建立表皮干细胞在体迁移动物模型的方法
【专利摘要】本发明属于病理学【技术领域】，具体涉及建立表皮干细胞在体迁移动物模型的方法。本发明目的是为表皮干细胞在体迁移动物模型的建立提供一种新方法。本发明的技术方案包括如下步骤：（1）用BrdU标记小鼠表皮干细胞；（2）将经步骤（1）处理后的小鼠麻醉，浅二度烫伤。本发明成功建立了表皮干细胞在体迁移的动物模型，为今后表皮干细胞离巢迁移相关研究奠定了基础。
【专利说明】建立表皮干细胞在体迁移动物模型的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于病理学【技术领域】，具体涉及一种建立表皮干细胞在体迁移动物模型的方法。
【背景技术】
[0002]皮肤覆盖于人体的外表，是人体最大的组织器官，具有抵御微生物入侵、防止水分丢失、调节体温，维持外貌及躯体功能等重要功能，是烧伤、创伤外科研究的主要内容。正常皮肤的自我更新及受损皮肤的修复是由多种类型的干细胞共同作用的结果，是维持正常的组织结构和细胞内环境稳定的基本要求。皮肤干细胞存在于基底层细胞及毛囊隆凸部中。表皮干细胞拥有无可质疑的潜能，在维持表皮自我更新、保持皮肤正常的表皮结构与功能及烧创伤后创面修复和皮肤重建方面起着重要作用。表皮干细胞最显著的两个特征是它的慢周期性与自我更新能力。慢周期性在体内表现为标记滞留细胞，即在新生动物细胞分裂活跃时参入氚标的胸苷，由于干细胞分裂缓慢，因而可长期探测到放射活性，如小鼠表皮干细胞的标记滞留可长达2年。创面修复很大程度上是通过表皮干细胞的相关离巢、增殖、分化、迁移完成的。因此表皮干细胞离巢迁移相关研究在创面修复相关研究中具有重要意义。然而目前并没有在体表皮干细胞迁移的动物模型，使表皮干细胞迁移相关研究受到瓶颈限制。传统有限方法采用动物切口模型，观察创面愈合过程中细胞的迁移情况，但未能表明创面愈合中表皮干细胞的参与作用。
【发明内容】
[0003]本发明目的是为表皮干细胞在体迁移动物模型的建立提供一种新方法。
[0004]本发明的技术方案是建立表皮干细胞在体迁移动物模型的方法，包括如下步骤:(I)用BrdU标记小鼠表皮干细胞`；(2)将经步骤(1)处理后的小鼠麻醉，浅二度烫伤。
[0005]其中，步骤(1)包括如下操作:新生3~5天的小鼠腹腔注射BrdU。
[0006]其中，步骤(2)中将步骤(1)处理6~10周后的小鼠进行浅二度烫伤。
[0007]其中，所述的烫伤创面致伤条件可为烫伤温度60~65°C，致伤压力为500g，烫伤时间为3s。
[0008]本发明成功建立了一种在体观察表皮干细胞离巢迁移的动物模型，为今后表皮干细胞离巢迁移相关研究奠定了基础。本发明将极大推动表皮干细胞迁移相关研究，进而为创面修复相关研究开创了新的技术与方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为小鼠浅二度烫伤示意图。
[0010]图2为BrdU示踪免疫组织化学检测示意图。图A为注射BrdU后第I天皮肤组织BrdU免疫组织化学后示意图。图B为注射BrdU后第2周皮肤组织BrdU免疫组织化学后示意图。图C为注射BrdU后第3周皮肤组织BrdU免疫组织化学后示意图。图D为注射BrdU后第4周皮肤组织BrdU免疫组织化学后示意图。图E为注射BrdU后第5周皮肤组织BrdU免疫组织化学后示意图。图F为注射BrdU后第6周皮肤组织BrdU免疫组织化学后示意图。图G为注射BrdU后第7周皮肤组织BrdU免疫组织化学后示意图1。图H为注射BrdU后第7周皮肤组织BrdU免疫组织化学后示意图2。
[0011]图3为创面愈合中表皮干细胞来源BrdU阳性细胞在再生表皮中分布示意图。
[0012]图4为在体表皮干细胞迁移动物模型示意图。A为新生鼠注射BrdU后I天组织组化示BrdU标记的所有细胞；B为追踪BrdU7周后BrdU成功标记表皮干细胞,箭头所示为BrdU阳性细胞；C为小鼠背部皮肤浅二度烫伤示意图，其中虚线框所示为损伤表皮；D为BrdU标注表皮干细胞在在生表皮中的迁移情况示意图，其中箭头所示为再生表皮层BrdU阳性细胞。
【具体实施方式】
[0013]本发明以表皮干细胞为研究对象，为标注表皮干细胞，采用表皮干细胞标记法，SPBrdU长期滞留实验。BrdU(5-bromo-2-deoxyuridine)是DNA合成原料脱氧胸腺核苷的类似物，从腹腔注入的BrdU可经血管途径运输至全身表皮，最后被正在合成DNA的表皮干细胞摄取，BrdU便可顺利进入到合成的DNA分子中，并随着表皮干细胞的分裂而传递到新产生的子代细胞核中。当活体注射标记物Brdu (5-bromo-2_deoxyuridine)后,细胞处于DNA合成期而同时又有BrdU存在时，就会有BrdU掺入新合成的DNA中，只要细胞不消亡，BrdU就在胞核的DNA中长期存留。应用抗BrdU单标抗体进行免疫组化反应，便可检测到表皮干细胞的增殖状态和分化成新的子代细胞的趋势以及经长期代谢后仍保留BrdU标记的细胞即为表皮干细胞。本发明中发现:注射BrdUl天时皮肤中所有细胞BrdU均呈不同程度的阳性表达；随着时间推移，BrdU在皮肤细胞核中的表达逐渐减弱、减少；BrdU追踪至6周以后阳性细胞主要分布于毛囊隆凸部，符合表皮干细胞位点。处理6周以前其他部位的BrdU未代谢完，不足以表明BrdU标记的是干细胞；如处理10周后BrdU标记干细胞数量偏少,不利于后其迁移观察因此，BrdU标记表皮干细胞准确性及标记率均较高、方法简单、安全，且对活体动物无毒副作用，可以作为标记鼠表皮干细胞的理想指标。
`[0014]表皮干细胞的迁移是创面修复的必要条件。本发明通过恒温恒压烫伤仪确定浅二度烫伤条件。在浅二度烫伤中，皮肤只残留毛囊而表皮基底中再生层细胞已被破坏。因此，浅二度烫伤修复必然为残留毛囊部细胞向表皮层迁移所致，尤其是毛囊部的毛囊干细胞起主要修复作用。经BrdU标记表皮干细胞后予浅二度烫伤。创面愈合过程中，表皮干细胞通过离巢、增殖、分化，最终迁移至表皮层。由此本发明成功建立了表皮干细胞在体迁移的动物模型，为今后表皮干细胞离巢迁移相关研究奠定了基础。本发明将极大推动表皮干细胞迁移相关研究，进而为创面修复相关研究开创了新的技术与方法。下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0015]实施例1小鼠浅二度烫伤实验
[0016]1.实施例小鼠为健康7周龄15_18g成年C57BL/6小鼠，由第三军医大学实验动物中心提供；
[0017]2.麻醉方法:棉球浸无水乙醚5s，再1%戊巴比妥钠腹腔注射，60mg/kg ；
[0018]3.备皮方法:剪刀尽量剪干净两后腿中间部背部皮肤毛发；[0019]4.烫伤使用烫伤仪为:台式超级控温烫伤仪，烫头直径1.5cm ；
[0020]5.烫伤温度:65°C ;烫伤时间为3秒；压力为烫伤棒自重0.5kg ;烫伤面积〈5%体表面积；
[0021]6.烫伤后分笼饲养，以免小鼠相互咬伤；
[0022]7.烫伤后24h取材；取材方法:取小鼠烫伤皮肤修剪成0.5cmX 0.3cm组织块；组织块取下后，先用先用0.9%的生理盐水漂洗以洗去血液与污溃。
[0023]8.4%多聚甲醛固定12h ；
[0024]9.脱水:所用的酒精浓度及过程如下:30% — 50% — 70% — 80% — 90% — 95%—100% ( I ) — 100% ( II )，各酒精脱水时间均为3分组。
[0025]10.二甲苯(I )，二甲苯(II )各透明 5min;
[0026]11.石蜡(软)65°C Ih ;
[0027]12.将组织放入盛有石蜡的模具中，摆好位置，于石蜡包埋机的冷台上冷却。
[0028]13.于组织切片机上切片
[0029]14.56O，烤片 4h
[0030]15.苏木紫伊红染色方法如下:
[0031]放于盛有二甲苯的染缸内脱蜡5min左右，
[0032](1)100%酒精洗去二甲苯511^11。
[0033](2)95%酒精311^11。
[0034](3)90%酒精311^11。
[0035](4)80%酒精311^11。
[0036](5)70%酒精311^11。
[0037](6) 50% 酒精 3min。
[0038](7)蒸馏水洗 5min。
[0039](8)苏木紫染液5min。
[0040](9)普通水洗 3min。
[0041](10)盐酸酒精分色数秒(70%酒精IOOmL +盐酸ImL)，分色到切片为带粉红色后立即取出。
[0042](11)自来水冲洗数小时。镜检切片呈清朗的蓝色，细胞核非常明显。
[0043](12)蒸馏水洗 3min。
[0044](13)50%酒精511^11。
[0045](14)70%酒精311^11。
[0046](15)80%酒精 3min。
[0047](16)伊红酒精溶液对比染色3min(95%酒精+ 0.5g伊红)。
[0048](17)95%酒精311^11。
[0049](18)无水酒精 I 5min。
[0050](19)无水酒精 II 5min。
[0051](20)无水酒精加等量二甲苯2min。
[0052](21) 二甲苯数分钟，透明为止。
[0053](22)自二甲苯中取出切片，放在格板内，滴少量的树胶于组织片中。[0054](23)取一盖玻片，轻轻以盖玻片的一边接近载玻片，然后迅速放下盖玻片，校正好盖玻片方向；将封好的切片放置在恒温箱中干燥。
[0055]16.显微镜下观察验证烫伤深度并拍照。如图1 (图片放大倍数为200倍)所示，采用超衡温烫伤仪建立成年C57bl/6小鼠浅二度烫伤条件，通过温度和时间两个因素控制烫伤的深度，进行病理切片做组织学检查，判定烫伤的深度。结果表明，通过超衡温烫伤仪控制烫伤温度为65°C、时间为3s，HE切片中整个表皮细胞和部分真皮乳头层细胞核嗜碱性改变，发生细胞核溶解现象，符合浅二度烫伤。
[0056]实施例2BrdU标记表皮干细胞实验
[0057](一)注射BrdU
[0058]选取新生3天C57bl/6小鼠；消毒后腹腔注射BrdU50mg/kg体重；分别于早上八点、晚上八点注射BrdU，连续注射3d ;分别于注射BrdU后I天、2周、3周、4周、5周、6周、7周取材。
[0059](二)取材
[0060]1、麻醉方法:棉球浸无水乙醚5s，再1%戊巴比妥钠腹腔注射，60mg/kg ；
[0061]2、备皮:剪刀尽量剪干净两后腿中间部背部皮肤毛发；
[0062]3、取皮:取小鼠烫伤皮肤修剪成0.5cmX0.3cm组织块，组织块取下后，先用0.9%的生理盐水漂洗以洗去血液与污溃；
[0063]4、固定:4%多聚甲`醛固定12小时；
[0064]5、脱水:所用的酒精浓度及过程如下:30%— 50%- 70%- 80%- 90%- 95%—100% ( I ) — 100% ( II )，各酒精脱水时间均为3分钟。
[0065]6、透明:二甲苯(I )，二甲苯(II )各3分钟；
[0066]7、浸蜡:石蜡(软)65°C Ih ;
[0067]8、包埋:组织放入蜡槽内，摆好位置，注意组织切面的摆放方向，自然冷却；
[0068]9、切片。
[0069](三)组化
[0070]1.烤片:62°C 4.5 小时;
[0071]2.脱蜡至水:二甲苯清洗5min，洗2次；100%酒精清洗5min，洗2次；95%、85%、75%、50%酒精及PBS依次各清洗3min (PBS配制后调pH值:1000mL加10MNa0H350 μ L)；
[0072]3.PBS 洗:3min，洗3 次；
[0073]4.抗原修复:ρΗ6.0枸橼酸盐缓冲液微波预热100火力(中火)5min,放入切片50火力(中低火)5min,静置5min,再50火力(中低火)5min ；
[0074]5.退热至室温Ih ；
[0075]6.PBS 洗 3min，洗3 次；
[0076]7.3%H202-甲醇室温(RT) 20min ；
[0077]8.PBS 洗 3min，洗 3 次;
[0078]9.DNA 变性:2NHC137°C 30min ；
[0079]10.0.1M 硼砂中和 pH8.5RT10min,洗 2 次；
[0080]11.卩85洗311^11，洗3次；
[0081]12.加一抗鼠抗BrdU抗体，抗体稀释度为1:50，4°C过夜；[0082]13.复温 RT30min ；
[0083]14.PBS 洗 3min，洗 3 次；
[0084]15.孵二抗:带过氧化物酶标记的二抗多聚体(中杉:PV900)37°C 30min ；
[0085]16.PBS 洗 3min，洗 3 次；
[0086]17.DAB显色(中杉:ZLI_9017)镜下控制；
[0087]18.苏木素复染:苏木紫染液5min，普通水洗2min，盐酸酒精分色数秒(70%酒精IOOmL +盐酸ImL)，分色到切片为带粉红色后立即取出；自来水冲洗数分钟，镜检切片细胞核呈较淡的蓝色即可；
[0088]19.脱水、透明、封片:PBS洗3min，50%酒精洗3min，70%酒精洗3min，80%酒精洗酒精洗3min,无水酒精洗3min洗2次,加入I:1的无水酒精和二甲苯洗Imin,二甲苯洗数分钟到透明为止，取出切片，放在格板内，中性树胶封片；
[0089]20、取一盖玻片，轻轻以盖玻片的一边接近载玻片；然后迅速放下盖玻片，中性树胶即迅速扩张到四周，校正好盖玻片方向；将封好的切片放置在恒温箱中烤干；
[0090]21、显微镜下观察并拍照。如图2所示，BrdU滞留实验中组化结果发现，注射BrdUl天时表皮中所有细胞BrdU均呈较强的阳性表达(如图2，1D)。随着追踪BrdU的时间推移，BrdU在皮肤细胞核中的表达逐渐减弱、减少(如图2，1W-5W)。BrdU追踪至6周以后阳性细胞主要分布于毛囊隆凸部(图2，6W-7W)。注:小图放大倍数均为200倍，大图放大倍数均为400倍。
[0091]实施例3表皮干细胞在体迁移动物模型的建立
[0092](一)注射BrdU
[0093]1、新生 3 天 C57bl/6 小鼠
[0094]2、腹腔注射 BrdU50mg/kg 体重
[0095]3、一天两次，连续注射3天`
[0096]4、注射fcdU后第7周后处理
[0097](二)浅二度烫伤:
[0098]1、麻醉:棉球浸无水乙醚5s，再1%戊巴比妥钠:60mg/kg腹腔注射；
[0099]2、备皮:剪刀尽量剪净两后腿中间部背部皮肤毛发；
[0100]3、烫伤仪:台式超级控温烫伤仪，烫头直径:1.5cm ；
[0101]4、烫伤温度:65°C ;烫伤时间均为3s ;压力为烫伤棒自重0.5kg ;烫伤面积<5%TBSA ；
[0102]5、分笼饲养；
[0103](三)取材
[0104]1、处理及烫伤后48h取材；
[0105]2、断颈法处死小鼠；
[0106]3、取小鼠烫伤皮肤修剪成0.5cmX0.3cm组织块，组织块取下后，0.9 %的生理盐水漂洗以洗去血液与污溃；
[0107]4、固定:4%多聚甲醛固定12h ;
[0108]5、脱水:所用的酒精浓度及过程如下:
[0109]30%— 50%— 70%— 80%— 90%— 95%— 100% ( I ) — 100% ( II )，各酒精脱水时间均为3min ；
[0110]6、透明:二甲苯(I )，二甲苯(II )各 3min ；
[0111]7、浸蜡:石蜡(软)65°C Ih ;包埋；
[0112]8、包埋:浸蜡终了时，将预先预热好的和第四杯石蜡相同熔点的石蜡倒入折好的蜡槽内，然后从第四个蜡杯中取出组织块，放入蜡槽内，摆好位置，注意组织切面的摆放方向，自然冷却；
[0113]9、切片。
[0114](四)组化
[0115]1、烤片 4.5h62°C ;
[0116]2、脱蜡至水:二甲苯 5minX2 次、100% 酒精 5minX2 次、95%、85%、75%、50% 酒精及PBS 依次各 3min (PBS 配制后调 PH 值:1000mL 加 10MNa0H350 μ L ；
[0117]3、PBS 洗 3minX3 次；
[0118]4、抗原修复:ρΗ6.0枸橼酸盐缓冲液微波预热100火力(中火)5min，放入切片50火力(中低火)5min,静置5min,再50火力(中低火)5min;
[0119]5、退热至室温，RTlh ;`
[0120]6、PBS 洗 3minX3 次；
[0121]7、3%H202-甲醇 RT20min ；
[0122]8、PBS 洗 3minX3 次；
[0123]9、DNA 变性:2NHC137°C 30min ；
[0124]10,0.1M 硼砂中和 PH8。5RT10minX2 次；
[0125]11、PBS 洗 3minX3 次；
[0126]12、加一抗 mouseantibrdul: 50,4°C过夜；
[0127]13、复温:30min;
[0128]14、PBS 洗 3minX3 次；
[0129]15、孵二抗:带过氧化物酶标记的二抗多聚体37°C 30min ；
[0130]16、PBS 洗 3minX3 次；
[0131]17、DAB显色(中杉:ZLI_9017)镜下控制；
[0132]18、苏木素复染:苏木紫染液5min，普通水洗2min，盐酸酒精分色数秒(70%酒精IOOmL +盐酸ImL)，分色到切片为带粉红色后立即取出；自来水冲洗数小时，镜检切片细胞核呈较淡的蓝色即可；
[0133]19、脱水、透明、封片:方法同前；
[0134]20、取一盖玻片，轻轻以盖玻片的一边接近载玻片，然后迅速放下盖玻片，树胶即迅速扩张到四周，校正好盖玻片方向。将封好的切片放置在恒温箱中干燥；
[0135]21、显微镜下观察并拍照。
[0136]如图3所示，用BrdU标注了表皮干细胞后予浅二度烫伤，再观察再生表皮中BrdU阳性细胞的分别。在创面愈合过程中，BrdU阳性表皮干细胞受到创面各种因子的刺激，通过离巢、增殖、分化，最终迁移至皮肤表皮层中。因而，观察到BrdU阳性细胞出现在再生表皮中。
[0137]如图4所示，新生3天C57bl/6小鼠腹腔注射BrdU，持续追踪7周，用免疫组织化学方法观察在皮肤中BrdU标注的表皮干细胞。BrdU标注表皮干细胞后予小鼠背部浅二度烫伤，使背部皮肤表皮组织完全损伤。进而观察创面愈合48小时中BrdU标注了的表皮干细胞在皮肤组织中的迁移情况。
【权利要求】
1.建立表皮干细胞在体迁移动物模型的方法，其特征在于:包括如下步骤:(I)用BrdU标记小鼠表皮干细胞；(2 )将经步骤(1)处理后的小鼠麻醉，浅二度烫伤。
2.如权利要求1所述的建立表皮干细胞在体迁移动物模型的方法，其特征在于:步骤(1)包括如下操作:新生3~5天的小鼠腹腔注射BrdU。
3.如权利要求2所述的建立表皮干细胞在体迁移动物模型的方法，其特征在于:步骤(2)中将步骤(1)处理6~10周后的小鼠进行浅二度烫伤。
4.如权利要求3所述的建立表皮干细胞在体迁移动物模型的方法，其特征在于:所述的烫伤创面致伤条 件可为烫伤温度60~65°C，致伤压力为500g，烫伤时间为3s，烫伤面积<小鼠体表面积的5%。
【文档编号】A01K67/027GK103805554SQ201410049172
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年2月12日 优先权日:2014年2月12日
【发明者】詹日兴, 罗高兴, 吴军 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院