Dse菌株24l-4及其在铁皮石斛生产上的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了DSE菌株24L-4，属于生物【技术领域】，具体涉及能明显促进铁皮石斛生长的DSE菌株及其在铁皮石斛生产上的应用。该真菌株能显著促进铁皮石斛的生长，利用该菌接种铁皮石斛组培苗45d后生物量比对照增加了19.4%，接种铁皮石斛盆栽苗180d后植株生物量比空白对照增加了18.5%，株高增加了15.3%，茎径增加了6.8%，芽数增加了22.1%。本发明的有益效果是：该菌株可应用于铁皮石斛专用微生物菌剂的生产和生物有机肥的开发，对铁皮石斛的规模化生产、保护生态环境具有重要意义，具有广阔的应用前景。
【专利说明】DSE菌株24L-4及其在铁皮石斛生产上的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及能促进铁皮石斛生长的DSE菌株24L-4及其在铁皮石斛生产上的应用。
【背景技术】
[0002]深色有隔内生真菌(Dark septate endophyte, DSE)是植物共生真菌的典型代表之一，其一般特征是菌丝颜色较深、具有明显横隔，广泛存在于健康植物根的表皮、表层甚至维管束组织的细胞内或细胞间隙，能够在植物细胞内或细胞间隙形成“微菌核”等结构特征。刘茂军等(深色有隔内生真菌(DSE)研究进展[J],菌物学报，2009，28 (6) =888-894)研究报道DSE具有促进宿主矿质营养吸收、促进宿主对有机养分的吸收、提高宿主抗逆性、提高宿主的抗病能力等生态学功能，可望促进作物生长和提高抗逆能力，减少化学农药肥料的使用，修复和 降低环境污染。
[0003]铁皮石斛是一种珍稀名贵的药用和观赏植物，由于铁皮石斛的生长除了对气候和上壤环境要求较高外，在自然界中其生长还需要共生真菌的参与，人工栽培往往成活率较低，生长缓慢。通过筛选能显著促进铁皮石斛生长的DSE真菌，建立“铁皮石斛-DSE”高效共生体系，提高铁皮石斛的成活率和产量，可用于铁皮石斛专用菌肥的开发利用。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种DSE菌株24L-4及其在铁皮石斛生产上的应用，能促进铁皮石斛的生长。
[0005]本发明所述的DSE菌株24L-4为Devriesia sp.，该菌株已于2014年4月28日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，其地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，其保藏编号为=CGMCC N0.9098。
[0006]该菌株从茶花叶部组织分离获得，通过观察其在宿主植物的定殖特征确定其为DSE菌株，菌株命名为24L-4。经菌株形态学和18S rDNA序列分析，该菌株鉴定为德弗霉菌属 Devriesia sp.真菌。
[0007]所述DSE真菌菌株24L-4的提纯步骤包括:
步骤A:取茶花叶片，清洗杀菌后吸干表面水分后置于玉米粉培养基培养至菌落长出；步骤B:将叶部组织置于培养皿平板上，于生化培养箱中培养，直至叶片组织周围长出菌丝体，挑取菌丝置于CMMY培养基，得到纯化菌株。
[0008]优选的，所述玉米粉培养基包括:玉米粉6-10g/L，琼脂粉7-8g/L。
[0009]优选的，CMMY培养基包括:麦芽提取物8_12g/L，酵母浸膏1.5_3g/L，玉米粉琼脂7-9g/L，琼脂 7-9g/L。
[0010]所述DSE真菌菌株在促进铁皮石斛组培苗生长上的应用，包括以下步骤:
步骤A,:将供试菌株活化后接种于燕麦培养基中，待菌落长大后备用；
步骤B':选择长势一致的无菌铁皮石斛组培苗移栽至培养皿平板的菌落上，将培养皿放入培养瓶中培养，培养结束后将根部培养基洗净后干燥后称量干重。
[0011]优选的，所述步骤B'中，培养的条件为:温度为25 °C，光照强度为160-200 μ molnT2sA光照时间为15_18h，培养时间为40_50d。
[0012]优选的，所述燕麦培养基包括:燕麦粉10g/L,琼脂18g/L，MgSO4.7H201g/L,KH2PO4L 5g/L, NaN03lg/L。
[0013]所述DSE菌株在促进铁皮石斛盆栽苗生长上的应用，包括以下步骤:
步骤A":选取长势一致的铁皮石斛苗，移栽至培养杯中，移栽成活后待用；
步骤B":在马铃薯葡萄糖液体培养基TOB中接入菌丝块，振荡培养结束后将培养物打碎配置成菌液，灌根铁皮石斛苗。
[0014]优选的，所述步骤A"中，所述培养基质为水草。
[0015]优选的，所述步骤B"中马铃薯葡萄糖液体培养基包括:马铃薯200g，葡萄糖20g，水 1000mL。
[0016]优选的，所述 步骤B"中灌根条件为每杯铁皮石斛灌根25_35mL菌液，每隔10_15d灌根一次，共灌根2-3次。
[0017]本发明的有益效果是:该菌株可应用于铁皮石斛专用微生物菌剂和生物有机肥的开发，对促进铁皮石斛的规模化生产和保护生态环境具有重要意义，具有广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1是本发明中菌株24L-4的菌落形态。
[0019]图2是本发明中铁皮石斛组培苗接种菌株24L-4培育90天后长势对照。
[0020]图3是本发明中在铁皮石斛根部观察到菌株24L-4的DSE微菌核定殖特征。
【具体实施方式】
[0021]下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
[0022]实施例1 本发明菌株的分离。
[0023]取茶花叶片，用自来水冲洗表面的灰层及附着物，凉干表面水份，将叶片剪成边长约为0.5-1.2cm的正方片，在超净工作台上先用70%酒精浸10_20s，再用I %次氯酸钠浸l-2min,无菌水洗3-5次，用灭菌滤纸吸干表面水分后置于玉米粉培养基(玉米粉6_10g/L，琼脂粉7-8g/L)上培养。90mm的培养皿接4_8片组织片，于22_28°C生化培养箱中培养，直至叶片组织周围长出菌丝体，挑取菌丝置于CMMY培养基(麦芽提取物8-12g/L，酵母浸膏
1.5-3g/L，玉米粉琼脂7-9g/L，琼脂7-9g/L)上，获得纯化菌株。
[0024]实施例2
本发明菌株的形态学特征。
[0025]将菌株接种于CMMY培养基上，23°C培养3周后观察其形态学特征，结果见图1。
[0026]实施例3
本发明菌株的18S rDNA序列分析。
[0027]菌株培养用马铃薯葡萄糖液体培养基TOB，在28°C、120r/min的摇床上振荡培养10-15d后，过滤收集菌丝。菌丝体总DNA采用Saghai et al.的CTAB法提取。18S rDNA区域PCR扩增分别采用White et al.的通用引物NS1/NS4进行扩增。PCR反应体系为:TIANgel—管便捷式 MasterMix(成分:10mM Tris-HCl ρΗ8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2,250uM dNTPeach、0.05U Polymerase/μ L、ddH20) 9 μ L，20umol/L 正反引物各 lyL，模板DNAl μ L，用超纯水定容至25 μ L。PCR反应参数:94°C预变性5min，94°C变性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸lmin，35个循环，最后72°C延伸lOmin。PCR扩增产物测序由上海生工生物工程技术有限公司完成，测序结果在GenBank登录和比对分析。
[0028]菌株24L-4的18S rDNA部分区域的核苷酸序列:
【权利要求】
1.DSE 菌株 24L-4，其保藏编号为:CGMCC N0.9098。
2.权利要求1所述DSE菌株在促进铁皮石斛组培苗生长上的应用。
3.权利要求1所述DSE菌株在促进铁皮石斛盆栽苗生长上的应用。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤: 步骤A,:将供试菌株活化后接种于燕麦培养基中，待菌落长大后备用； 步骤B':选择长势一致的无菌铁皮石斛组培苗移栽至培养皿平板的菌落上，将培养皿放入培养瓶中培养，培养结束后将根部培养基洗净后干燥后称量干重。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤Ai中燕麦培养基包括:燕麦粉10g/L，琼脂 18 g/L，MgSO4.7H20 I g/L，KH2PO4 1.5 g/L，NaNO3 I g/L。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤B'中培养条件为:温度为25°C，光照强度为160-200ymol nT2S-2，光照时间为15_18h/d，培养时间为40_50d。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤: 步骤A":选取长势一致的铁皮石斛苗，移栽至培养杯中，移栽定殖后浇菌液； 步骤B":在马铃薯葡萄糖液体培养基TOB中接入菌丝块，振荡培养结束后将培养物打碎配置成菌液，灌根铁皮石斛苗。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤A"中，所述培养基质为水草。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤B"中，马铃薯葡萄糖液体培养基包括:马铃薯200 g，葡萄糖20 g，水1000 mL。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤B"中灌根条件为每杯铁皮石斛灌根25-35mL菌液，每隔10_15d灌根一次，共灌根2_3次。
【文档编号】A01H4/00GK103981102SQ201410220965
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月23日 优先权日:2014年5月23日
【发明者】谢玲, 覃丽萍, 张雯龙, 秦碧霞, 蓝桃菊 申请人:广西壮族自治区农业科学院微生物研究所