一种肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型及其构建方法
【专利摘要】本发明提供了一种肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型及其建立方法。所述的肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型包括前肢肩背部皮下接种有处理过的肝癌组织块的小鼠。其建立方法包括取新鲜肝癌组织，对其进行处理，将处理后的肝癌组织块接种于无瘤小鼠前肢肩背部皮下，常规饲养，得到肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型。本发明建立过程简单易行，成瘤发生率达40％-50％，可用于肝癌药物筛选及肝癌机制研究。通过本发明建立的肝癌患者来源异种移植瘤模型具有制作过程简单易行，操作所致死亡率低，成功率高、易于推广；可大批制作且同步性好的优点，适用于药物筛选及实验研究。
【专利说明】一种肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型及其构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型及其构建方法。
【背景技术】
[0002]原发性肝癌是位列全世界第五、我国第三的恶性肿瘤。根据世界卫生组织预计，在2030年前，肝癌都将保持持续增长，其病死率更是高居第二位。目前，外科手术仍是肝癌的主要治疗方法之一，但超过60%的肝癌患者在初次就诊时已经进入中晚期并伴有转移、复发，从而失去手术治疗的机会。
[0003]肿瘤动物模型是进行肿瘤相关机制和药物筛选研究的重要平台。目前，临床前肿瘤动物模型多采用肿瘤细胞系悬液建模的方法，它具有肿瘤细胞系易获得和实验易重复等优点。但是利用细胞系建立的肿瘤模型存在诸多缺陷。肿瘤细胞在体外建系的过程脱离了自然的肿瘤微环境，导致其基因发生改变；体外培养过程中选择性压力以及经过消化酶处理，破坏肿瘤组织及细胞异质性与原结构，一株细胞系所建立的动物模型仅能反映一个癌症病人；细胞系所成的肿瘤缺乏原发瘤相关微环境组份。最终导致肿瘤生物学行为和自然属性不可逆性改变，严重阻碍人类对肿瘤机制及治疗应答的研究，它已成为影响肝癌疗效改善的瓶颈，亟待解决。
[0004]肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型直接将手术切除肝癌组织种植在免疫缺陷小鼠体内，最大程度地模拟了人体内环境，保留肿瘤的特异基因、分子及其组织学异质性，可广泛应用于肝癌病因、发病机制、发展过程及治疗。与传统人癌细胞系建立的肿瘤动物模型相比，人源性肿瘤动物模型由于减少了体外处理步骤，可以更好地保持临床肿瘤组织的原始生物学特征和组织学特征，最大程度地保存了肿瘤的微环境，包括肿瘤细胞、浸润的淋巴细胞、成纤维细胞、细胞外间质和脉管系统；并且人源性移植瘤模型来自于不同的患者且没有经过人工培养，能够反映患者的遗传多样性。因此，人源性移植瘤模型将更为准确地预测药物的临床试验结果，为肿瘤个体化治疗提供更加合理的方案设计，是一种较为理想的人肿瘤动物模型。美国著名的杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)以每只上千美元价格出售肿瘤患者来源异种移植瘤小鼠模型。法国工业部对此模型计划资助金额高达540万欧元。因此，肿瘤患者来源异种移植瘤模型己形成了一个巨大的市场。目前，肿瘤患者来源异种移植瘤小鼠模型作为一种新型肿瘤模型，主要集中在乳腺癌及肺癌研究，其原因为肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型成功率极低。Yan M等2013年在Chin J Cancer Res报道构建肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型方法为:将肝癌组织分割成2mm3小块后直接移植在小鼠的肩胛下方。该方法种植成功率仅为20.83%。
[0005]因此，为了适应临床和科研需要，亟需一种新的肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型构建方法，该方法可大幅提高模型种植成功率，所构建模型适用于药物筛选及实验研究，同时还具有制作过程简单易行，操作所致死亡率低，成功率高、易于推广的特点。
【发明内容】
[0006]本发明的第一个目的在于克服现有肝癌模型的不足，提供一种能高度还原人类肝癌遗传学信息及生物学特性的动物模型，以满足医药市场对的需求。
[0007]本发明的另一目的是提供肝癌患者来源异种移植瘤模型的一种构建方法，大幅提高模型种植成功率。
[0008]为了达到上述目的，本发明提供了一种肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型，其特征在于，包括前肢肩背部皮下接种有处理过的肝癌组织块的小鼠。
[0009]优选地，所述的小鼠为非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠。
[0010]本发明还提供了上述的肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型的建立方法，其特征在于，具体步骤包括:取新鲜肝癌组织，对其进行处理，将处理后的肝癌组织块接种于无瘤小鼠前肢肩背部皮下，常规饲养，得到肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型。
[0011]优选地，所述的新鲜肝癌组织的处理方法包括:将新鲜肝癌组织放入含培养液的试管中移至超净台，备用；取出新鲜肝癌组织，用培养液冲洗2-3次，分割成体积为8-32mm3的肝癌组织块，用无菌孵育液在1-10°C浸没肝癌组织块30-90分钟，得到处理后的肝癌组织块。
[0012]更优选地，所述的培养液为DMEM培养液，其制备方法为:将90体积份的DMEM与10体积份的胎牛血清混合，加入青霉素和链霉素，得到DMEM培养液，其中，青霉素的终浓度为50-200U/ml，链霉素的终浓度为50_200U/ml。
[0013]更优选地，所述的无菌孵育液的制备方法为:将45体积份的DMEM，5体积份的胎牛血清和50体积份的Matrigel胶混合，加入表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)、青霉素和链霉素，得到无菌孵育液，其中，表皮生长因子的终浓度为5-20ng/ml，成纤维细胞生长因子的终浓度为5-20ng/ml，青霉素的终浓度为50_200U/ml，链霉素的终浓度为 50-200U/mL.[0014]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
[0015]本发明将患者肝癌组织直接接种在实验小鼠的前肢肩背部皮下，保留肿瘤微环境，忠实地还原它所对应的患者中的相关特征，整个模型建立过程简单易行，成瘤发生率达40%-50%，可用于肝癌药物筛选及肝癌机制研究。通过本发明建立的肝癌患者来源异种移植瘤模型具有制作过程简单易行，操作所致死亡率低，成功率高、易于推广；可大批制作且同步性好的优点，适用于药物筛选及实验研究。
【具体实施方式】
[0016]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0017]将相同寿命在3-4周、雄性的120只非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠分为A、B、C、D四组，每组数量为30只。
[0018]实施例1
[0019]一种肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型由前肢肩背部皮下接种有处理过的肝癌组织块的小鼠构成，其建立方法为:
[0020](I)配制培养液:将90体积份的DMEM与10体积份的胎牛血清混合，加入青霉素和链霉素，得到DMEM培养液，其中，青霉素的终浓度为100U/ml，链霉素的终浓度为100U/ml，得到培养液。
[0021](2)配制无菌孵育液:将45体积份的DMEM，5体积份的胎牛血清和50体积份的Matrigel胶(BD公司；货号:356234)混合，加入表皮生长因子(EGF) (Gibco公司；货号:PHG0314)、成纤维细胞生长因子(bFGF) (Gibco公司；货号:PHG0264)、青霉素和链霉素，得到无菌孵育液，其中，表皮生长因子的终浓度为10ng/ml，成纤维细胞生长因子的终浓度为10ng/ml，青霉素的终浓度为100U/ml，链霉素的终浓度为100U/ml，得到无菌孵育液。
[0022](3)分别将10个患者手术切除的新鲜肝癌组织(离体5分钟内)置入含有步骤(I)中配制的培养液的试管中，放入冰中迅速转移到超净台内，备用；
[0023](4)在无菌条件下将肿瘤组织用步骤(1)中配制的培养液冲洗2遍；清除坏死组织，选择血管丰富的肝癌组织分割成2X2X2mm3的小块，用步骤(2)制备的无菌孵育液在4°C浸润30分钟，备用；
[0024](5)选用A组共30只雄性，3周龄，重量18_22g，非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠(N0D/SCID)。每个患者的肝癌组织取三个小块，分别接种在3只小鼠的前肢肩背部皮下，具体接种方法为:在小鼠腹部备皮，再以碘伏消毒。用20号套管针将总量2 X 2 X 2mm3的肝癌组织于腹部腋中线处刺入，针头走行于皮肤与腹膜间，最终将组织送入前肢肩背部皮下，压迫伤口至无出血；
[0025](6) SPF级环境下常规饲养60天，完成建立肝癌患者来源异种移植瘤模型，并对模型编号为1-10号(每个编号所对应3只小鼠中大于等于I只成瘤，即认定该编号模型建模成功)。
[0026]A组小鼠接种移植后观察小鼠一般活动及营养状态等。每三天用游标卡尺测量移植瘤长(L)短(W)径平均值，按体积公式V = 1/2 (Lff2)计算移植瘤平均体积。移植约4周后肉眼可见局部形成肿瘤结节，第10周肿瘤呈半球形，平均瘤体体积约1.59cm3。解剖小鼠，大体移植瘤组织呈鱼肉样，血供丰富，中央可见坏死，H&E染色后确认病理分型为肝细胞癌，与对应患者病理分型相一致。经过上述步骤，2号模型所对应3只小鼠中有2只成瘤，4号模型有2只成瘤，8号及9号模型分别有I只成瘤。最终建立4个模型，小鼠的成瘤率为40%。
[0027]实施例2
[0028]一种肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型由前肢肩背部皮下接种有处理过的肝癌组织块的小鼠构成，其建立方法为:
[0029](I)配制培养液:将90体积份的DMEM与10体积份的胎牛血清混合，加入青霉素和链霉素，得到DMEM培养液，其中，青霉素的终浓度为100U/ml，链霉素的终浓度为100U/ml，得到培养液。
[0030](2)配制无菌孵育液:将45体积份的DMEM，5体积份的胎牛血清和50体积份的Matrigel胶(BD公司；货号:356234)混合，加入表皮生长因子(EGF) (Gibco公司；货号:PHG0314)、成纤维细胞生长因子(bFGF) (Gibco公司；货号:PHG0264)、青霉素和链霉素，得到无菌孵育液，其中，表皮生长因子的终浓度为10ng/ml，成纤维细胞生长因子的终浓度为10ng/ml，青霉素的终浓度为100U/ml，链霉素的终浓度为100U/ml，得到无菌孵育液。
[0031](3)分别将10个患者手术切除的新鲜肝癌组织(离体5分钟内)置入含有步骤(I)中配制的培养液的试管中，放入冰中迅速转移到超净台内，备用；
[0032](4)在无菌条件下将肿瘤组织用步骤(1)中配制的培养液冲洗3遍；清除坏死组织，选择血管丰富的肝癌组织分割成2X2X2mm3的小块，用步骤(2)制备的无菌孵育液在4°C浸润40分钟,备用；
[0033](5)选用B组共30只雄性，3周龄，重量18_22g，非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠(N0D/SCID)。每个患者的肝癌组织取三个小块，分别接种在3只小鼠的前肢肩背部皮下，具体接种方法为:在小鼠腹部备皮，再以碘伏消毒。用20号套管针将总量2 X 2 X 2mm3的肝癌组织于腹部腋中线处刺入，针头走行于皮肤与腹膜间，最终将组织送入前肢肩背部皮下，压迫伤口至无出血；
[0034](6) SPF级环境下常规饲养60天，完成建立肝癌患者来源异种移植瘤模型，并对模型编号为1-10号(每个编号所对应3只小鼠中大于等于I只成瘤，即认定该编号模型建模成功)。
[0035]B组小鼠接种移植后观察小鼠一般活动及营养状态等。每三天用游标卡尺测量移植瘤长(L)短(W)径平均值，按体积公式V = 1/2 (Lff2)计算移植瘤平均体积。移植约4周后肉眼可见局部形成肿瘤结节，第11周肿瘤呈半球形，平均瘤体体积约1.67cm3。解剖小鼠，大体移植瘤组织呈鱼肉样，血供丰富，中央可见坏死，H&E染色后确认病理分型为肝细胞癌，与对应患者病理分型相一致。经过上述步骤，I号模型所对应3只小鼠中有2只成瘤，2号模型有2只成瘤,6号模型有2只成瘤,9号模型有I只成瘤。最终建立4个模型,小鼠的成瘤率为40%。 [0036]实施例3
[0037]—种肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型由前肢肩背部皮下接种有处理过的肝癌组织块的小鼠构成，其建立方法为:
[0038](I)配制培养液:将90体积份的DMEM与10体积份的胎牛血清混合，加入青霉素和链霉素，得到DMEM培养液，其中，青霉素的终浓度为100U/ml，链霉素的终浓度为100U/ml，得到培养液。
[0039](2)配制无菌孵育液:将45体积份的DMEM，5体积份的胎牛血清和50体积份的Matrigel胶(BD公司；货号:356234)混合，加入表皮生长因子(EGF) (Gibco公司；货号:PHG0314)、成纤维细胞生长因子(bFGF) (Gibco公司；货号:PHG0264)、青霉素和链霉素，得到无菌孵育液，其中，表皮生长因子的终浓度为10ng/ml，成纤维细胞生长因子的终浓度为10ng/ml，青霉素的终浓度为100U/ml，链霉素的终浓度为100U/ml，得到无菌孵育液。
[0040](3)分别将10个患者手术切除的新鲜肝癌组织(离体5分钟内)置入含有步骤(I)中配制的培养液的试管中，放入冰中迅速转移到超净台内，备用；
[0041](4)在无菌条件下将肿瘤组织用步骤(1)中配制的培养液冲洗3遍；清除坏死组织，选择血管丰富的肝癌组织分割成2X3X3mm3的小块，用步骤(2)制备的无菌孵育液在4°C浸润60分钟，备用；
[0042](5)选用C组共30只雄性，3周龄，重量18_22g，非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠(N0D/SCID)。每个患者的肝癌组织取三个小块，分别接种在3只小鼠的前肢肩背部皮下，具体接种方法为:在小鼠腹部备皮，再以碘伏消毒。用20号套管针将总量2 X 3 X 3mm3的肝癌组织于腹部腋中线处刺入，针头走行于皮肤与腹膜间，最终将组织送入前肢肩背部皮下，压迫伤口至无出血；
[0043](6) SPF级环境下常规饲养60天，完成建立肝癌患者来源异种移植瘤模型，并对模型编号为1-10号(每个编号所对应3只小鼠中大于等于I只成瘤，即认定该编号模型建模成功)。
[0044]C组小鼠接种移植后观察小鼠一般活动及营养状态等。每三天用游标卡尺测量移植瘤长(L)短(W)径平均值，按体积公式V= 1/2 (LW2)计算移植瘤平均体积。移植约5周后肉眼可见局部形成肿瘤结节，第10周肿瘤呈半球形，平均瘤体体积约1.36cm3。解剖小鼠，大体移植瘤组织呈鱼肉样，血供丰富，中央可见坏死，H&E染色后确认病理分型为肝细胞癌，与对应患者病理分型相一致。经过上述步骤，2号模型所对应3只小鼠中有2只成瘤，5号模型有3只成瘤,7号模型有I只成瘤，10号模型有2只成瘤。最终建立4个模型,小鼠的成瘤率为40%。
[0045]实施例4
[0046]—种肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型由前肢肩背部皮下接种有处理过的肝癌组织块的小鼠构成，其建立方法为:
[0047](I)配制培养液:将90体积份的DMEM与10体积份的胎牛血清混合，加入青霉素和链霉素，得到DMEM培养液，其中，青霉素的终浓度为100U/ml，链霉素的终浓度为100U/ml，得到培养液。
[0048](2)配制无菌孵育液:将45体积份的DMEM，5体积份的胎牛血清和50体积份的Matrigel胶(BD公司；货号:356234)混合，加入表皮生长因子(EGF) (Gibco公司；货号:PHG0314)、成纤维细胞生长因子(bFGF) (Gibco公司；货号:PHG0264)、青霉素和链霉素，得到无菌孵育液，其中，表皮生长因子的终浓度为10ng/ml，成纤维细胞生长因子的终浓度为10ng/ml，青霉素的终浓度为100U/ml，链霉素的终浓度为100U/ml，得到无菌孵育液。
[0049](3)分别将10个患者手术切除的新鲜肝癌组织(离体5分钟内)置入含有步骤
(I)中配制的培养液的试管中，放入冰中迅速转移到超净台内，备用；
[0050](4)在无菌条件下将肿瘤组织用步骤(1)中配制的培养液冲洗3遍；清除坏死组织，选择血管丰富的肝癌组织分割成2X4X4mm3的小块，用步骤(2)制备的无菌孵育液在4°C浸润90分钟，备用；
[0051](5)选用D组共30只雄性，3周龄，重量18_22g，非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠(N0D/SCID)。每个患者的肝癌组织取三个小块，分别接种在3只小鼠的前肢肩背部皮下，具体接种方法为:在小鼠腹部备皮，再以碘伏消毒。用20号套管针将总量2 X 4 X 4mm3的肝癌组织于腹部腋中线处刺入，针头走行于皮肤与腹膜间，最终将组织送入前肢肩背部皮下，压迫伤口至无出血；
[0052](6) SPF级环境下常规饲养60天，完成建立肝癌患者来源异种移植瘤模型，并对模型编号为1-10号(每个编号所对应3只小鼠中大于等于I只成瘤，即认定该编号模型建模成功)。
[0053]D组小鼠接种移植后观察小鼠一般活动及营养状态等。每三天用游标卡尺测量移植瘤长(L)短(W)径平均值，按体积公式V = 1/2 (Lff2)计算移植瘤平均体积。移植约4周后肉眼可见局部形成肿瘤结节，第10周肿瘤呈半球形，平均瘤体体积约1.71cm3。解剖小鼠，大体移植瘤组织呈鱼肉样，血供丰富，中央坏死明显，H&E染色后确认病理分型为肝细胞癌，与对应患者病理分型相一致。经过上述步骤，I号模型所对应3只小鼠中有3只成瘤，3号、4号及5号模型有2只成瘤，10号模型有3只成瘤。最终建立5个模型,小鼠的成瘤率为 50%。
【权利要求】
1.一种肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型，其特征在于，包括前肢肩背部皮下接种有处理过的肝癌组织块的小鼠。
2.如权利要求1所述的肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型，其特征在于，所述的小鼠为非肥胖型糖尿病重症联合免疫缺陷小鼠。
3.权利要求1所述的肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型的建立方法，其特征在于，具体步骤包括:取新鲜肝癌组织，对其进行处理，将处理后的肝癌组织块接种于无瘤小鼠前肢肩背部皮下，常规饲养，得到肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型。
4.如权利要求3所述的肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型的建立方法，其特征在于，所述的新鲜肝癌组织的处理方法包括:将新鲜肝癌组织放入含培养液的试管中移至超净台，备用；取出新鲜肝癌组织，用培养液冲洗2-3次，分割成体积为8-32mm3的肝癌组织块，用无菌孵育液在1-10°C浸没肝癌组织块30-90分钟，得到处理后的肝癌组织块。
5.如权利要求4所述的肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型的建立方法，其特征在于，所述的培养液为DMEM培养液，其制备方法为:将90体积份的DMEM与10体积份的胎牛血清混合，加入青霉素和链霉素，得到DMEM培养液，其中，青霉素的终浓度为50-200U/ml，链霉素的终浓度为50-200U/ml。
6.如权利要求4所述的肝癌患者来源异种移植瘤小鼠模型的建立方法，其特征在于，所述的无菌孵育液的制备方法为:将45体积份的DMEM，5体积份的胎牛血清和50体积份的Matrigel胶混合，加入表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(bFGF)、青霉素和链霉素，得到无菌孵育液，其中，表皮生长因子的终浓度为5-20ng/ml，成纤维细胞生长因子的终浓度为5-20ng/ml，青 霉素的终浓度为50_200U/ml，链霉素的终浓度为50_200U/ml。
【文档编号】A01K67/02GK103828763SQ201410100264
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月18日 优先权日:2014年3月18日
【发明者】樊嘉, 杨欣荣, 胡博, 徐泱, 周俭 申请人:复旦大学附属中山医院