玉米纹枯病抗病相关基因grmzm2g174449及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及植物基因工程【技术领域】，具体涉及一个玉米抗纹枯病相关基因GRMZM2G174449的功能验证和应用，利用强启动子驱动转基因技术，将GRMZM2G174449基因的超量表达载体转入水稻品种中花11。GRMZM2G174449基因表达量显著提高的遗传转化水稻对纹枯病菌的抗性明显增强，证明GRMZM2G174449基因在水稻抗纹枯病中发挥重要作用。
【专利说明】玉米纹枯病抗病相关基因GRMZM2G174449及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物基因工程【技术领域】，提供了一个玉米纹枯病抗病相关基因GRMZM2G174449及其功能验证，发明人发现GRMZM2G174449基因表达量显著提高的遗传转化水稻对纹枯病菌的抗性明显增强。
【背景技术】
[0002]植物在生长的过程中，受到多种病原物的侵害。植物病原物的种类繁多，包括病毒、细菌、真菌和线虫等。病原物侵入植物导致两种结果:(1)病原体成功的在寄主植物内繁殖，引起相关病症；(2)寄主植物产生抗病反应，杀死病原物或阻止其生长。利用抗性基因资源改良植物的抗病性，是预防病害同时又保护环境的根本出路。
[0003]植物的抗病反应是多基因参与调控的复杂过程。参与植物抗病反应的基因分为两类:(I)抗病基因，又称R (resistance)基因和(2)抗病相关基因。
[0004]根据目前人们对抗病基因功能的认识，这类基因的产物主要是作为受体，直接或间接与病原蛋白相互作用，启动植物体内的抗病信号传导路径(Tang等，1996，Science274:2060-2063 ；Baker 等，1997，Science276:726-733 ;Jia 等，2000，EMBOJ.19:4004-4014 ；Dangl 和 Jones, 2001, Nature411:826-833 ;Nimchuk 等,2001, Curr.0pin.Plant Biol.4:288-294)。抗病基因介导的抗病反应强，是很好的基因资源。但由于下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制:(I)抗病基因的资源有限，如目前知道的抵抗水稻重要病害白叶枯病的抗病基因少于30个，抵抗另一水稻重要病害-稻瘟病的抗病基因也只有大约40个；(2)抗病基因具有病原种类和病原生理小种特异性，抗病范围有限；(3)因为病原的快速突变，一个抗病基因的作用往往几年或者十几年后就丧失了。
[0005]抗病相关基因是指除抗病基因外所有参与抗病反应的基因，它们的编码产物参与合成植物体内抗病信号分子、参与`信号传导或参与防卫反应等。这类基因的共同特点是病原诱导后它们的表达量升高或减少，因此人们可以根据病原诱导前后基因的表达量的差异大规模地鉴定植物抗病相关基因(Maleck等，2000，NatureGenet.26 =403-410 ；Schenk 等，2000，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA97:11655-11660 ；Zhou 等，2002, ScienceinChina45:449-467)。目前，人们对抗病相关基因的认识有限。根据已有报道，绝大多数抗病相关基因单独作用时的抗性能力可能比抗病基因小。但根据下述原因，它们是值得大力开发的基因资源:(1)由于绝大多数抗病相关基因的产物不需要直接与病原物相互作用，这类基因是具有持久抗性的基因资源；(2)大多数抗病相关基因参与的抗病反应没有病原特异性，因此它们是具有广谱抗性的基因资源；(3)这类基因的资源丰富。
[0006]植物的抗病反应可以分为两大类。长期以来研究者们对这两大类抗病反应给予了不同名称，如垂直抗性和水平抗性(Van Der Plank等，1968, DiseaseResistance in Plants, Academic, New York)、质量抗性和数量抗性(Ou 等，1975,Phytopathology65:1315-1316)、完全抗性和部分抗性(Parlevliet, 1979, Annu.Rev.Phytopathol.1:203-222)。质量抗性(或垂直抗性或完全抗性)是抗病基因介导的抗病反应。数量抗性(或水平抗性或部分抗性)是由数量性状位点(quantitative trait locus,QTL)调控的抗病反应，它被认为无病原特异性，而且抗性持久(Roumen，1994，Rice BlastDisease, Zeigler 等编著，CAB International, Cambridge, UK, pp.245-265)。目前，人们对植物抗病QTL的基因本质还不清楚。因此，虽然已经鉴定出了大量抗病QTL，如水稻抗白叶枯病 QTL (Li 等，1999，Mol.Gen.Genet.261:58-63),抗稻瘟病 QTL (Wang 等，1994，Geneticsl36:1421-1434 ；Chen 等，2003, Proc.Natl.Acad.Sc1.USAlOO:2544-2549)、抗纹枯病 QTL (Li 等，1995, Theor.Appl.Genet.91:382-388)和抗病毒病 QTL (Albar 等，1998，Theor.Appl.Genet.97:1145-1154)等，但这些抗性QTL没有被很好地用于植物抗病性的改良。
[0007]近年研究发现很多抗病相关基因的染色体位置与抗病QTL相对应，提示这些抗病相关基因可能就是相对应的QTL。抗病相关基因的染色体位置与抗病QTL相对应这一现象在多种植物中都被观察到，包括水稻(Xiong等，2002，中国科学45:518-526 ;Ramalingam 等，2003，Mol.Plant-Microbe Interact.16:14-24 ；ffen 等，2003，Mol.Gen.Genomics269:331-339 ；Chu 等，2004， Mol.Gen.Genomics271:111-120)、小麦(Faris 等，1999，Theor.Appl.Genet.98:219_225)、豆类(Geffroy 等，2000，Mol.Plant-Microbe Interact.13:287-296)和马铃薯(Trognitz 等，2002, Mol.Plant-MicrobeInteract.15:587-597)。这些结果为采用候选基因策略分离、克隆和利用抗病QTL的基因提供了依据。
[0008]玉米和水稻是世界上重要的粮食作物，但纹枯病常常造成其产量和品质的下降，并且玉米和水稻纹枯病菌可以互相侵染。因此，了解纹枯病的发病机制，有助于利用高效途径改良玉米和水稻品种的抗性，控制病害的发生，减少或避免植物病害所带来的损失。分离克隆抗病相关基因是对玉米和水稻抗病机理研究的前提。同时，与抗病基因的应用相比，抗病相关基因的应用能提供植物更为广谱及长效的抗性。通过超量表达抗病相关基因进行玉米和水稻品种的改良，将进一步增强植物的抗病性，拓宽植物的抗谱。这些方面是采用常规植物育种和改良技术所不能达到的。因此如何利用玉米抗病基因的克隆获得抗病植株成为亟待解决的问题之一。
【发明内容】
`[0009]本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一个从玉米中分离克隆出的抗病相关基因GRMZM2G174449完整编码区段的DNA片段，利用其改良玉米和水稻抵御病害的能力，其基因的序列如序列表SEQ ID N0.1所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示。GRMZM2G174449基因表达量显著提高的遗传转化水稻对纹枯病菌的抗性明显增强，可见采用超量表达之后可以赋予植物对由纹枯病菌所引起的病害产生抗病反应，获得高抗病植株。
[0010]发明人首先提供了一个从玉米中分离克隆出的抗病相关基因GRMZM2G174449完整编码区段的DNA片段，其基因的序列如序列表SEQ ID N0.1所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示。
[0011]获得了这一片段之后，将其与合适的载体连接，可以转入植物细胞，产生转基因植物，发现GRMZM2G174449基因表达量显著提高的遗传转化水稻对纹枯病菌的抗性明显增强，证明GRMZM2G174449基因在水稻抗纹枯病中发挥重要作用，因此证实了超量表达该基因后可以赋予植物对由纹枯病菌所引起的病害产生抗病反应，获得高抗病植株。
[0012]该基因片段来源于玉米B73，其通过特殊设计的引物扩增玉米B73cDNA获得，其中所述的引物包括引物1，5^ -ATGGATGCTCATGCCGTG-3'其序列如序列表SEQ ID N0.3所示，引物2，5^ -CTAAGGATTTGATGTGTAAGCC-3'其序列如序列表SEQ ID N0.4所示，之后利用强启动子驱动原理的转基因技术，将GRMZM2G174449基因的超量表达载体转入水稻品种中花
11。GRMZM2G174449基因表达量显著提高的遗传转化水稻对纹枯病菌的抗性明显增强，证明GRMZM2G174449基因在水稻抗纹枯病中可以发挥重要作用，如利用超量表达获得的转基因植株对纹枯病菌的抗性明显增强。
[0013]之所以采用上述的方法，主要是由于将克隆的抗病相关基因转入感病的植物，有助于产生新的抗病植物。特别是可以用遗传转化技术在植物中累加多个抗性基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的连锁基因组序列。而抗病相关基因的克隆是克服传统育种不能植物种间转移抗病相关基因问题的前提。
[0014]综上所述，本发明的发明人在国际上首次验证了一个玉米抗病相关基因的功能，利用其功能最终发现采用超量表达之后可以赋予植物对由纹枯病菌所引起的病害产生抗病反应，获得高抗病植株。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1.接种纹枯病菌YWK62和YWK196后GRMZM2G174449基因的表达检测；
[0016]结果表明，接种纹枯病菌后GRMZM2G174449被诱导表达，在接种8h后表达达到峰值随后逐渐降低；
[0017]图2为GRMZM2G174449超量表达Tl代遗传转化植株接种纹枯病菌YWK1967天后结果不?、灰度图；
[0018]图3为图2中结果的柱状图；
[0019]图中，超量表达Tl代遗传转化植株(pCXUN::GRMZM2G174449-10、11和12)接种纹枯病菌PX0997天后形成的病斑明显比水稻品种中花11 (对照WT)的短；
[0020]中花11为遗传转化受体材料。
【具体实施方式】
[0021]以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术；
[0022]实施例1:GRMZM2G174449基因接种纹枯病菌后的表达模式
[0023]为了检测GRMZM2G174449基因受纹枯病菌诱导表达模式，利用qRT_PCR检测了这个基因接种病原菌后的表达，所用引物为引物3，5' -TTCTGCATCTGCTGCACATG-3 '其序列如序列表SEQ ID N0.5所示，引物4，5 ^ -GGTGCCTACGGTCGATCGT-3'其序列如序列表SEQID N0.6 所示。
[0024]分析结果表明，GRMZM2G174449基因能够受YWK196和YWK62的诱导(如图1所示)，说明其基因参与了玉米对纹枯病的抗性反应。
[0025]实施例2:分离克隆GRMZM2G174449基因
[0026]发明人根据数据库GRMZM2G174449基因序列设计引物(引物1，5 ' -ATGGATGCTCATGCCGTG-3 '其序列如序列表 SEQ ID N0.3 所示，引物 2，5 ' -CTAAGGATTTGATGTGTAAGCC-3 '其序列如序列表SEQ ID N0.4所示)用来获得GRMZM2G174449基因。提取玉米B73RNA并通过反转录获得cDNA，以cDNA作为模板，进行PCR扩增；
[0027]反应程序如下:预变性94°C5min，变性94°C40s，退火54°C40s，延伸72°C 1.5min，反应35个循环，后延伸72°C 7min ；
[0028]结束后，用康为公司的DNA回收试剂盒回收并纯化扩增片段，然后将纯化的DNA片段连接至载体PGEM-T中(Promega公司)，转化E.coli DH5a感受态细胞，挑选阳性克隆提质粒，测序由华大基因完成，获得长度为1526bp的GRMZM2G174449片段，具有序列表SEQ IDN0.1的DNA序列ο
[0029]实施例3:GRMZM2G174449基因的功能验证
[0030]将上述纯化的cDNA片段通过TA克隆连入超量表达载体pCXUN，热激转化E.coliDH5 a感受态细胞后对重组子进行菌落PCR，琼脂糖凝胶电泳检测，重组子中包含有与目的片段大小相同的条带。将鉴定好的重组子扩大培养后提取质粒，质粒测序后与原序列比对，连入的片段为全长cDNA并且没有碱基突变和缺失，证明GRMZM2G174449超量表达载体pCXUN::GRMZM2G174449 构建成功。
[0031]采用农杆菌介导的遗传转化方法(Lin和Zhang,Optimising the tissue cultureconditions for high efficiencytransformation of indica rice,2005, Plant CellRep.23 =540-547)将超量表达载体导入水稻品种中花11。获得的遗传转化植株被命名为pCXUN::GRMZM2G174449。本发明共获得独立转化植株20株，其中阳性植株为13株。分别对Tl代3个转基因株系pCXUN::GRMZM2G174449-10、11、12的10个单株进行玉米纹枯病菌的接种鉴定。结果表明，接种纹枯病菌YWK1967天后，超量表达GRMZM2G174449的转基因植株与野生型相比平均病斑缩短了 3.12cm、3.36cm和3.79cm (表1，和图2所示)，说明GRMZM2G174449参与了水稻对纹枯病的抗性反应，可见GRMZM2G174449在作物改良提高对纹枯病抗性中可以得到广泛的应用。
[0032]表1GRMZM2G174449超量 表达植株接种YWK1967天后的病斑长度
【权利要求】
1.一种玉米抗纹枯病相关基因GRMZM2G174449，其特征在于:其基因序列如SEQ IDN0.1所示。
2.权利要求1所述的玉米抗纹枯病相关基因GRMZM2G174449在作物改良提高对纹枯病抗性中的应用。`
【文档编号】A01H5/00GK103820470SQ201410105513
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月20日 优先权日:2014年3月20日
【发明者】丁新华, 储昭辉, 李宁 申请人:山东农业大学