一种桑树子叶不定芽的诱导方法
【专利摘要】本发明公开了一种桑树子叶不定芽的诱导方法，属于植物基因工程领域。具体是以桑树种子内胚中子叶为外植体，流水冲洗浸泡的种子经表面杀菌后分离得到子叶，接在诱导培养基中直接诱导产生不定芽，不定芽长至1cm移至生根培养基中，形成完整植株。采用本发明方法经不定芽产生的再生植株时间周期短，结果稳定，重复性好，主要用于桑树转基因，是桑树转基因育种的前提和基础。
【专利说明】一种桑树子叶不定芽的诱导方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种子叶不定芽直接诱导方法，为桑树转基因的受体部分，属于植物基因工程领域。
【背景技术】
[0002]在众多的植物再生体系中，通过诱导叶片不定芽、体细胞胚和原生质体再生的方法属单细胞起源，适合用于植物转基因的受体系统。在众多成熟的转基因技术中，花生、杨树等植物大多采用侵染叶片产生不定芽再生植株的方式，棉花、水稻等作物大多采用侵染下胚轴诱导胚性愈伤经过体胚方式再生植株或先诱导胚性愈伤，再侵染胚性愈伤，通过体胚萌发方式再生植株。原生质体系统作为转基因的受体系统用得较少，主要原因是这一方法不经济，成本高，难度也大。相比体细胞胚体系和不定芽体系，不定芽再生体系有明显有优势，如果同一种植物同时能运用体细胞胚方式和不定芽再生方式进行转基因，一般都会采用不定芽再生的方式。直接诱导不定芽时间周期短，一般诱导3个星期左右，不定芽开始发生，再发育4周左右可以移瓶生根，整个周期在3个月左右；而采用诱导体细胞胚的方式，步骤繁多，时间长，从浸染开始到获得植株需要9个月至I年时间。采用不定芽再生的方式，畸形苗少，再生苗长势旺，而采用体细胞胚的方式有较多畸形苗。
[0003]王勇等学者公开了桑子叶不定芽的诱导与再生植株，用桑子叶为受体开展桑树基因工程研究作准备，但是其细胞分裂素与植物生长素浓度比较低，并且是采取一次诱导的方法，不考虑不定芽 发生和发育对激素浓度要求的不同，所以子叶不定芽诱导率很低；此外，该方法缺乏组织学和解剖学的方法证明所诱导的芽为不定芽还是胚芽来源。
【发明内容】
[0004]解决的技术问题:针对现有技术的不足，本发明提供了一种桑树子叶不定芽的诱导方法，根据不定芽发生和发育对激素浓度要求的不同进行递度诱导，在高浓度细胞分裂素(6-BA)下诱导不定芽发生的启动，在不定芽发生启动后转入较低浓度细胞分裂素(6-BA)中促进不定芽发育，方法稳定，诱导率高。
[0005]技术方案:本发明提供的桑树子叶不定芽的诱导方法，包括以下步骤:
(I)种子吸胀与培养
将桑树种子清水浸泡12h后，用流水冲洗1-2h，其次用7%次氯酸钠溶液或0.1%氯化汞溶液灭菌15分钟，然后用灭菌蒸馏水冲洗3-4次。
[0006](2)子叶分离
将吸涨灭菌好的桑树种子置于解剖镜下，用尖嘴镊撕去种皮，将两片子叶分开，用手术刀将子叶从基部切除。
[0007](3)不定芽诱导
将分离得到子叶接入不定芽诱导培养基I上，置于光照培养箱内26°C，光周期16L/8D诱导培养，培养3周后转入不定芽诱导培养基2中。[0008]所述不定芽诱导培养基I为:MS培养基+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+K8P维生素+10%椰子汁+3mg/L6-苄氨基腺嘌呤(6-BA) +0.lmg/L萘乙酸(NAA)，PH值为5.8-6.0。
[0009]所述不定芽诱导培养基2为:MS培养基+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+K8P维生素+10%椰子汁+2mg/L6-苄氨基腺嘌呤(6-BA) +0.lmg/L萘乙酸(NAA)，PH值为5.8-6.0。
[0010](4)不定芽生长
不定芽形成后，当不定芽形成3-4片叶片时移入桑树组织培养继代培养基中，继代培养基为:MS培养基+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+B族维生素+0.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)+0.lmg/L 萘乙酸(NAA)，PH 值为 5.8-6.0。
[0011](5)不定芽生根
当不定芽长至I厘米时，移入生根培养基形成完整植株，生根培养基为:1/2MS培养基+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+B族维生素+0.lmg/L吲哚丁酸(IBA)，PH值为5.8-6.0。
[0012]有益效果:本发明为桑树转基因提供了一个有效的受体再生系统，时间周期短，不定芽诱导效果好，结果稳定，重复效果好，为大规模转基因桑树创造了可能，实现桑树种质通过转基因手段进行种质创新与储备。 【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为子叶分离图；图2为诱导子叶产生的不定芽；
图3为桑树子叶不定芽扫描电镜照片；图4为桑树子叶不定芽发生组织切片。
【具体实施方式】
[0014]下面通过实施例的方式对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明范围。
[0015]实施例1
(I)种子吸胀与培养
取200粒一代杂交桑丰驰桑种子,放入烧杯内加清水浸泡12小时,然后将烧杯放在水龙头下流水冲洗2小时；之后将烧杯中水倒干，加入75%酒精晃动10分钟，倒干酒精后清水冲洗2次；加7%次氯酸钠溶液表面杀菌15分钟，其间不断晃动，移入超净工作台内，用灭菌蒸溜水冲洗3次。
[0016](2)子叶分离
将表面杀菌处理后的种子置于超净工作台内解剖镜上，用手术刀在种脐处侧面切开种皮缺口，用镊子轻压种子种皮缺口对侧，将完整胚轻轻挤出；用解剖镊将胚中两片子叶轻轻分开，用手术刀将子叶从基部切除。
[0017](3)不定芽诱导
将分离得到子叶接种在不定芽诱导培养基I中(MS培养基+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+K8P维生素+10%椰子汁+3mg/L6-苄氨基腺嘌呤(6-BA) +0.lmg/L萘乙酸(NAA)，PH值
6.0)，置于光照培养箱内26°C，光周期16L/8D诱导培养，培养3周移入不定芽诱导培养基2中(MS培养基+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+K8P维生素+10%椰子汁+2mg/L6_苄氨基腺嘌呤(6-BA) +0.lmg/L 萘乙酸(NAA)，PH 值为 6.0)。
[0018](4)不定芽生长不定芽发育至3-4片叶片时将不定芽移出，剪去下部叶片，移入不定芽继代培养基(MS培养基+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+B族维生素+0.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤(6_BA)+0.lmg/L萘乙酸(NAA)，PH值为6.0)。
[0019](5)不定芽生根
待不定芽长至I厘米，将上部茎段剪下移入生根培养基(1/2MS培养基+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+B族维生素+0.lmg/L吲哚丁酸(IBA)，PH值为6.0);不定芽生根形成完整植株后将植株取出，洗去根部琼脂，移入室内栽培基质中生长炼苗。
[0020]图1为实施例1不定芽分离，从图1中可以看出，分离得到的子叶没有附带任何胚芽组织；图2为诱导子叶产生的不定芽，从图2可以看出是一团芽，没有一个芽占据优势起主芽作用；图3为不定芽扫描电镜图，从图3可以看出在细微结构上，不定芽相互叠在一起，没有主芽侧芽之分；图4为不定芽组织切片，从图4可以看出不定芽发生时没有任何维管组织与之相连。
[0021]表1实施例1子叶不定芽诱导情况(诱导培养后I个月调查)
【权利要求】
1.一种桑树子叶不定芽的诱导方法，其特征在于包括以下步骤: (1)将桑树种子清水浸泡12h后,用流水冲洗l_2h，再用7%次氯酸钠溶液或0.1%氯化汞溶液灭菌15分钟，然后用灭菌蒸馏水冲洗3-4次； (2)在解剖镜下无菌环境中剥去种皮，分离子叶； (3)将分离得到子叶接入不定芽诱导培养基I上，置于光照培养箱内26°C，光周期16L/8D诱导培养，培养3周后转入不定芽诱导培养基2中； (4)当不定芽形成3-4片叶片时移入桑树组织培养继代培养基中； (5)当不定芽长至I厘米时，移入生根培养基形成完整植株。
2.根据权利要求1所述的桑树子叶不定芽的诱导方法，其特征在于所述不定芽诱导培养基I为:MS培养基+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+K8P维生素+10%椰子汁+3mg/L6_苄氨基腺嘌呤(6-BA) +0.lmg/L 萘乙酸(NAA)，PH 值为 5.8-6.0。
3.根据权利要求1所述的桑树子叶不定芽的诱导方法，其特征在于所述不定芽诱导培养基2为:MS培养基+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+K8P维生素+10%椰子汁+2mg/L6_苄氨基腺嘌呤(6-BA) +0.lmg/L 萘乙酸(NAA)，PH 值为 5.8-6.0。
4.根据权利要求1所述的桑树子叶不定芽的诱导方法，其特征在于所述继代培养基为:MS培养基+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+B族维生素+0.5mg/L6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)+0.lmg/L 萘乙酸(NAA) ，PH 值为 5.8-6.0。
5.根据权利要求1所述的桑树子叶不定芽的诱导方法，其特征在于所述生根培养基为:1/2MS培养基+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉+B族维生素+0.lmg/L吲哚丁酸(IBA)，PH值为 5.8-6.0。
【文档编号】A01H4/00GK104026010SQ201410243674
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月4日 优先权日:2014年6月4日
【发明者】潘刚, 邸炳荣, 胡颖健, 孙银苹, 雷朋 申请人:江苏科技大学