萱藻全人工育苗技术的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种萱藻全人工育苗技术，其步骤为：（1）种质制备：由当年采集的萱藻种菜制备而成，或由往年保存的种质复苏获得；（2）种质扩增：使用气升式光生物反应器扩增萱藻种质；（3）种质诱导，使萱藻种质产生成熟的单室孢子囊；（4）孢子采苗：刺激单室孢子囊放散孢子，并采孢子于维尼纶与聚氯乙烯混纺的网帘上；（5）幼苗室内培育；（6）海上养殖：采用筏式养殖，经60-80天海上养殖，可育成体长60-100cm，密度为80-120株/厘米苗绳的商品萱藻。本发明可提高萱藻采苗效率，保证商品苗的稳定产量，具有种质利用率高、幼苗附着牢靠、育苗成本低、生产效益好等优点。可广泛应用于萱藻规模化工厂育苗及人工养殖。
【专利说明】萱藻全人工育苗技术
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种海藻养殖技术，特别涉及一种萱藻全人工育苗技术。
【背景技术】
[0002]萱藻iScytosiphon 1mentaria )隶属褐藻门),系泛温性海藻，在我国广泛分布于北起辽东半岛南至广东省海陵岛之间的沿海地区。萱藻具有异形世代交替的生活史，宏观的管状藻体为配子体阶段，微观的丝状体、垫状体和类垫状体为孢子体阶段。丝状体、垫状体和类垫状体在一定条件下可以相互转化，影响转化的关键因素是温度，高温条件可以促使丝状体形成类垫状体、垫状体，而低温条件则使类垫状体和垫状体形成丝状体。萱藻丝状体具有易保存、生长快速的特性，是萱藻保种、扩增、采苗的材料。
[0003]萱藻富含褐藻酸、蛋白质、不溶性膳食纤维、EPA，还具有岩藻留醇、豆蘧酸等营养成分，各种氨基酸组成比例平衡、口感鲜美，备受沿海地区居民的推崇。据报道，从萱藻中提取的活性成分对Ehrlich瘤细胞抑制率达到69.8%，在46种常见海藻的提取物中居于首位，并且萱藻中的活性成分还可对HL-60肿瘤细胞的生长起抑制作用，上述研究均说明萱藻在抗肿瘤应用方面极具开发价值。同时，作为一种大型海藻，萱藻在改善水体富营养化、养殖海区生态修复等方面也具有广阔的应用前景。在市场供不应求而野生资源又严重匮乏的情况下，开展萱藻规模化育苗与人工养殖已势在必行。
[0004]实现萱藻全人工育苗的关键环节在于采苗。据报道，曾有学者以萱藻丝状体切碎的方式进行采苗，但经本实验室研究人员反复的实验证实此法并不适用于萱藻的大规模人工育苗。目前关于丝状体能否直接生出幼叶状体、以何种机制生出幼叶状体的问题国内外专家尚未达成共识，以丝状 体作为萱藻幼苗的“种子”在数量及密度上难以达到由单室孢子囊放散的孢子量的数量级。而且，切碎的丝状体只能“粘附”于附着基上，这种“粘附”是不牢靠的，难以经受风浪的冲击。
【发明内容】
[0005]针对现有技术的缺陷和弊端，本发明的目的是提供一种采用孢子采苗的萱藻全人工育苗技术，不仅可以提高种质利用率，还可以解决幼苗附着差、密度低等问题。
[0006]为了实现上述目的，本发明的技术方案包括以下步骤:
(1)种质制备:由当年采集的萱藻制备而成，或由往年保存的种质复苏获得；
(2)种质扩增:将种质接种于气升式光生物反应器中进行扩增；
(3)种质诱导:将扩增后的萱藻种质在诱导条件下进行培养，形成成熟的单室孢子囊；
(4)孢子采苗:将诱导后的单室孢子囊进行阴干刺激使孢子放散，再以网帘采集孢子；采用流水刺激法冲洗阴干后的种质促使孢子放散，当水体中孢子密度达到15-25X 104ind./mL后，以网帘采集孢子；将网帘投入孢子水中，使孢子附着在网帘上，附着时间为12-48小时，附着密度为10X40倍镜下，附着有孢子的载玻片上单个视野孢子数为5-15 个；(5)幼苗室内培育:孢子经自然萌发后形成幼苗，幼苗在室内培育7-14天，控制培育条件使幼苗平均体长达300-800 μ m ；
(6)海上养殖:培育的幼苗采用筏式平挂养殖，投挂深度40-120厘米；海上养殖天数为60-80 天。
[0007]在上述步骤中，所述步骤(1)中当年种质制备方法为:选择成熟萱藻种菜，其特征为藻体深褐色、表面具有配子囊斑、中空缢节；使用消毒海水冲洗管状藻体的内外表面，将洗净的萱藻种菜于6-12°C的培养箱中阴干1-3小时后，投入4-8°C的消毒海水中放散雌、雄配子，4-24小时后雌雄配子结合成合子，将其取出在温度8-16°C，光照时长12小时，光照强度18.0-54.0 μ mol/ Cm2.s)的条件下培养40天，每3_5天全量更换培养水体，获得萱藻丝状体，即种质。
[0008]所述往年保存的种质源自萱藻种质库，由连续多年采集不同地域的萱藻种质建立而成，其种质制备方法与当年种质制备方法相同。
[0009]所述步骤(2)中种质扩增的条件为:种质接种密度为0.1-0.5mg/mL，温度18-22°C，光照时长12-16小时，光照强度43.2-108.0 μ mol/ (m2*s);控制培养水体中的营养盐NO3-N为40-80mg/mL，Ρ0/-Ρ为1_4 mg/mL,每5_7天全量更换培养水体。
[0010]所述步骤(3)中种质诱导条件为:温度14-18°c，光照时长8-12小时，光照强度14.4-36.0 μ mol/ (m2*s);控制培养水体中的营养盐 NO3-N 为 10-40 mg/mL，Ρ0/-Ρ 为 20-80mg/mL，每5-7天全量更换培养水体；诱导时间为20-35天。
[0011]所述步骤(4)中阴干刺激是指脱水避光条件下刺激经过诱导的萱藻种质，刺激时间3-5小时，保持室温10-18°C ;所述流水刺激法是指用水温10-14°C的砂滤海水冲洗阴干后的种质促使孢子放散；其中所述的网帘为孔径8-lOcm、直径7mm维尼纶与聚氯乙烯混纺的网帘。 [0012]所述步骤(5)中幼苗室内培育条件为:培育周期7-14天，水温8-18 °C，光照时长8-12小时，前期光照强度9.0-36.0 μ mo I /(m2.s )，时间为3-5天；中期光照强度36.0-72.0 μ mol/ (m2.s)，时间 2-4 天；后期光照强度 72.0-144.0 μ mol/ (m2.s)，时间为
2-5 天。
[0013]所述步骤(6)中海上养殖要求海区水温稳定在18°C以下。
[0014]本发明的优点主要体现在以下几个方面:首先，应用本发明可极大的缓解种质扩增压力，实现以需定产，从而减少能源和人力方面的付出，提高种质利用率，降低生产成本；其次，经过诱导种质形成单室孢子囊的步骤，可在采苗阶段获得大量的游动孢子，进而提高了网帘上单位面积幼苗数量，最终提升了萱藻产量；再次，以萱藻孢子做为采苗的“种子”可加强幼苗附着的牢靠程度，降低了海上养殖的风险；最后，本发明的技术路线操作简单，可实施性强，便于大规模的推广应用。
【具体实施方式】
[0015]下面通过具体实施例来详细说明本发明，应理解，下列实施例是用于说明本发明而不是限制其保护范围的。
[0016]实施例1:
萱藻种菜于当年2月下旬采集自山东长岛附近海域，选择藻体深褐色、表面具有配子囊斑、中空缢节的成熟叶状体,并以消毒海水冲洗管状藻体内外表面。将洗净后的藻体置于12°C的培养箱中阴干3小时后，投入预先布有载玻片的消毒海水中放散雌、雄配子，24小时后雌雄配子结合成合子，取出附有萱藻合子的载玻片于250mL的三角烧瓶中培养，培养条件为水温16°C，光照时长12小时，光照强度18.0-54.0 μ mol/ (m2*S)，每3_5天全量更换培养水体。培养40天后，合子发育成丝状体，即为当年种质。
[0017]使用萱藻当年种质于6月10日开始扩增，扩增条件为温度21°C，光照时长14小时，光照强度为54.0μπιΟ1/ (m2*s)0扩增后的种质于10月2日进行诱导，条件为温度16°C，光照时长8小时，光照强度为14.4 μ mol/ (m2*s)0控制培养水体中的营养盐Ν03—Ν(10-40mg/mL),P043一P(20-80mg/mL),每5-7天全量更换培养水体。诱导30天至11月I日单室孢子囊发育成熟，其特征为:颜色变为深褐色，细胞膨大明显，直径达60-80 μ m。诱导成熟的种质于11月2日进行采苗。预先将10亩的维尼纶与聚氯乙烯混纺的网帘铺在7立方米的采苗池中，将种质阴干刺激6小时后收集于160目筛絹网兜中。以10°C的砂滤海水冲洗网兜，使孢子水直接流入采苗池中至孢子水完全浸没网帘，孢子密度为15-25X 104ind./mL，孢子水使用量约5立方米，网帘与孢子水接触时间为48小时。11月4日将附有孢子的网帘放至室内池中培育，培育时间为11天，条件为水温9-ll°C，光照时长9小时。前期光照强度为9.0-36.0ymol/ (m2*s)，培养5天；中期光照强度为36.0-72.0ymol/ (m2.s)，培养2天；后期光照强度为72.0-144.0 μ mol/ (m2*s),培养4天；培育过程中，每3天全量更换培养水体。培育11天后，通过显微镜检可观察到每厘米苗绳长出的幼苗数大于150株，网帘出苗数量达到海上养殖要求。11月16日，砣矶岛养殖海区水温稳定在18°C以下，且海况适宜养殖作业。将长有幼苗的网帘水平投挂于养殖筏架上，投挂深度40-120厘米。海上养殖60天后，萱藻平均长度大于60厘米，亩产量可达鲜重1.3吨以上，达到了采收标准。
[0018]本实施例显示，由于应用孢子采苗法提高了生产效率，即使采集当年种质为材料亦可满足该年度生产需求，展现出本法在生产应用中的高效性和操作的简易性。
[0019]实施例2:
萱藻种质获得方法同实施例1，连续多年采集不同地域的萱藻种质建立萱藻种质库。从该种质库中选取健康种质于6月I日开始扩增，扩增采用充气培养的方式进行，其他条件为温度20°C，光照时长12小时，光照强度为72.0ymol/ (m2*s)0 9月26日对扩增后的种质进行诱导，条件为温度18°C，光照时长10小时，光照强度为21.6 μ mol/ (m2*s)0控制培养水体中的营养盐NOfN (10-40mg/mL)，PO/一P (20-80 mg/mL)，每5-7天全量更换培养水体。诱导26天至10月21日，萱藻单室孢子囊发育成熟，其特征为:颜色变为深褐色，细胞膨大明显，直径达60-80 μ m。诱导成熟的种质于10月22日进行孢子采苗。采苗过程在育苗车间采苗池内进行，成熟的种质阴干刺激5小时，以12.(TC的砂滤海水冲洗，使萱藻孢子放散到水体中并获得孢子水，孢子密度为15-25X 104ind./mL。将维尼纶与聚氯乙烯混纺的网帘投放于孢子水中，网帘与孢子水接触时间为36小时，每亩网帘使用0.6-0.8立方米孢子水。10月24日将附有孢子的网帘转移至室内池中暂养，室内培育9天，条件为水温16°C，光照时长10小时。前期光照强度为9.0-36.0 μ mol/ (m2*S)，培养3天；中期光照强度为36.0-72.0 μ mol/(m2 .s)，培养 2 天；后期光照强度为 72.0-144.0 μ mol/(m2.s)，培养 4 天；培育过程中，每3天全量更换培养水体。培育9天后，通过显微镜检可观察到每厘米苗绳长出的幼苗有150-300株，网帘出苗数量达到生产要求。11月2日，长岛养殖海域连续10天水温稳定在18°C以下，达到海上养殖要求。将长有幼苗的网帘水平投挂于养殖筏架上，投挂深度40-120厘米。海上养殖60-80天即可长成80-100厘米的成品萱藻，亩产量可达鲜重1.3-1.6吨。本实施例表明了孢子采苗的简易性和高效性，以及萱藻全人工育苗技术应用于规模化生产的潜力。
[0020]以上仅对本发明的特定实施例进行了说明，但本发明的保护内容不仅仅限定于以上实施例，在本发明的所属【技术领域】中，只要掌握通常知识，就可以在其技术要旨范围内，进行多样的变更，其都没有超出本发明请求保护的范围。
【权利要求】
1.一种萱藻全人工育苗技术，其特征在于它包括以下步骤: (1)种质制备:由当年采集的萱藻制备而成，或由往年保存的种质复苏获得； (2)种质扩增:将种质接种于气升式光生物反应器中进行扩增； (3)种质诱导:控制条件使扩增后萱藻种质形成成熟的单室孢子囊； (4)孢子采苗:将诱导后的单室孢子囊进行阴干刺激使孢子放散，再以网帘采集孢子；采用流水刺激法冲洗阴干后的种质促使孢子放散，当水体中孢子密度达到15-25X 104ind./mL后，以网帘采集孢子；将网帘投入孢子水中，使孢子附着在网帘上，附着时间为12-48小时，附着密度为10X40倍镜下，附着有孢子的载玻片上单个视野孢子数为5-15 个； (5)幼苗室内培育:孢子经自然萌发后形成幼苗，幼苗在室内培育7-14天，控制培育条件使幼苗平均体长达300-800 μ m ； (6)海上养殖:培育的幼苗采用筏式平挂养殖，投挂深度40-120厘米；海上养殖天数为60-80 天。
2.根据权利要求1所述的萱藻全人工育苗技术，其特征在于步骤(1)所述当年种质制备方法为:选取成熟、洗净的萱藻种菜于6-12°C的培养箱中阴干1-3小时后,投入4-8°C的消毒海水中放散雌、雄配子，4-24小时后雌雄配子结合成合子，将其取出在温度8-16°C，光照时长12小时，光照强度18.0-54.0 μ mol/ Cm2.s)的条件下培养40天，每3_5天全量更换培养水体，获得萱藻丝状体，即种质。
3.根据权利要求1所述的萱藻全人工育苗技术，其特征在于步骤(2)所述种质扩增的条件为:种质接种密度为0`.1-0.5mg/mL，温度18_22°C，光照时长12-16小时，光照强度43.2-108.0 μ mol/ (m2*s);控制培养水体中的营养盐 NO3-N 为 40_80mg/mL，Ρ0/-Ρ 为 1-4mg/mL,每5-7天全量更换培养水体。
4.根据权利要求1所述的萱藻孢子采苗技术，其特征在于步骤(3)所述种质诱导条件为:温度14-18°C，光照时长8-12小时，光照强度14.4-36.0 μ mol/ (m2*s);控制培养水体中的营养盐NO3-N为10-40 mg/mL, Ρ0/-Ρ为20-80 mg/mL,每5-7天全量更换培养水体；诱导时间为20-35天。
5.根据权利要求1所述的萱藻全人工育苗技术，其特征在于步骤(4)所述阴干刺激是指脱水避光条件下刺激经过诱导的萱藻种质，阴干刺激时间3-5小时，保持室温10-18°C。
6.根据权利要求1所述的萱藻全人工育苗技术，其特征在于步骤(4)所述流水刺激法是用水温10-14°C的砂滤海水冲洗阴干后的种质。
7.根据权利要求1所述的萱藻全人工育苗技术，其特征在于步骤(4)所述网帘为孔径8-10cm、直径7_维尼纟仑与聚氯乙烯混纺的网帘。
8.根据权利要求1所述的萱藻全人工育苗技术，其特征在于步骤(5)所述幼苗室内培育条件为:水温8-18 °C，光照时长8-12小时，前期光照强度9.0-36.0 μ mol/ (m2*s),时间为3-5天；中期光照强度36.0-72.0 μ mol/ (m2*s),时间2-4天；后期光照强度72.0-144.0 μ mol/ (m2.s)，时间为 2-5 天。
9.根据权利要求1所述的萱藻全人工育苗技术，其特征在于步骤(6)所述海上养殖要求海区水温稳定在18°C以下。
【文档编号】A01G33/00GK103858745SQ201410094497
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年3月14日 优先权日:2014年3月14日
【发明者】宫相忠, 高伟, 张文健, 邢永泽, 张必达 申请人:中国海洋大学