0067](I)农杆菌的转化
[0068]采用液氮冻溶法转化农杆菌，具体操作如下:
[0069]a.取出冻存的200 μ I感受态细胞，融化后加入5_10 μ I质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上放20-30min ；
[0070]b.放入液氮中5min后取出，将管转入37°C (5min)融化后,加入800μ1 LB(无抗性)液体培养基，28°C低速振荡(150rpm)4-5h ；
[0071]d.1OOOOrpm, 30sec,去上清,加100 μ ILB液体培养基,悬浮菌体后涂板(含50mg/ml卡那霉素);
[0072]e.置28°C培养至白色转化子长出，用于毛状根的转化；
[0073](2)农杆菌K599介导的毛状根转化
[0074]以大豆品种W82为材料，取种子材料用氯气消毒10小时后，在B5培养基(培养基配方:2 % 鹿糖，0.8 琼月旨粉(sigma), I XGAMB0RG B-5BASAL (Phyto TechnologyLaboratories,货号:G398),pH调至5.7左右；)上萌发5天,待子叶刚要张开时切下子叶，在子叶下端十字交叉切割，浸在活化的农杆菌K599中侵染30min (OD600: 0.6左右)后，将外植体转至1/2MS培养基(培养基配方:2%蔗糖，0.8琼脂粉(sigma)，0.5XMURASHIGE&SK00GBASAL MEDIOM w/VITAMINS (Phyto Technology Laboratories，货号:G519)，pH 调至 5.7 左右；)上共培生长3天后，再转至1/2MS培养基上诱导毛状根，7天后，毛状根长出，待大豆真叶长出，毛状根达到7，8cm后，选择发育阶段接近的毛状根复合苗移入无土基质(蛭石:珍珠岩=3:1)中，培养I周后接种根瘤菌USDAl 10 (OD600:0.08)20ml/株，培养28天后收取根瘤，统计根瘤数量。
[0075]5.结果观察
[0076]结果如图2所示,表明在完全相同的实验环境下,过表达gma_miR167c的转基因根同空载体转化的转基因根系(EV)相比，根瘤数量显著增多(图2A和2B)，图2C为对转基因根系中gma_miR167c的表达水平分析,结果显不在转基因根系中gma_miR167c的表达是显著上调的。
[0077]上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件，含有本发明miRNAl的前体序列，成熟miRNA序列的表达载体及序列本身，扩增所需引物， 转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种促进植物结瘤固氮的microRNA，其特征在于:其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示ο
2.权利要求1所述的microRNA的互补序列，其特征在于:其核苷酸序列如SEQID NO:2所示。
3.权利要求1所述的microRNA的前体序列,其特征在于:其核苷酸序列如SEQID NO:3所示；此前体miRNA在植物细胞内被剪切并表达得到SEQ ID NO:1所示的microRNA。
4.权利要求3所述的miCToRNA前体序列的编码序列，其特征在于:其为如下的A)或者B): A)其核苷酸序列如SEQID NO:4所示； B)能够在植物体内编码SEQID NO: 3所示的microRNA前体序列并且与SEQ ID NO:4所示序列具有90%以上相似度的核苷酸序列。
5.包含权利要求4所述编码序列的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于:在pEGAD空载体的限制性内切酶位点Age I和Hind III之间插入microRNA前体序列的基因，得到重组表达载体。
7.权利要求1所述的microRNA在培育具有高固氮能力的转基因植物中的用途。
8.根据权利要求7所述的microRNA的用途，其特征在于:在植物中过表达SEQID NO:1所示的microRNA，培育出具有高固氮能力的转基因植物。
9.根据权利要求8所述的microRNA的用途，其特征在于:首先构建含有SEQID NO:3所示基因的重组表达载体，然后利用此重组表达载体构建转化体，再利用此转化体侵染目的植物，筛选得到与正常植物相比具有高固氮能力的转基因植物。
10.根据权利要求6-9任一项所述的microRNA的用途，其特征在于:所述植物为大豆。
【文档编号】A01H5/00GK103695432SQ201410003296
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2014年1月3日 优先权日:2014年1月3日
【发明者】李霞, 王幼宁, 陈亮, 李科学 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心