一种斑点叉尾鮰精子超低温冷冻保存方法
【专利摘要】本发明公开了一种斑点叉尾鮰精子超低温冷冻保存方法。包含以下步骤：将精巢剪碎，加入2～3倍体积4℃预冷的稀释液后混合，过滤，去除块状组织；对斑点叉尾鮰精子质量进行活力及浓度测定，取活力＞60%以上的雄鱼精子入库保存，调整其浓度至2×109个/毫升；向精子悬液中加入1倍精子悬液体积的20%浓度的甲醇溶液，使精子悬液中甲醇的终浓度为10%，轻轻混匀后分装于2mL的冻存管中；采用程序降温仪对分装的精子悬液进行冷冻保存，从4℃程序降温至-80℃（降温速度为5℃/min），保持该温度5min，然后将其转移至液氮中长期保存。采用本方法所保存的斑点叉尾鮰精子复苏后活力较高，可以满足鱼类低温种质库构建的需要。
【专利说明】一种斑点叉尾鮰精子超低温冷冻保存方法
【技术领域】
[0001]本发明属于水产领域，涉及一种斑点叉尾鮰精子超低温冷冻保存方法。
【背景技术】
[0002]斑点叉尾鮰为美国最重要的淡水养殖品种，其产量超过当前美国淡水水产总产量的一半以上。1984年，湖北省水产研究所首次将斑点叉尾鮰从美国引入中国，1987年人工繁殖成功后开始在国内多个地区进行养殖推广实验，显示出了较好的产业化发展前景。由于斑点叉尾鮰是引进种，经过连续多代的人工繁殖，目前我国斑点叉尾鮰养殖群体的生产性状已有所退化，表现出生长速度变慢，体型变短，抗病力下降、饵料系数升高等种质衰退现象。通过超低温冷冻保存斑点叉尾鮰精子，构建斑点叉尾鮰低温种质库，可以将优良亲本的种质资源长期保存下来，该方法对于后续开展斑点叉尾鮰遗传育种等相关研究具有重要的意义。
[0003]国内鱼类精液冷冻保存研究始于20世纪80年代，这些研究主要针对我国的一些常见鱼类。如陈松林等对我国主要鲤科鱼类(青鱼、草鱼、鲢、鳙、鲤、鲫、鳊等)和主要海水鱼类(鲈鱼、大菱鲆、牙鲆和石鲽等)的精液冷冻方法进行了研究，部分鱼类的精液冷冻方法达到了生产应用水平。由于鱼类种类繁多，不同鱼类的内部构造以及生态生理特征差异巨大，不同鱼类的精子外部形态以及内部特征(如pH、渗透压、化学成分等)存在着很大的差别。因此，不同鱼类精子的超低温冷冻方法(主要体现在稀释液、冷冻保护液、冷冻降温程序以及复苏方法等方面)也相应存在着很大的差异。斑点叉尾鮰属于从国外引进的水产养殖品种，其生活环境和生理特征与国内其它常见鱼类有着很大的不同，其精子的外部形态以及内部特征也与我国常见的鲤科鱼类之间存在很多差异。由于斑点叉尾鮰是美国对外严格控制引种的水产品种，通过开展斑点叉尾鮰精子超低温冷冻保存研究，一方面可以将之前我国引进的优良亲本的种质资源长期保存下来，同时也可以为后续鱼类遗传育种和其它相关生物技术研究不间断地提供材料。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供可用于鱼类低温种质库构建用途的一种斑点叉尾鮰精子超低温冷冻保存方法。
[0005]本发明的目的可通过如下技术方案实现:
[0006]一种斑点叉尾鮰精子超低温冷冻保存方法，包含以下步骤:
[0007](I)选择性成熟的雄性斑点叉尾鮰，解剖后取其精巢至预冷的干燥器皿中；
[0008](2)将精巢剪碎，加入4°C预冷的稀释液后混合，过滤，去除块状组织；
[0009](3)取少许精液加去离子水激活20~30s后，于200倍显微镜下观察精子活力，取活力> 60%以上的精子悬液于血球计数板上对其进行计数，调整浓度至1.5 X IO9个/毫升~2X IO9个/毫升；实验发现低于60%活力的精子不能用于冷冻保存一因为活力不足，复苏后不能满足相关应用要求。[0010](4)向精子悬液中加入I倍精子悬液体积的20%浓度甲醇溶液，使精子悬液中的甲醇终浓度为10%，轻轻混匀后分装于2mL的冻存管中；
[0011](5)采用程序降温仪对分装的精子悬液进行冷冻保存，从4°C程序降温至-80°c，保持该温度5min，然后将其转移至液氮中长期保存。
[0012]其中，所述的稀释液配方优选7.5~8.5g/L NaCl, 0.3~0.8g/L KCl, 0.5~3g/L葡萄糖，50~65mg/L KH2PO4, 45~50mg/L Na2HPO4,调pH至7.2 ;稀释液配方进一步优选 8g/L NaCl, 0.4g/L KCl, lg/L 葡萄糖，60mg/L KH2PO4, 47.5mg/L Na2HPO4,调 pH 至 7.2。
[0013]步骤(2)优选用剪刀将精巢剪碎，加入2~3倍体积的4°C预冷的HBSS溶液后混合，采用100目的不锈钢金属筛对其进行过滤，去除块状组织。
[0014]步骤(4)优选向精子悬液中加入与精子悬液等体积20%浓度的甲醇溶液，使精子悬液中甲醇的终浓度为10%，轻轻混匀后分装于2mL的冻存管中。
[0015]步骤(5)中所述的降温速率优选5°C /min。
[0016]有益效果:
[0017]与目前其它常规用于生产目的的鱼类精子冷冻保存研究相比，本方法对入库精液的采集管理更加严格，并从精子活力、浓度等指标入手，对入库精子进行严格的质量控制，采用本方法所保存的斑点叉尾鮰精子复苏后活力较高，可以满足鱼类低温种质库构建的需要，入库精子复苏后可以满足后续相关科研要求。
[0018]说明书附图
[0019]图1斑点叉尾鮰精子超低温冷冻保存复苏后活力变化情况
【具体实施方式】
[0020]实施例1
[0021](1)详细记录入库斑点叉尾鮰雄鱼的来源以及体重、体长等可量可数性状，并拍照存档；
[0022](2)擦干斑点叉尾鮰体表水分，解剖后取其精巢至预冷的干燥器皿中；
[0023](3)用剪刀将精巢剪碎，加入2倍体积的稀释液(4°C预冷)后混合，采用100目的不锈钢金属筛对其进行过滤，去除块状组织；稀释液配方为8g/L NaCl, 0.4g/LKCl, lg/L葡萄糖，60mg/L KH2PO4, 47.5mg/L Na2HPO4,调 pH 至 7.2 ;
[0024](4)取精子加去离子水激活20~30s后，于200倍显微镜下观察精子活力，取活力> 60%以上的精子悬液于血球计数板上对其进行计数，调整浓度至约2 X IO9个/毫升；
[0025](5)向精子悬液中加入等体积20%浓度的甲醇溶液(使精子悬液中甲醇的终浓度为10%)，轻轻混匀后分装于2mL的冻存管中；
[0026](6)采用程序降温仪对分装的精子悬液进行冷冻保存，从4°C程序降温至-80°C(降温速率为5°C /min)后保持温度5min，然后将其转移至液氮中长期保存；
[0027](7)复苏方法为:将斑点叉尾鮰冷冻精液从液氮中小心取出，置于40°C水浴中20s进行快速溶解，对其进行活力检测。
[0028]对超低温冷冻保存的斑点叉尾鮰精子进行解冻复苏后活力监测，其具体结果见图1。与采用现有其它鱼类(以鲤鱼为例)精子冷冻保存方法(陈松林.鱼类精子和胚胎冷冻保存理论与技术[M].北京，中国农业出版社，2007，122 -126)相比，采用本专利所述方法冷冻保存的斑点叉尾 鮰精子复苏后活力较高(58%)，冷冻保存一年后复苏活力也无明显下降。
【权利要求】
1.一种斑点叉尾鮰精子超低温冷冻保存方法，其特征在于包含以下步骤: (1)选择性成熟的雄性斑点叉尾鮰，解剖后取其精巢至预冷的干燥器皿中； (2)将精巢剪碎，加入4°C预冷的稀释液后 混合，过滤，去除块状组织； (3)取少许精子加去离子水激活20~30s后，于200倍显微镜下观察精子活力；取活力> 60%以上的精子悬液于血球计数板上对其进行计数，调整精子悬液浓度至1.5 X IO9个/毫升~2 X IO9个/毫升； (4)向精子悬液中加入I倍精子悬液体积的20%浓度甲醇溶液，使精子悬液中的甲醇终浓度为10%，轻轻混匀后分装于2mL的冻存管中； (5)采用程序降温仪对分装的精子悬液进行冷冻保存，从4°C程序降温至-80°C，保持该温度5min，然后将其转移至液氮中长期保存。
2.根据权利要求1所述的斑点叉尾鮰精子超低温冷冻保存方法，其特征在于所述的稀释液配方为 7.5 ~8.5g/L NaCl, 0.3 ~0.8g/L KCl, 0.5 ~3g/L 葡萄糖，50 ~65mg/LKH2PO4, 45 ~50mg/L Na2HPO4,调 pH 至 7.2。
3.根据权利要求2所述的斑点叉尾鮰精子超低温冷冻保存方法，其特征在于所述的稀释液配方为 8g/L NaCl, 0.4g/L KCl, lg/L 葡萄糖，60mg/L KH2PO4, 47.5mg/L Na2HPO4,调 pH至 7.2。
4.根据权利要求1所述的斑点叉尾鮰精子超低温冷冻保存方法，其特征在于步骤(2)用剪刀将精巢剪碎，加入2~3倍体积的4°C预冷的稀释液后混合，采用100目的不锈钢金属筛对其进行过滤，去除块状组织，并调整其浓度至2 X IO9个/毫升。
5.根据权利要求1所述的斑点叉尾鮰精子超低温冷冻保存方法，其特征在于步骤(4)向精子悬液中加入与精子悬液等体积20%浓度的甲醇溶液，使精子悬液中甲醇的终浓度为10%，轻轻混匀后分装于2mL的冻存管中。
6.根据权利要求1所述的斑点叉尾鮰精子超低温冷冻保存方法，其特征在于步骤(5)中所述的降温速率为5°C /min。
【文档编号】A01N1/02GK103891712SQ201410129741
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月1日 优先权日:2014年4月1日
【发明者】许志强, 赵沐子, 丁淑燕, 李跃华, 潘建林 申请人:江苏省淡水水产研究所